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Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn von Nagetieren durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV), vor allem die abgeschwächten Stamm PRV-Bartha erstmals 1961 beschrieben, verwendet 12. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Identifizierung der Motor kortikalen Repräsentation von spezifischen Muskeln oder Muskelgruppen unter Verwendung eines rekombinanten Pseudorabies-Virus-Stamm (PRV152) die verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP) Reporter-Gen 2 zum Ausdruck. Das beschriebene Verfahren nutzt das Verhalten der neurotropen Viren, die infektiösen Nachkommen, dass grenz Synapsen zu anderen Neuronen innerhalb einer Funktionsschaltung 3,4,13 infizieren zu produzieren. PRV152, die isogen mit PRV-Bartha ist, kreuzt nur Synapsen retrograd durch die hierarchische Reihenfolge der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 3,5 </ sup>. Durch präzises Steuern der peripheren Stelle der Infektion ist es möglich, den Eintritt des Virus in das Gehirn durch eine spezifische Untergruppe von Motoneuronen zu begrenzen. Da das Virus infiziert Ketten sequentiell verbundenen Neuronen, wird das sich ergebende Muster eGFP Signal gesamten Gehirn dann lösen das Netzwerk von Neuronen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind.
Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von Virus für neuronale Verfolgung ist die Amplifikation des Reporter-Protein (eGFP in diesem Fall) in infizierten Zellen. Diese Signalverstärkung bietet ein Maß an Sensibilität, die Detektion auch spärlich Projektionen ermöglicht. Zum Beispiel wurde eine spärliche Projektion aus vibrissa motorischen Cortex zu den Gesichtsmotoneuronen Steuern der Whisker in Ratten unter Verwendung viral exprimierten green fluorescent protein 14 gefunden; früheren Studien konnte diesen Vorsprung mit klassischen Tracern ohne Reporter-Gen-Amplifikation 11,15 zu finden. leiderViele virale Verfolgung Vektoren, wie das in der zitierten Studie verwendeten nicht kreuzen Synapsen, wodurch ihre Verwendung für die Rückverfolgung Mehrsynapsenschaltungen einschränkend.
Während der Präsentation deutliche Vorteile für die Identifizierung der Netzwerk von Zellen, die an einem Motorstromkreis, der verteilten Natur transsynaptische Tracing mit PRV-152 macht die Interpretation von spezifischen Verbindungen innerhalb der Schaltung schwierig. Daher präsentieren wir ein einfaches Verfahren für die Validierung von spezifischen Verbindungen innerhalb Schaltungen identifiziert mit PRV-152 durch Doppelklick Etikettierung unter Verwendung von biotinylierten Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Der kombinierte Einsatz von BDA und CTB ist ein etablierter Ansatz zur Verfolgung Verbindungen zwischen bestimmten Gruppen von Neuronen 6-8,11. Wenn sie zusammen verwendet werden, können diese beiden Tracer in demselben Abschnitt unter Verwendung eines Zweifarben DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) Prozedur 16 visualisiert werden. Hochmolekulare BDA (BDA10kDa) wurde für dieses Protokoll ausgewählt, weil es yields detaillierte Kennzeichnung von neuronalen Prozessen 6,7,9. Zusätzliche Vorteile BDA10kDa gehören die folgenden: Es ist bevorzugt in der anterograde Richtung 6-8 transportiert wird; sie kann durch iontophoretische oder Druckeinspritzung 6-8 geliefert werden; sie kann durch einen einfachen Avidin-biotinyliertem HRP (ABC) Verfahren 17 dargestellt werden; und es kann durch Licht- oder Elektronenmikroskopie 6,7,18 abgebildet werden. Immunchemischen Nachweis von CTb mit Peroxidase und DAB wurde für retrograde Markierung von Motoneuronen gewählt, weil es effektiv bei enthüllt zelluläre Prozesse einschließlich distalen Dendriten 10,19 ist. Vor kurzem haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Stimmkraftwegs in Mäusen zu identifizieren und ein Sparse-Verbindung vom primären Motorkortex den Kehlkopfmotorneurone, was bisher angenommen wurde 20 abwesend sein offenbaren.