"Freeze-Cracking", ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. "Freeze-Cracking" ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.
Einleitung
Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine spezifisch erkennen, ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor u....
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Protokoll
HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert.
1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger
Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünschten Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Herstellung, relativ Haftung und nicht-spezifische Bindung des Antikörpers. Details der Objektträgerpräparations Al....
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Ergebnisse
Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufiges Probl.......
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Diskussion
Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Objektträg.......
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Offenlegungen
Der Autor erklärt, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Die Finanzierung wurde von NSF CCLI # 0633618 und der Ohio University zur Verfügung gestellt. Einige Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center geliefert. Graduate Student Reetobrata Basu erscheint in dem Video.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Poly-L-Lysin-Objektträger (Marke ESCO) | Fisher | 12-545-78 | Objektträger der Marke Sigma eignen sich auch für |
| Poly-L-Lysinhydrobromid | Sigma | P1524 | WICHTIG: Marke und hohes Molekulargewicht von Polylysin kritischer |
| einfacher mattierter Rand Objektträger | Fisher | 48312-002 | Andere Marken sind geeignet |
| Natriumazid | Sigma | S2002-25G | TOXIC, tragen Sie Handschuhe und Maske, während Sie das Pulver abwiegen, um 10% Vorrat zu erhalten. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie Stammlösung |
| Coplin Färbeglas | VWR | 47751-792 | Andere Marken sind geeignet |
| 5-Objektträger-Versandtasche | Elektronenmikroskopie Wissenschaft | 71549-01 | Eine von vielen verschiedenen Marken von kleinen Objektträgerhaltern, geeignet zum Färben von |
| Paraformaldehyd | VWR | MK262159 | WICHTIG: Normale Formalinlösungen (37% Formaldehyd) sind NICHT geeignet. Entweder 1) Crysatlaline paraformaldehyd in Phosphatpuffer auflösen und in kleinen Aliquoten gefroren lagern. Oder 2) Kaufen Sie Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Aliquoten. GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser. |
| Glutaraldehydlösung, 25% in Wasser | Sigma | G 5882 | WICHTIG: Glutaraldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Ampullen kaufen; GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Andere Marken sind geeignet |
| Rinderserum Albumin | Fisher | ICN820451 | Andere Marken sind geeignet |
| Eselserum, lyophilisiert | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Andere Marken sind geeignet |
| Cy3 Donkey Anti-Maus IgG Multi-Labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | Dieses Unternehmen wird für hochwertige Multi-Label-Antikörper (affinitätsarmiert) empfohlen. Wählen Sie den geeigneten Farbstoff und das geeignete Antigen (Tier, das zur Aufzucht des Primärantikörpers verwendet wurde). |
| n-Propylgallat | Fisher | ICN10274750 | Andere Marken eignen sich DAPI |
| , 4',6'-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid | Sigma | D 9542 | TOXIC. Tragen Sie Handschuhe und dosieren Sie in kleine Aliquots und feeze, um die Exposition zu minimieren |
| Whatman #1 Filter mit 15 cm Durchmesser | Fisher | 09805G | |
| Deckglas #1 1/2 Rechteck 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 Dicke ist optisch am besten |
| Objektträgermappe | VWR | 48429-092 | Andere Marken sind geeignet |
Referenzen
- Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.
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Nachdrucke und Genehmigungen
