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Methodenartikel

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

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DOI:

10.3791/50716

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14. November 2013

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1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Funktion der Erwachsenen-geboren Säugetierneuronen bleibt ein aktives Forschungsgebiet. Ionisierende Strahlung hemmt die Entstehung neuer Nervenzellen. Mit Hilfe von Computer-Tomographie-geführte Brenn Bestrahlung (CFIR) können dreidimensionale anatomische Ausrichtung auf bestimmte neuronale Vorläuferpopulationen nun verwendet, um die funktionelle Rolle der adulten Neurogenese zu beurteilen.

Zusammenfassung

Die funktionelle Charakterisierung der Erwachsenen geborene Neuronen vor eine große Herausforderung. Ansätze über invasive virale Lieferung oder transgenen Tieren zu adulten Neurogenese hemmen, haben das Potenzial, die verwechselt Interpretation der Ergebnisse aus diesen Studien erschweren. Neue radiologischen Werkzeuge entstehen jedoch, dass ein nicht-invasiv zu untersuchen, die Funktion von ausgewählten Gruppen von Erwachsenen geboren Neuronen durch genaue und präzise anatomische Ausrichtung in kleine Tiere zu ermöglichen. Brenn ionisierende Strahlung hemmt die Entstehung und Differenzierung von neuen Nervenzellen und ermöglicht Targeting von spezifischen neuronalen Vorläufer Regionen. Um das Potenzial funktionelle Rolle, dass erwachsene Neurogenese Hypothalamus spielt bei der Regulierung der physiologischen Prozesse zu beleuchten, haben wir eine nicht-invasive Brennbestrahlungstechnik, um die Geburt von Erwachsenen geboren Neuronen im Hypothalamus Median Eminenz selektiv hemmen. Wir beschreiben ein Verfahren zur C omputer-Tomographie-geführtenf ocal ir-Strahlung (CFIR) Lieferung an präzise und genaue anatomische Targeting in kleine Tiere zu ermöglichen. CFIR verwendet dreidimensionale Volumenbildführung für die Lokalisierung und die Ausrichtung der Strahlendosis, minimiert die Strahlenbelastung für nontargeted Hirnregionen und ermöglicht konforme Dosisverteilung mit scharfen Strahl Grenzen. Dieses Protokoll ermöglicht es, Fragen in Bezug auf die Funktion der Erwachsenen-Neuronen geboren fragen, sondern eröffnet auch Bereiche, Fragen in den Bereichen Strahlenbiologie, Tumorbiologie und Immunologie. Diese Werkzeuge werden radiologische Übersetzung von Entdeckungen an der Bank auf dem Bett zu erleichtern.

Einleitung

Jüngste Entdeckungen haben gezeigt, dass das Gehirn erwachsener Säuger kann einen bemerkenswerten Grad an Plastizität zu unterziehen. Adult-geboren Neuronen im Erwachsenenalter in spezialisierten Nischen des Säugetiergehirns 1 erzeugt. Was ist die Funktion dieser Erwachsenen-Neuronen geboren? Und mehr noch, sie eine Rolle in der Physiologie und Verhalten zu spielen? Studien zu diesem Thema haben traditionell am Subventrikularzone der lateralen Ventrikel und der Subgranularzone des Hippocampus konzentriert, jedoch haben neuere Studien der Neurogenese in anderen Hirnregionen wie den Hypothalamus Säugetier 2 gekennzeichnet. Neurogenese in der postnatalen und adulten Hypothalamus 2-10 berichtet worden, und die Funktion dieser Neugeborenen hypothalamischer Neurone bleibt ein aktives Forschungsgebiet.

Die funktionelle Charakterisierung der Erwachsenen geborene Neuronen bleibt eine große Herausforderung für die Neurowissenschaften im Allgemeinen. Die selektive Hemmung der Spezifikationific neuralen Vorläuferpopulationen bleibt durch den Mangel an verfügbaren molekularen Marker, die spezifisch für einzelne neuronale Vorläuferpopulationen 11 begrenzt sind. So bleibt selektive Löschung von Erwachsenen geboren Neuronen aus diesen neuralen Vorläuferzellen über genetische Targeting schwierig. Ebenso virale Lieferung an Erwachsene geboren Neuronen gezielt leidet Potenzial Störvariablen wie die Einführung von Verletzungen und Entzündungen in die Umwelt 12.

Neue radiologischen Werkzeuge entstehen jedoch, dass man diese verwechselt zu umgehen und untersuchen diese Fragen durch genaue und präzise anatomische Ausrichtung in kleine Tiere zu ermöglichen. Ionisierende Strahlung hemmt die Entstehung und Differenzierung von neuen Nervenzellen und ermöglicht eine nicht-invasive Methode, um neurale Vorläuferpopulationen gezielt 13-15. Vor kurzem hat eine Keim Region des Hypothalamus Säugetier Eminentia mediana (ME), dass wir die Hypothalamus proliferative Zone (HPZ) 2 genannt haben wir beschrieben, . Wir haben festgestellt, dass bei jungen Erwachsenen weiblichen Mäusen eine fettreiche Diät (HFD) gegeben, Ebenen der Neurogenese im HFD-gefütterten Mäuse waren deutlich höher als ihre normalen Futter (NC) zugeführt Kontrollen in diesem Bereich 2 ME. Um zu testen, ob adulte Neurogenese im Hypothalamus ME reguliert den Stoffwechsel und Gewicht, haben wir versucht, diesen Prozess zu stören. Die Eminentia mediana ist eine kleine einseitige Struktur an der Basis des dritten Ventrikels, von dem regulatorischen Hormone freigesetzt. Zur Vermehrung und anschließende Neurogenese, ohne die anderen physiologischen Funktionen dieses Hirnregion zu verhindern, entwickelten wir eine nicht-invasive Brennbestrahlungstechnik, um die Geburt des neugeborenen erwachsenen Neuronen im Hypothalamus Median Eminenz 2 selektiv hemmen.

Eine Reihe von Gruppen Strahlung auf die Neurogenese im kanonischen Regionen 14-28 unterdrücken beschäftigt. Allerdings haben frühere radiologische Ansätze in der Regel gezielt große Flächen, oder often unbeabsichtigt auch gezielt mehreren Hirnregionen, wo die Neurogenese wurde berichtet, so dass es schwierig ist, eindeutig alle mit Defekten in spezifischen neuralen Vorläuferpopulationen beobachteten Verhaltensdefekte zu assoziieren. Die Möglichkeit für weitere gezielte Bestrahlung durch radiologische Plattformen, c omputer-Tomographie-geführte Bildgebung kombiniert mit f ocal Strahl IR-Strahlung (CFIR) Lieferung, genaue anatomische 29-36 Targeting ermöglichen. Strahlungsstrahlen so klein wie 0,5 mm im Durchmesser sind, um spezifische neurale Vorläuferpopulationen 35 zielen. Diese Methode erlaubt uns, den Hypothalamus ME Ziel und verhaften Proliferation und blockieren die Neurogenese in kleinen Tiere. Nach radiologischen Behandlung auf diesen Vorläuferpopulationen, können physiologische und Verhaltenstests durchgeführt werden, um das Potenzial in Abhängigkeit von Erwachsenen geboren Zellen zu beleuchten. Focal-Targeting ist besonders wichtig für unsere Anwendung, da dieHirnanhangdrüse liegt in der Nähe der Hypothalamus Eminentia mediana; Bestrahlung der Hypophyse können Hormonfunktion beeinflussen und anschließend verwechseln Ergebnisse.

Die biologische Grundlage für die Unterdrückung der Neurogenese nach der Bestrahlung noch unklar. Vorherige Studien Strahlung auf großflächigen Strahlen verlassen, und haben festgestellt, daß die Unterdrückung der Neurogenese durch eine entzündliche Reaktion 14, 37 vermittelt. Als solches ist es unklar, ob hochBrenn Bestrahlung konnte die Neurogenese unterdrücken, da es nicht zu einem wesentlichen Entzündungsreaktion hervorzurufen. Die jüngsten Studien von unserer Gruppe der klassischen neurogenen Region im Hippocampus haben gezeigt, dass hochBrenn Bestrahlung mit einer Dosis von 10 Gy kann die Neurogenese für mindestens 4 Wochen nach der Bestrahlung 35 zu unterdrücken.

Um die Funktion der Erwachsenen-geboren Neuronen im Hypothalamus Median Eminenz abzufragen, verwenden wir ein Präzisionsbestrahlung device der Lage ist, CT-Bildgebung in Verbindung mit kleinem Durchmesser Strahlen ME Genese hemmen. Verwendung einer Röntgenröhre an einem Portal, das über einen Bereich von 360 ° dreht, befestigt ist, liefern wir bogenMikroStrahlBestrahlungsStrahl unter Verwendung eines robotergesteuerten Probentisch, der die Drehung eines tierischen Patienten während der Bestrahlung (Fig. 1) ermöglicht . Ein hochauflösender Röntgendetektor wird verwendet, um Bilder zu erfassen, wenn die Gantry in der horizontalen Position 33. Für diese Studie wurden die CT-Bilder mit einer isotropen Voxel-Größe von 0,20 mm rekonstruiert. Bord CT erlaubte die Identifizierung eines Ziel während sich das Tier in der Behandlungsposition. Das Ziel wurde mit der CT-Navigation Dosis-Planungs-Software, die mit unserem Handel erhältlich radiologische Plattform aufgenommen wurde lokalisiert. Nach der Lokalisierung unserer ROI durch CT-Bildgebung wurde das Tier in die entsprechende Behandlungsposition durch die Roboter-Probenbühne, die vier Grad bewegt hatRees Freiheits (X, Y, Z, θ). Durch eine Kombination von Portalroboter und Stufe Winkel können Strahlen aus nahezu jeder Richtung relativ zu dem Tier geliefert werden, und stereobogenartige Behandlungen möglich sind 29. Für diese und alle anderen bildgebenden Untersuchungen wurden die Mäuse in einer Feststellvorrichtung, die die Lieferung von Narkosegas Isofluran ermöglicht, während die Bewegungsfreiheit einzuschränken positioniert. Die Immobilisierung Bett CT-kompatibel, und eine Verbindung mit dem Roboter-Probentisch 34.

Wir erwarten, dass CFIR werden konzeptionelle Fortschritte in einer Reihe von Forschungsbereichen zu schaffen. Obwohl wir radiologische Ausrichtung der Hypothalamus Medianstellung als Beweis für das Prinzip dieser Technik kann CFIR verwendet, um jede Region des Körpers eines jeden kleinen Modellorganismus im Prinzip gezielt werden. In den Neurowissenschaften, zum Beispiel stellen wir uns diese Technik verwendet, um die Funktion aktiv proliferativen Vorläuferpopulationen, die Existenz vorgeschlagen worden sind, zu bewertent in zirkumventrikulären anderen Organen wie der Area postrema 38, 39, Subfornikalorgans 40 und 41 der Hypophyse. Langjährige Streitigkeiten über die funktionelle Rolle der adulten Neurogenese und die Identifizierung eine kausale Rolle im Verhalten können nun besser angesprochen werden. In Singvogel, kann diese Technik mit der Rolle von adulten Neurogenese bei der Aufrechterhaltung der robusten und saisonale Verhalten der Vogelgesang 42, die durch die Fähigkeit zur selektiven Hemmung der Neurogenese in spezifischen Hirnregionen beeinträchtigt wurde. Das Verständnis dieser robusten Verhaltensmodell könnte neue Einblicke in die Rolle der Neurogenese bei der Regulierung anderer sexuell dimorphen Verhaltensweisen zu vergießen. Alternativ kann in der Stoffwechselfeld CFIR könnte verwendet werden, um Aspekte der Rolle von Hepatozyten-Proliferation und ihre Rolle im Stoffwechsel und Energiebilanz zu erkunden. Die Möglichkeit für die konzeptionelle Voraus in mehreren Forschungsrichtungen wird durch die Einführung dieser Technik verbessert.

In diesem Beitrag zeigen wir die Möglichkeiten von CFIR für präzise anatomische Ausrichtung der Bestrahlung einer Brennstrahl. Obwohl wir zunächst dieses kleine Tier Strahlung Forschungsplattform (SARRP) für unsere Studien entwickelt, sind nun andere ähnliche Geräte im Handel erhältlich, die ähnliche CT-gesteuerte Brenn Bestrahlung 43, 44 erreichen kann. Daher verallgemeinern wir dieses Protokoll mit CFIR Schritte für alle Forschungsplattformen eher als diejenigen, die spezifisch für SARRP erforderlich. Die Vorteile gegenüber bisherigen CFIR radiologischen Ansätze Genese hemmen, dass diese Technik ermöglicht dreidimensionale volumetrische Bildführung für die Lokalisierung und Ausrichtung der Dosis, konforme Dosis minimiert Einwirkung nontargeted Hirnregionen und hoher Präzision Strahlgeometrie ermöglicht konforme Dosisverteilung mit scharfen Strahl Grenzen. Wir beschreiben, wie CT-gesteuerte Bildgebung zu verwenden, um die Dosis zu einer bestimmten anatomischen Region ansprechen und auf diese Weise, wie man die Strahlung visualisierenDosisverteilung direkt im Gewebe unter Verwendung von immunhistochemischen Färbung für γ-H2AX, einem Marker der DNA-Doppelstrangbrüche 35, 45-48. Die Verwendung dieses Ansatzes für die selektive Bestrahlung der neurogenen Nischen kann erhebliche Auswirkungen in enthüllt die funktionelle Rolle der neuen Erwachsenen-geboren Neuronen auf Physiologie und Krankheit.

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Protokoll

Tiernutzungs

Holen Sie die Genehmigung von institutionellen Animal Care und Verwenden Ausschuss für Standard-Pflege und Nutzung Protokolle. Das derzeitige Protokoll wurde für Brenn Bestrahlung Studien über 5,5-10 Wochen alten erwachsenen C57BL6 / J-Mäusen entwickelt, wie früher beschrieben (Fig. 2) 2. Aber auch andere Zeiten und kleine Tierarten (Ratte, Hamster, Eichhörnchen Boden, etc.) können ebenfalls verwendet werden, sofern eine wirksame Anästhesie-Protokolle und ein Röntgenreferenz Atlas zur Identifizierung des interessierenden Bereich (ROI) zur Verfügung.

1. Kalibrierung von CT-gesteuerte Radiological Platform

Führen filmbasierten Kalibrierungen für Strahlungsdosis auf die radiologische Plattform im Voraus für jeden Kollimator Größe und Art der Röntgenröhre Filter verwendet. Um einen Bogen Strahl der Bestrahlung in der gewünschten Zielort Ziel, verwenden Sie die Strahlendosis-Planungs-Software 49 available für die meisten kommerziellen Strahlung Plattformen erforderlichen Lieferzeit zu berechnen, basierend auf der Strahlungsdosis, die Tiefe der Region von Interesse (ROI) auf Basis von CT-Scans der Maus, und die Rotationsgeschwindigkeit des Roboterplattform, werden Einzelheiten hierzu ausgelassen dieses Protokolls, wie sie zwischen der Strahlung Plattformen unterscheiden. Für die Zwecke der Sichtbarmachung der ventrobasalen Hypothalamus 2 (Fig. 3) mit der CT-Bildgebung, betreiben die Röntgenröhre mit einer 0,4-mm-Brennpunkt-und Strahlenergie von 100 kVp mit 1 mm Al Filtration. Für Schwer Bestrahlung des HPZ, betreiben die Röntgenröhre bei 225 kVp, 13 mA und einem 1-mm-Brennfleck mit Filtration von 0,15 mm Cu, bis 10 Gy Strahlung bei einer Gewebetiefe von 0,6 cm über einen Behandlungs liefern Zeit von 4,6 min. Targeting zwischen verschiedenen ROIs wird die Berechnung verschiedener Parameter erforderlich.

  1. Wenn die Untersuchung der Auswirkungen des hohen Fett-Diät auf die Neurogenese in der Median-Eminenz, wie zuvor beschrieben 2, erhalten vier Wochen alten weiblichen C57BL6 / J-Mäuse von Jackson Maus-Labors, und Haus vier Mäuse pro Käfig. Schalten Sie Lebensmittel aus normalen Futter zu einem hohen Fett-Diät an fünf Wochen alt. Lassen Mäuse auf neue Wohnung und Nahrung zu gewöhnen. Führen CFIR Behandlung bei 5,5 Wochen alt. Transport unterzieht, um den OP, die die radiologische Plattform enthält. Minimieren Sie Stress während der Übertragung. Bereiten Isofluran-Gasnarkose Kammer. Dann fügen Sie eine einzelne Maus in die Kammer. Parallel dazu bereiten Heizkissen (niedrige Einstellung) zur Nachbehandlung.
  2. Sobald Maus ist unter und reagiert nicht mehr auf Fuß-Pad Kompression, bringen das Thema auf die radiologische Plattform und legen Sie auf der Immobilisierung Bett des Roboter-Bühne. Zeigen Mund Subjekts in die Nase Kegel Anästhesie Tasse, und die Zähne in der Aufbiss (Abbildung 1D). Legen Maus flach auf dem Bett und Immobilisierung zu überprüfen, um zu sehen, ob es weiterhin pflegen Teilnahmslosigkeit. Wenn dem so ist, kleben Maus nach unten auf das Bett mit Gaze-Band. Während Abklebewerkzeugs die Maus auf dem BettSicher, dass der Kopf auf eine horizontale Ebene eingeebnet. Dies kann durch Hochziehen der Ohren und sehen, ob sie eingeebnet werden bestimmt werden. Sobald sich die Maus in der richtigen Position, schließen Sie die Führung Schutzschild.
  3. Erwerben Sie die Computer-Tomographie-Scan mit On-Board-Software des radiologischen Plattform des Experimentators (dies wird zwischen den Plattformen unterscheiden), die eine dreidimensionale anatomische Struktur Scan der Maus Thema zur Verfügung stellt. Überprüfen Sie, ob die Mauskopf in der horizontalen Ebene eingeebnet. Wenn nicht, wiederholen Sie die Schritte von 1,2 bis 1,3, bis der Kopf des Patienten wird eingeebnet.
  4. Identifizieren ROI von CT-Bild. Berechnen Abstand ROI an der Oberfläche des Schädels unter Verwendung eines 45 °-Winkel zu der horizontalen Ebene, wie in Fig. 3E gezeigt.
  5. Mit On-Board-Software, nehmen Sie ein X-ray des Maus-Thema von oben wie in 4A gezeigt. Entfernen Sie dann mit der Maus aus der radiologische Plattform, setzen auf Heizkissen und aktiv bis zu überwachen.
  6. Von den koronalen CT-Bilder, die Berechnung der durchschnittliche ROI anatomischen Tiefe von mindestens drei Mäusen, um die Liefer Dosierung zu bestimmen. Als ein Beispiel einer früheren Studie 2 wurden 10 Gy Bestrahlung wurde der ventrobasalen Hypothalamus verabreicht wird, die Tiefe des ROI aus dem Schädel (von 45 °) beträgt 0,66 cm (siehe Fig. 3E). Wissend, dass die Forscher die Dosis Planungssoftware (DPS) auf ihre radiologische Plattform installiert, um die entsprechende Drehgeschwindigkeit und Dauer der Behandlung zu berechnen, um die gewünschte Dosis auf den ROI zu erzielen.
  7. Nach der Bestimmung der Behandlungsdauer und der Drehgeschwindigkeit des Roboterstufe mit der Dosisplanungssoftware messen Dosisverteilungen der berechneten Parameter mit GAFCHROMIC strahlungsempfindliche Filme in einer wasseräquivalenten Kunststoff Mock-Mausmodell eingebettet. Um dies zu tun, betten drei GAFCHROMIC strahlungsempfindlichen Filmen, die zwischen vier vertikal gestapelten Wasser-Äquivalent Kunststoffblöcke 29 alsin Fig. 4B gezeigt.
  8. Zeigen Mock-Maus-Modell enthält GAFCHROMIC Roboter-Filme auf der Bühne, und führen Sie den Brennstrahl Bestrahlung mit den neu berechneten Parameter. Zum Beispiel, um die ventrobasalen Hypothalamus, Eingangs Ziel die Parameter von 0,15 mm Cu-Filter, 225 kVp, 13 mA, 1 mm Durchmesser Strahl Einstellung, 45 ° Gestellwinkel, 1,3 ° / sec Rotation, und 4,6 min, eine ROI erzielen Strahlendosis von 10 Gy.
  9. Nach der Bestrahlung, überprüfen Filme für Muster und Intensität der Strahlendosis. Für eine 360 ​​°-Winkel Drehung mit den aufgeführten, die ventrobasalen Hypothalamus, einen dunklen Ring in dem Film über das Isozentrum, einem kleinen Ort knackig im Isozentrum Film und einem helleren Ring in dem Film unter dem Isozentrum entsprechend der Kegel-Zielparameter Strahl Verabreichung der Bestrahlung beobachtet werden (Fig. 4B).
  10. Lagern Isozentrum GAFCHROMIC Film über der X-Strahlen der Maus Fächern, aus denen die Parameter waren calnete. Die bestrahlte Brennpunkt an Isozentrum der gewünschten ROI Region überlappen, wie in Fig. 4C gezeigt.

Alternative Methode: Wenn Schwierigkeiten bei der Ausrichtung der ROI Gehirn bestehen, verwenden Jodkontrastmittel intrathekal injiziert, um Visualisierung der Herzkammern unter CT-Bilder zu verbessern. Aus Gründen der Kürze wird dieses Verfahren aus diesem Protokoll verlassen, aber vorher beschriebenen 35, 50. Jod-Kontrast zusätzliche ventrikuläre Sehenswürdigkeiten (5A) zu liefern.

2. Die Genauigkeit der Bestimmung der Bestrahlung Strahl

Ferner bestätigen CFIR Strahlgenauigkeit durch direkte Visualisierung des Strahlenbündels in Gewebe 2, 35, 51. Um dies zu tun, führen die Immunhistochemie an γH2AX 51, eine Histon-Protein und ein früher Marker von DNA-Doppelstrangbrüche zu erkennen. Maus Personen müssen transkardial perfundiert und innerhalb einer Stunde nach der Bestrahlung fixiert werden. Nach der Bestrahlungation, DNA-Reparatur schnell Ensues, und die Höhe der ΥH2Ax 35 deutlich sinken.

  1. Wiederholen Sie die Schritte 1,1-1,3.
  2. Nachdem das Ziel auf CT identifiziert, wird die Maus Thema unter Robotersteuerung bewegt, um dieses Ziel mit der Strahlung Lieferung Strahl auszurichten. Eingangs berechneten Parameter (Drehzahl und Dauer der Behandlung, um die gewünschte Dosierung zu erreichen) aus Schritt 1.6 in Dosisplanungssoftware und die Behandlung beginnen. Behandlung geliefert mit der Gantry wies auf 45 ° von der Vertikalen, während die Maus rotiert um eine vertikal ausgerichtete Achse.
  3. Nach der Bestrahlung durchzuführen transkardialer Perfusion auf Maus Themen. Führen Perfusion innerhalb einer Stunde 52. Nach Perfusion, Tauch fix Gehirne in 4% PFA / PBS und schaukeln über Nacht bei 4 ° C
  4. Am folgenden Morgen, waschen 5 min in PBS 3x zu Para Fixiermittel zu entfernen. Dann Eintauchen in 30% Saccharose in 1 × PBS auf einem Schüttler bei 4 ° C.
  5. Vorsichtig bei 4 ° C (us rockenmanuell 12-16 h), bis Gehirn sinkt zum Boden des Röhrchens. Dies dient als Gefrierschutz Schritt. Sobald Gehirn sinken, entfernen Gehirn mit einem Schaumlöffel, um überschüssige 30% sucrose/1x PBS Übertragung zu verhindern. Schnell in Gefriermedium auf Trockeneis einbetten. Swirl Gefriermedium mit Pipettenspitze und richten Gehirn in Plastikform.
  6. Einmal vollständig gefroren, über Gehirn Blöcke zu -20 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
  7. Am Tag, als die Immunhistochemie durchgeführt werden, koronalen Abschnitt bei 40 um Dicke, und schweben in einer 24-Well-Platte mit PBS mit einem dünnen Pinsel. Die Schnitte werden in der richtigen Serienauftrag für die Immunfärbung der Bestrahlung Abdeckung der Zielregion zu bestimmen, gehalten werden.
  8. Vorwärmen 0,01 M Natriumcitrat-Lösung auf 80 ° C im Wasserbad in Vorbereitung für Antigengewinnungsschritt. Gleichzeitig, während die Natrium-Citrat wärmt, führen Sie 5 Minuten wäscht 3x in 0,01 M PBS.
  9. Sobald Natriumcitrat Lösung ist bei 80 ° C, tauchen Gehirnschnitte in die Natriumcitrat-Pufferlösung. Verlassen in einem Wasserbad bei 80 ° C für 1 Stunde.
  10. Abschnitt entfernen und lassen Natrium-Citrat-Lösung auf Raumtemperatur zu erreichen, führen drei 5-minütigen Waschschritten in 0,01 M PBS.
  11. Blockieren Gehirnschnitte für 1 Stunde in PBS-Triton mit 5% normalem Ziegenserum.
  12. Inkubieren über Nacht Hirnschnitte in PBS-Triton enthaltend 5% normales Ziegenserum 1:700 Konzentration von Maus-Anti-phospho-H2AX primären Antikörper bei 4 ° C.
  13. Am nächsten Tag durchführen 15 Minuten wäscht 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  14. Inkubieren Gehirnschnitte PBS-Triton enthaltend 5% normales Ziegenserum Ziegen-Anti-Maus-sekundären Antikörper bei 488 nm Fluorophor konjugiert 2 h bei 1:500 Konzentration.
  15. Führen Sie 15 Minuten wäscht 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  16. Führen 4 ',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Färbung (1:5000 in PBS) für 10 min auf Kern visualisieren. Dann waschen Hirnschnitte für 5 min mit PBS.
  17. Montieren Sie an elektrostatisch charged Objektträger durch schwimmende Abschnitt in PBS. Wischen Sie überschüssiges PBS und Folien erlauben, um zu trocknen. Deckglas der Objektträger mit Montagemedium und lassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht trocknen.
  18. Machen Sie Fotos von Serien koronalen Abschnitte mit Fluoreszenzmikroskop. ΥH2Ax Immunfärbung (grün) zeigt Ort der Bestrahlung. DAPI (blau) ist eine Kernfärbung (Abbildung 5B).

3. Herstellung von Maus-Themen für Focal Bestrahlung

Untersuchen ΥH2Ax Immunfärbung Ergebnisse. Einmal mit der Kalibrierung zufrieden und Targeting des Bestrahlungsstrahl, fahren Sie mit dem Experiment. An diesem Punkt wird die Gesamtzeit, erforderlich, um eine Maus (aus tierischen Einrichtung zur Vervollständigung des Strahlabgabe) zu behandeln, ist etwa 10-15 Minuten für eine 10-Gy-Behandlung mit einer 1-mm-Strahl.

  1. Bestellen vier Wochen alten C57BL6 / J weibliche Mäuse von Jackson Maus Labors. Haus vier Mäuse pro Käfig, und schalten Sie Lebensmittel aus normalen Futterauf eine fettreiche Diät an fünf Wochen alt. Ohrstanzmäuse, sie zu eindeutigen Identifizierungszeichen zu geben. Überwachung der Gesundheit der Mäuse täglich. Hinweis: metallische Marker können nicht verwendet werden, wie sie in Streifenartefakte auf dem CT-führt.
  2. Wiegen Mäuse am Tag vor der Strahlung oder Scheinbehandlung. Split Mäuse in zwei Kohorten für Strahlung oder Scheinbehandlung und sicherzustellen, dass es keinen signifikanten Unterschied im Gewicht zwischen Kohorten. Am Tag der Behandlung, wenn die Mäuse sechs Wochen alt, nochmals wiegen alle Mäuse und erfassen ihre Masse. Beide Kohorten vorsichtig transportieren, um die radiologische Plattform. Achten Sie darauf, Stress zu minimieren.
  3. Bereiten Isofluran-Gasnarkose Kammer. Anesthetize zwei Mäuse, eine in der vorgegebenen Bestrahlungsgruppe, und ein anderer in der Schein-Kontrollgruppe. Bereiten Heizkissen in der niedrigen Einstellung für die postoperative Behandlung eingestellt.
  4. Folgen Sie den Schritten von 1,2 bis 1,4 für die Maus auf die Bestrahlung zu erhalten. Für die Schein-Maus, halten Sie die Maus in der Anästhesie während der Behandlung Kammer vor sich geht. Machen sure, dass Anästhesie Kammer ist in der Nähe der Plattform, so CFIR alle Auswirkungen auf die Umgebungsstrahlung sind eingepreist Nachdem das Ziel auf CT identifiziert, bewegen Sie die Maus Thema unter Robotersteuerung, um dieses Ziel mit der Bestrahlungsstrahl auszurichten. Eingangs berechneten Parameter (Drehzahl und Dauer der Behandlung) in Dosisplanungssoftware.
  5. Nach Bestrahlung Behandlung abgeschlossen ist, kehren beide Schein und bestrahlten Mäusen zu Heizkissen und überwachen, bis sie aufwachen.
  6. Zurück sowohl Schein und bestrahlten Mäusen zu Tieranlage. Überwachung jeden Tag. Wiegen Sie die Mäuse jede halbe Woche. Um gezielte Bestrahlung von Hypothalamus proliferative Zone bestätigen, verwalten intraperitoneale Injektion von BrdU (50 mg / kg) 3 Tage nach der Behandlung und untersuchen die Neurogenese zwischen Gruppen von colabeling Immunhistochemie für BrdU und einem neuronalen Marker einen Monat nach Anfangs BrdU-Exposition (Abbildung 6) 2.

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Ergebnisse

Beurteilung der CT-gesteuerten Targeting und Genauigkeit

Die mechanische Kalibrierung des Systems ist für die Gewährleistung, dass Strahlen, die von verschiedenen Winkeln schneiden sich alle in einem einzigen Punkt. Die Kalibrierung erfolgte mit einem halbautomatischen bildgestützte Verfahren, bei dem die Ausrichtungsgenauigkeit Ende-zu-Ende wurde gemessen zu 0,2 mm 29 bewerkstelligt sein. Diese Genauigkeit ist sehr kritisch, da das Volumen des Hypothalamus Median Eminenz Struktur is...

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Diskussion

CT-gesteuerte Brenn Bestrahlung (CFIR) ist eine neue und vollständige Systemansatz der Lage ist, Strahlungsfelder, Ziele in kleinen Tiere unter Robotersteuerung mit CT-Führung 32. Die Fähigkeit CFIR hoch fokussierten Strahlen auf kleine Tiermodellen liefern stellt neue Forschungsmöglichkeiten für Laborforschung und klinische Übersetzung brücken. Dieses Papier beschreibt die CFIR Ansatz für die präzise Bestrahlung Lieferung, gezielt eine Hypothalamus neuralen Vorläufer Bevölkerung. Wir zeigen hier, wie Sie dur...

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Offenlegungen

JW hat eine Forschungsförderung und Beratung Abkommen mit Xstrahl, Inc.

Danksagungen

Wir danken C. Montojo, J. Reyes, und M. Armour für die technische Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschuss F31 NS063550 (DAL), ein Basil O'Connor Starter Scholar-Preis und Zuschüsse aus dem Fonds und NARSAD Klingenstein (SB) unterstützt. SB ist ein WM Keck Distinguished Scholar Junge in der medizinischen Forschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SARRP-ForschungsplattformXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP BestrahlungsbunkerXstrahlOptional, aber die Strahlenbelastung sollte mit alternativer Bleiabschirmung eingedämmt werden
GAF ChromfolieIPSGAFchromic ETB2
Maus PhantomGammex457Kaufen Sie 0,5 cm x 30 cm x 30 cm feste Wasserplatten von Gammex und schneiden Sie sie auf die gewünschte Größe zu.
Maus-Anti-Phospho-Histon-Antikörper H2AX Ser139Millipore, Inc.05-636Klon JBW301 Fettreiche
NagetierdiätForschung DiätenD12492i60% der Kalorien als Fett, Nahrung sollte bestrahlt werden
IsofluranBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0,01 M NatriumcitratFisher Scientific1,471 g Natriumcitrat gelöst in 500 ml deionisiertem Wasser
Superfrost Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
DAPI FisherScientificnukleare Gegenbeize
EindeckmediumFisher ScientificVectashield oder Gelvatol wird bevorzugt

Referenzen

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