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Methodenartikel

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

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DOI:

10.3791/50722

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23. Dezember 2013

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Zusammenfassung

WRN-Exonuklease ist an der Auflösung von DNA-Schäden beteiligt, die entweder während der DNA-Replikation oder nach Exposition gegenüber endogenen oder exogenen Genotoxinen auftreten. Es ist wahrscheinlich, dass es eine Rolle bei der Verhinderung der Akkumulation von rekombinogenen Zwischenprodukten spielt, die sich sonst an vorübergehend blockierten Replikationsgabeln ansammeln würden, was mit einem hyperrekombinanten Phänotyp von Zellen ohne WRN übereinstimmt. Beim Menschen umfasst die Exonuklease-Domäne einen N-terminalen Teil eines viel größeren Proteins, das auch Helikase-Aktivität besitzt, zusammen mit zusätzlichen Stellen, die für die Interaktion zwischen DNA und Protein wichtig sind. Im Gegensatz dazu wird in Drosophila die Exonuklease-Aktivität von WRN (DmWRNexo) durch einen von der präsumtiven Helikase getrennten genetischen Locus kodiert, was eine biochemische (und genetische) Aufschlüsselung der Rolle der Exonuklease-Aktivität bei den Stabilitätsmechanismen des Genoms ermöglicht. Hier demonstrieren wir eine Fluoreszenzmethode zur Bestimmung der WRN-Exonuklease-Aktivität unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem DmWRNexo und end-markierten fluoreszierenden Oligonukleotiden. Dieses System ermöglicht eine höhere Reproduzierbarkeit als radioaktive Assays, da die Substrat-Oligonukleotide monatelang stabil bleiben, und bietet eine sicherere und relativ schnelle Methode für eine detaillierte Analyse der Nukleaseaktivität, die die Bestimmung der Nukleasepolarität, der Prozessivität und der Substratpräferenzen ermöglicht.

Einleitung

Nukleasen spielen in Zellen eine wichtige Rolle bei der Entfernung beschädigter DNA, der Auflösung von Nicht-Duplex-Strukturen wie Holliday-Verbindungen und der Bereitstellung von Korrekturlesekapazitäten während der DNA-Replikation, sowohl intrinsisch in DNA-Polymerasen als auch extrinsisch zu ihnen1. Nukleasen können entweder durch sequentiellen Abbau von DNA von freien Enden (Exonukleasen) oder durch Spaltung interner Phosphodiesterbindungen innerhalb eines längeren DNA-Moleküls (Endonukleasen) wirken. Der Verlust der Nukleaseaktivität kann zu hochspezifischen Phänotypen der Genominstabilität führen. Während die Mutation des RecQ-Helikase-Familienmitglieds BLM zu übermäßig hohen Raten des Schwesterchromatidenaustauschs und weltweit erhöhten Krebsraten führt (überprüft von Payne und Hickson2), führt die Mutation des hochverwandten WRN-Proteins zu vorzeitiger Alterung3; Der wichtigste signifikante Unterschied zwischen diesen beiden Familienmitgliedern ist das Vorhandensein einer 3'-5'-Exonuklease-Domäne in WRN4. Hinweise auf eine entscheidende Rolle der WRN-Exonuklease bei der Aufrechterhaltung der Genomstabilität haben sich aus der Analyse von Genotypen bei WS-Patienten5 zusammen mit Punktmutations- und Deletionsstudien in menschlichen Zellen angesammelt, die durch kristallographische Studien der isolierten Exonuklease-Domäne6 gestützt wurden. Die Zusammenarbeit und Wechselwirkung zwischen der Exonuklease-Aktivität von WRN und ihrer zentralen Helikase-Aktivität7 macht es jedoch schwierig, die Funktionalität beider Elemente und ihre relativen Beiträge zur Genomstabilität auseinanderzuhalten. In Pflanzen und Tieren mit niederen Metazoen ist die WRN-Exonuklease-Aktivität auf einem einzelnen Polypeptid ohneHelikase-Aktivität vorhanden 8-10 (überprüft in Cox und Boubriak11); In Arabidopsis wurde biochemisch gezeigt, dass diese Exonuklease koordiniert mit der verwandten WRN-Helikase agiert und die kombinierten Enzymaktivitäten, die bei Wirbeltieren WRN9 beobachtet wurden, effektiv rekonstituiert. Wir haben die WRN-Exonuklease in Drosophila untersucht, da die hervorragenden genetischen Werkzeuge die Analyse der Auswirkungen der Exonuklease-Mutation (ohne Auswirkungen auf die mutmaßlich verwandte Helikase) auf der Ebene des gesamten Organismus und während der Entwicklung ermöglichen10,12. Darüber hinaus haben wir rekombinante Drosophila WRN-Exonuklease (DmWRNexo) kloniert, exprimiert und gereinigt, was eine vollständige biochemische Analyse ihrer Enzymeigenschaften ermöglicht13,14.

Die Nukleaseanalyse in vitro wird traditionell mit radioaktiv markierten Oligonukleotiden durchgeführt, wobei der Abbau durch Suche nach einer Leiterbildung von Produkten auf Acrylamidgelen bewertetwird 4,8,15. Solche Assays sind zwar empfindlich, aber aufgrund des radioaktiven Zerfalls der markierten Substrate im Alltag nicht quantitativ reproduzierbar. Darüber hinaus stellen der Umgang und die Entsorgung radioaktiver Reagenzien erhebliche Umwelt- und Gesundheitsprobleme dar. Auch die Beschaffung von radioaktiven Markierungen wird zunehmend problematisch. Eine neuere alternative Methode bestimmt die Menge des endgültigen Abbauprodukts mittels Massenspektrometrie16. Es ist jedoch zeitaufwändig (dauert mehrere Tage), erfordert spezielle Geräte, und die Ablesung ist die Menge des Endprodukts (Einzelnukleotid) und eignet sich daher nicht für die empfindliche Messung von Aspekten wie der Enzymprozessivität oder zur Bestimmung, ob einige Nukleotide, Sequenzen oder Modifikationen zu einer Pause oder einem Stillstand der Nuklease führen. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir die traditionellen gelbasierten Assays für die Verwendung mit fluoreszierenden Oligonukleotidsubstraten angepasst, um stabil markierte Substrate zu erzeugen, die über lange Zeiträume reproduzierbar verwendet werden können und so einen direkten Vergleich der Nukleaseaktivitäten unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.

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Protokoll

1. Herstellung von Substrat-Oligonukleotiden

  1. Synthetisieren Sie benutzerdefinierte Oligonukleotide.
    1. Entwerfen Sie ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einem 5'-konjugierten Fluoreszeinmolekül, das das Rückgrat für jedes Substrat bildet. (Beachten Sie, dass dies für eine 3'-5'-Exonuklease gilt; für eine 5'-3'-Polaritäts-Exonuklease verwenden Sie einen 3'-konjugierten Rückgratstrang). Wenn die Polarität nicht bekannt ist, sollten sowohl 3' als auch 5' getestet werden.
    2. Komplementärstränge so gestalten, dass beim Glühen mit dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid das/die Duplexsubstrat(e) der Wahl gebildet werden. Beachten Sie, dass der komplementäre Strang nicht an ein Fluorophor konjugiert ist. Bei der Bestellung ist die PAGE-Aufreinigung anzugeben (Entsalzung ist nicht ausreichend).
    3. Oligonukleotidbestände in 10 mM bei 1 nmol/μl bei -20 °C und im Dunkeln lagern.
  2. Mischen Sie das rückgratmarkierte Oligonukleotid mit jedem komplementären unmarkierten Oligonukleotid in einem molaren Verhältnis von markiert:unmarkiert in Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl). (Hinweis: Ein Verhältnis von 1:1 ist am wünschenswertesten, aber es ist wichtiger, dass ALLE beschrifteten Litzen gebunden sind. Übersetzungen von 1:1 - 1:1,5 können funktionieren.)
  3. Ein Wasserbad oder einen Heatblock auf 95 °C erhitzen und die Glühmischung 3 min darin geben, dann ausschalten und das Ganze langsam (1 °C/min) auf unter 30 °C abkühlen lassen.
  4. Überprüfen Sie das vollständige Glühen des markierten Oligonukleotids, indem Sie das resultierende Duplexsubstrat auf einem nativen 10%igen Polyacrylamidgel laufen lassen (10% 19:1 Acrylamid:bis-acrylamid in 1x Tris-Borat-EDTA (TBE, 89 mM Trisbase, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA), polymerisiert mit 0,05 % w/v Ammoniumpersulfat (APS) und 0,005 % v/v TEMED). Visualisieren Sie mit PhosphorImager (siehe Abschnitt 5 unten).

2. Herstellung von Acrylamid-Gelen

  1. Richten Sie das Gelcasting-System ein, z.B. Hoefer SE400 Gel-Rig mit 16 cm x 18 cm Platten und 1,5 mm Abstandhaltern.
    1. Reinigen Sie Glasplatten und Abstandhalter gründlich mit Reinigungsmittel und Wasser. Tragen Sie saubere Handschuhe, um eine erneute Verschmutzung der Platten mit Öl aus den Fingern zu vermeiden, da dies eine gleichmäßige Gelbildung behindern würde.
    2. Spülen Sie die Platten mit viel destilliertem (deionisiertem) Wasser ab, um Waschmittelreste zu entfernen, und wischen Sie sie dann mit fusselfreiem Tuch (z. B. Kimwipes) ab.
    3. Zum Schluss mit 70% Ethanol besprühen und abwischen – Glasplatten sollten quietschen, wenn sie sauber sind. Stellen Sie es aufrecht beiseite, damit das letzte Stück Ethanol verdampfen kann.
    4. Reinigen Sie den Rest der Gelbildungsausrüstung mit destilliertem Wasser (verwenden Sie bei Bedarf zuerst Reinigungsmittel) und trocknen Sie es ab.
    5. Montieren Sie die Glasplatten und Abstandshalter in die Gelbildungsanlage und stellen Sie sicher, dass das System auslaufsicher ist.
  2. Bereiten Sie die Gellösung auf den gewünschten Polyacrylamidanteil vor
    1. Für den Nuklease-Assay verwenden Sie denaturierende 14%ige Polyacrylamid-Gele mit 8 M Harnstoff in 1x FSME.
    2. Um 100 ml herzustellen (ausreichend für 2 Gele mit viel Überschuss für Leckagen), nehmen Sie 48,05 g Harnstoff in ein breites Becherglas und fügen Sie 35 ml 40%ige 19:1 Acrylamidlösung und 10 ml 10x FSME (890 mM Tris, 890 mM Borsäure, 20 mM EDTA, pH 8,3 mit NaOH) hinzu. ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe - Acrylamid ist ein starkes Neurotoxin. Lösen Sie den Harnstoff mit einem Rührstab und einer magnetischen Rührplatte auf (dies wird einige Zeit dauern).
    3. Wenn es aufgelöst ist, fügen Sie milliQ-deionisiertes Wasser zu 100 ml hinzu und sterilisieren Sie es mit einer 0,22-μm-Membran. Bei unverzüglichem Gebrauch mit Absauggeräten kurz entgasen und dunkel lagern (einige Tage haltbar). Nicht im Kühlschrank aufbewahren, da der Harnstoff ausfällt.
  3. Polymerisieren und gießen Sie das Gel.
    1. Nehmen Sie das Harnstoff-Acrylamid und fügen Sie 0,5 ml 10% (w/v) Ammoniumpersulfat (APS, in destilliertem Wasser hergestellt) und 50 μl TEMED hinzu. Schwenken Sie den Behälter langsam, um ihn zu mischen, ohne Luft hinzuzufügen (was die Polymerisation hemmt) und gießen Sie ihn in den Gelbildner. Handeln Sie schnell, sonst kann das Gel vor Beendigung des Gießens aushärten.
    2. Fügen Sie den entsprechenden Kamm hinzu, um Vertiefungen für die Probenbeladung zu bilden (ausgewählt je nach Gel-Rig und Probennummer, die analysiert werden soll, z. B. sind 15- oder 29-Zahn-Kämme für die Verwendung mit dem Hoefer Gel-Rig geeignet). Vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen unter die Kammzähne gelangen.
    3. Aushärten lassen. Überwachen Sie auf Leckagen. Die vollständige Polymerisation wird an den Waben durch den Kontakt mit der Atmosphäre verzögert. Wenn die Vertiefungen fest sind, wird der Rest des Gels ausgehärtet.
    4. Entfernen Sie die Waben und spülen Sie unpolymerisiertes Acrylamid mit Wasser und einer Pipette aus.
  4. Bereiten Sie das Gel zum Laufen vor.
    1. Setzen Sie das Cast-Gel in das Gellaufsystem und geben Sie die entsprechende Menge 1x FSME-Laufpuffer in die untere Kammer und in die Gel-Wells. Das Gel kann nun geladen werden.

3. Herstellung des mit His markierten rekombinanten DmWRNexo-Proteins

  1. Bakterielle Expression des DmWRNexo-Proteins
    1. Sammeln Sie mit einer Impfschlaufe Bakterien, indem Sie über die Oberfläche von Glycerinvorräten kratzen, die bei -80 °C gehalten werden (Bakterien sind E. coli T7 Iq LysY (NEB), die mit pIVEX2.3d-DmWRNexo transformiert wurden). Mit 50 μg/ml Ampicillin auf LB-Agarplatten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 15 g Agar aufgefüllt auf 1 L mit destilliertem Wasser und pH-Wert auf 7,4) streichen. Über Nacht bei 37 °C invertiert inkubieren.
    2. Eine einzelne Kolonie von der Platte wird in 50 ml LB (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl bis zu 1 l mit destilliertem Wasser) gegeben, ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin (in Wasser aufbereitet und auf 0,22 μm filtersterilisiert). Grow unter Schütteln bei 220 U/min und 37 °C über Nacht.
    3. 1,8 l (Aliquots à 600 ml in drei 2-l-Kolben, um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten) LB-Ampicillin mit der über Nacht 50 ml Kultur inokulieren und auf OD600 ~ 0,8 aufwachsen. Geben Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,7 mM und inkubieren Sie es bei 26 °C (um eine Proteinaggregation zu verhindern) unter Schütteln für 4-8 Stunden.
    4. Ernten Sie das Zellpellet durch Zentrifugation bei 8.000 U/min 4 °C für 10 min - verwenden Sie 6 x 500 ml sterile Kunststoffzentrifugenflaschen mit je 300 ml Zellsuspension. Überstand entsorgen und das Pellet in einem kleinen Volumen (10 ml) des originalen LB-amp resuspendieren, in ein 15 ml Falcon-Röhrchen umfüllen und dann bei 5.000 U/min erneut drehen, um die Zellen zu pelletieren - den Überstand wieder entfernen und bei -80 °C einfrieren (dies hilft bei der Lyse).
  2. Bakterielle Zelllyse
    1. 3,2 ml Lysepuffer bestehend aus 1 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M DTT, 200 μl 1 M Benzamidin und 1 ml 10 mg/ml Lysozym (resuspendiert in destilliertem Wasser).
    2. Zu jedem Pellet, das aus 300 ml Bakteriensuspension gewonnen wird, werden 320 μl Lysepuffer zugegeben. Resuspendieren Sie so viel wie möglich - verwenden Sie eine abgesägte p1000-Spitze und rühren Sie auf und ab und pipettieren Sie auf und ab. 20 Min. auf Eis inkubieren. Fügen Sie weitere 100 μl Lysepuffer hinzu und mischen Sie gut, dann geben Sie so viel wie möglich des resuspendierten Lysats in ein Mikrofuge-Röhrchen (es wird sehr viskos und schwer zu pipettieren sein).
    3. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 U/min in einem vorgekühlten Mikrofugenrotor bei 4 °C für 30 min und geben Sie dann den Überstand in ein sauberes Mikrofugeröhrchen: Dieses enthält das rekombinante Protein.
  3. Reinigung der His-Falle
    1. Vorbereitung der Reagenzien: Markieren Sie 5 Mikrofuge-Röhrchen für jede der folgenden Konzentrationen von Imidazol: 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM und 500 mM (z. B. Markierung 40-1, 40-2, 40-3 usw.), die zur Sammlung der Säulenfraktionen verwendet werden. Bewahren Sie die Tuben auf Eis in einem Gestell mit offenem Deckel auf (aber locker mit Frischhaltefolie oder ähnlichem abdecken, um sie sauber zu halten, während Sie alles andere vorbereiten). 25 ml Imidazol 20 mM und 10 ml Brühen jeder der anderen Imidazolkonzentrationen in 25 ml Universalröhrchen unter Verwendung von 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, pH eingestellt auf 7,4 und aufgefüllt auf 1 l mit destilliertem Wasser) als Verdünnungsmittel auffüllen.
    2. Das bakterielle Lysat wird unter Verwendung eines geeigneten Volumens von 2 M Imidazol-Stammlösung auf 20 mM Imidazol eingestellt und das Volumen unter Verwendung von 20 mM Imidazol auf mindestens 1 ml (<5 ml) eingestellt.
    3. Eine 1-ml-His-Trap-Säule (Amersham) mit 10 ml MilliQ-Wasser wird mit einer 5- oder 10-ml-Spritze mit Luer-Lock und leichtem manuellem Druck gewaschen und dann die Säule äquilibriert, indem 10 ml 20 mM Imidazol, das in PBS enthalten ist, durchlaufen (siehe Schritt 3.3.1 oben).
    4. Laden Sie das Lysat auf die Säule. Wenn das Lysat auf die Säule geladen wird, kann es zu einem erheblichen Gegendruck kommen. Das ist völlig normal. Lassen Sie sich nicht dazu verleiten, zu viel Kraft auf die Spritze auszuüben und einen gleichmäßigen Druck zu halten. Es ist üblich, eine leichte Farbänderung zu sehen, wenn das Lysat in die Säule eintritt. Den Durchfluss in einer Sterilin-Bijouflasche (7 ml Fassungsvermögen) auffangen und auf Eis lagern.
    5. Waschen Sie die Säule mit 10 ml 20 mM Imidazol und sammeln Sie diese in einem 25-ml-Universalröhrchen auf Eis, das als "Waschen" gekennzeichnet ist.
    6. Geben Sie 5 ml 40 mM Imidazol durch die Säule und sammeln Sie 1 ml Fraktionen in jedes der Mikrofuge-Röhrchen (gekennzeichnet mit 40.1, 40.2, 40.3 usw.): Beobachten Sie den Kolben der Spritze sorgfältig, da dies eine Messung von 1 ml ermöglicht.
    7. Passieren Sie nun nacheinander 5 ml von jeweils 60 mM, 100 mM, 300 mM und 500 mM Imidazol und sammeln Sie erneut 5 x 1 ml Fraktionen bei jeder Salzkonzentration.
  4. Analyse von Säulenfraktionen
    1. Dot Blot: 2 μl jeder Säulenfraktion auf ein Blatt Nitrocellulose aufpolieren (und dabei auch beladen, durchfließen und waschen) - einfacher geht es, wenn dies mit einem weichen Bleistift mit einem Gitter vorgeflochten wird). An der Luft trocknen lassen. Verarbeiten Sie den Dot-Blot, indem Sie 15 min bis 1 h Raumtemperatur in 5 % fettfreier Trockenmilch aus PBS mit 0,2 % v/v Tween 20 blockieren, dann mehrmals in PBS-Tween waschen und mit HRP-Antihis-Antikörpern, verdünnt 1:500 in PBS-Tween, für 30-60 min inkubieren. Waschen Sie ausgiebig mit PBS-Tween und dann PBS und weisen Sie gebundene Antikörper mittels verstärkter Chemilumineszenz (ECL) nach, die auf Hyperfilm MP visualisiert wird. Dieser Dot-Blot gibt eine hervorragende Vorstellung von den Peak-Fraktionen vor der SDS-PAGE-Analyse und kann bei Bedarf in nachfolgende Reinigungsschritte einfließen (z. B. wenn die Proteinstabilität ein Problem darstellt, ist es möglich, Peak-Fraktionen basierend auf den Dot-Blot-Ergebnissen zu bündeln und direkt auf Gelfiltrationssäulen zu laden - siehe Schritt 3.5 unten).
    2. SDS-PAGE: Sammeln Sie 50 μl jeder Säulenfraktion in ein markiertes Mikrofurge-Röhrchen mit 50 μl 2x SDS-PAGE-Ladefarbstoffen (4 % w/v SDS, 20 % v/v Glycerin, 120 mM Tris-HCl pH 6,8 mit 200 mM DTT). Kochen Sie diese Proben 5 Minuten lang bei 95-100 °C (beachten Sie, dass bei Verwendung eines heißen Blocks ohne beheizten Deckel mit einer schmalen Spritzennadel ein kleines Loch in den Deckel jedes Röhrchens gebohrt wird, um zu verhindern, dass die Röhrchen beim Erhitzen "explodieren"). Führen Sie 10 % SDS-PAGE-Minigele mit 10 μl jeder Säulenfraktion durch und färben Sie sie mit Coomassie Brilliant Blue, um die Peakfraktionen und die prozentuale Reinheit des Proteins zu überprüfen. Falls erforderlich, ist es auch möglich, ein Western-Blot für his-markierte Proteine durchzuführen, indem durch SDS-PAGE getrennte Proteine auf Nitrocellulose übertragen werden. Blockieren Sie die Membranen mit 5 % fettfreier Milch in PBS-0,2 % Tween 20, waschen und sondieren Sie sie mit HRP-konjugiertem Anti-His-Antikörper (1:500) wie beim Dot-Blot.
  5. Um die Reinheit zu erhöhen, können die Peakfraktionen aus der His-Trap-Säule gepoolt und auf eine Superdex 75 Gelfiltrationssäule geladen werden, wobei die Elution in zunehmendem Salz erfolgt ist (wie zuvor von Boubriak et al. beschrieben).13 und Mason et al. 14).

4. Nuklease-Assay

  1. Erstellen Sie Arbeitslager aus Substraten.
    1. Verwenden Sie 20 pmol Substrat pro Reaktion (obwohl dies je nach zu beantwortender Fragestellung variiert werden kann), so dass ein geeigneter Arbeitsstock 200 pmol/μl (d. h. 10x) beträgt. Die Arbeitsmaterialien bestehen aus kleinen Volumina von Glühpuffer (10 mM Tris-HCl pH7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl) oder aus 10 mM Tris-HCl pH 7,0 (bis zu pH 8,5, je nach Nuklease) ohne Salz oder EDTA, je nach Enzymsensitivität oder durchzuführendem Assay.
    2. Bei 4 °C und im Dunkeln (in Folie eingewickelt) aufbewahren. Die Substrate halten viele Wochen ohne Verlust der Duplexintegrität oder des Fluoreszenzsignals.
  2. Bestimmen Sie die Exonuklease-Proteinkonzentration durch kolorimetrische Analyse oder UV-Spektrometrie bei Abs260.
    1. In kleinen Aliquots bei -80 °C lagern.
    2. Wenn Proben einmal eingefroren/aufgetaut werden, gehen Sie von einer Proteinfehlfaltungsrate von 5 % aus (oder definieren Sie sie empirisch für jedes zu testende Protein) und passen Sie die Konzentrationen entsprechend an.
    3. Proteine für den Assay der Exonuklease-Aktivität nach zwei Gefrier-/Auftauzyklen verwerfen und den Status des Proteins für jedes Experiment notieren.
  3. Entwerfen, Experimentieren und Erarbeiten von Mastermix-Mengen (MM) für Proben.
    1. Erstellen Sie ein MM, das alle Komponenten enthält, die den zu testenden Proben gemeinsam sind (in der Regel alles außer dem Enzym oder Substrat), um die Variation zwischen den Proben zu verringern.
    2. Berücksichtigen Sie Pipettierfehler bei der Erstellung des MM, z. B. berechnen Sie Volumina für N Proben, indem Sie ausreichend für (N + 0,1N) Proben erstellen.
    3. Richten Sie Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 20 μl/Probe ein, das 1 pmol Enzym und 20 pmol Substrat enthält (als Standard vor der Optimierung - natürlich variieren die Mengen je nachdem, was getestet wird, z. B. ändern Sie die Enzymmenge, wenn die Wirkung der Enzymkonzentration getestet wird). Für DmWRNexo wurde empirisch festgestellt, dass der optimale Puffer für die Nukleaseaktivität 40 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol mit 0,1 mg/ml BSA in molekularbiologischer Qualität enthält.
  4. Richten Sie Reaktionen ein.
    1. Bewahren Sie alle Reagenzien bei 4 °C auf (Eiskübel oder Kryorack).
    2. Mastermix auffüllen und in die entsprechende Anzahl steriler DNase-freier 0,5 ml Mikrofugenröhrchen aliquotieren. Fügen Sie eine No-Enzym-Kontrolle hinzu, um das ursprüngliche Substrat zu visualisieren (nicht degradierte Kontrolle).
    3. Stellen Sie einen Wärmeblock auf die für die Enzymaktivität geeignete Temperatur ein (37 °C mit einem Endzeitpunkt von 30 min war optimal für DmWRNexo, obwohl dies möglicherweise empirisch bestimmt werden muss, indem die Aktivität des ausgewählten Enzyms bei einer Reihe von Temperaturen und Zeiten verglichen wird). Potenzielle Enzyminhibitoren, die häufig in Puffern vorhanden sind, sollten sorgfältig getestet werden (z. B. hemmt EDTA DmWRNexo, ebenso wie überschüssiges ATP14, vermutlich durch Chelatbildung des Mg2+, das für die Nukleaseaktivität entscheidend ist). Es ist zu beachten, dass selbst hohe Konzentrationen von Imidazol (>300 mM) weder die Aktivität des DmWRNexo-Enzyms noch die Fluoreszenz löschen.
    4. Make up STOP-Lösung (80% Formamid, 1x FSME). Dies ist bei 3x. Diese kann bei Bedarf Farbstoffe wie Bromphenolblau enthalten. Bei RT lagern.
      5. Stellen
    5. Sie in der Nähe des Heizblocks Folgendes auf: das/die endgültige(n) Reagenz(e), das/die der Reaktionsmischung hinzugefügt werden soll (in der Regel ein Enzym), eine 1-10-μl-Pipettiererin und Spitzen, einen Timer, ein Kryorack oder einen Eiskübel und eine STOP-Lösung.
  5. Starten Sie die Reaktion.
    1. Stellen Sie den Timer so ein, dass das Enzym in das erste Röhrchen gegeben wird. Setze das Rohr in den Heizblock ein.
    2. Fügen Sie den restlichen Röhrchen in angemessenen Abständen weiterhin Enzym hinzu. (15 Sekunden sind ausreichend für einfache Reaktionen, die nur eine STOP-Lösung erfordern, um abgeschlossen zu werden). In den Hitzeblock stellen, sobald das Enzym hinzugefügt wurde.
  6. Stoppen Sie die Reaktion.
    1. Wenn der Timer die richtige Zeit erreicht hat (z. B. 15 Minuten), geben Sie 10 μl STOP-Lösung in die erste Probe und mischen Sie sie durch Pipettieren. Sofort auf Eis/in das Kryorack legen.
    2. Stoppen Sie die Reaktionen weiterhin in den entsprechenden Zeitintervallen und in der gleichen Reihenfolge, in der sie eingerichtet wurden, so dass jede Reaktion genau die gleiche Inkubationszeit hatte.
  7. Die Proben sind nun bereit, auf das vorbereitete Denaturierungsgel geladen zu werden.
    1. Laden Sie die Hälfte (oder die gesamte) Probe mit Gelladespitzen für ein präzises Pipettieren. Bei den in der Reaktion verwendeten Oligonukleotidkonzentrationen liefert die Hälfte der Reaktion eine gute Ausgabe für die Visualisierung und ermöglicht eine Wiederholung (z. B. wenn das ursprüngliche Gel nicht korrekt läuft).
    2. Es ist zweckmäßig, 1x STOP Lösung, die Farbstoff (z.B. Bromphenolblau) enthält, in eine oder mehrere Bahnen zu laden, um den Lauf des Gels zu überprüfen.
    3. Fluoreszierende Oligonukleotide bekannter Größen können neben den Proben als Größenmarker ausgeführt werden.
  8. Lassen Sie das Gel laufen.
    1. Geben Sie die obere laufende Pufferkammer in das Gelgerät und füllen Sie sie mit laufendem Puffer (1x FSME), wobei darauf zu achten ist, dass die Proben nicht gestört werden. Auf Pufferleckage prüfen.
    2. Schließen Sie das Gel-Rig an eine Stromversorgung an und lassen Sie es 150-200 Minuten lang mit 200 V (konstante Spannung) laufen oder bis der Bromphenolblau-Farbstoff (falls verwendet) etwa zwei Drittel des Weges des Gels erreicht hat (er verläuft etwa auf dem Niveau von 10nt DNA in diesem prozentualen Gel). Überwachen Sie auf Pufferleckagen, die die Trennung verzerren oder verhindern können.
    3. Stoppen Sie das Gel und nehmen Sie es aus dem Laufgerät.

5. Gelanalyse und Bildgebung

  1. Bestimmen Sie die Empfindlichkeit des zu verwendenden Imagers, z.B. kann der Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager die Fluoreszenz von Fluorescein mit einem blauen 473 nm Laser detektieren, wobei die größte Empfindlichkeitseinstellung von F1000 und die kleinste Pixelauslesung (Auflösung) von 50 μm verwendet wird.
  2. Scannen Sie das Gel.
    1. Entfernen Sie vorsichtig die Abstandshalter und eine Gelplatte. Spülen Sie das auf der anderen Gelplatte verbleibende Gel gründlich (aber vorsichtig) ab, um Spuren von ausgefälltem Harnstoff zu entfernen, die sonst den Scanvorgang beeinträchtigen könnten.
    2. Setzen Sie die Platte (mit dem Gel noch anhaften) mit dem Gel nach unten auf die Glasfläche des Gelhalters und setzen Sie sie in den Imager ein. Notieren Sie sich die Koordinaten des Gels auf dem Glas (wenn es nicht die gesamte Oberfläche ausfüllt).
    3. Öffnen Sie die entsprechende Software auf dem angeschlossenen Computer und scannen Sie den notierten Bereich des Scanbereichs, in dem sich das Gel befindet. Verwenden Sie die besten Bedingungen, die wie in Schritt 5.1 ermittelt wurden. Die resultierende Datei ist relativ groß (mehrere MB), aber das Bild kann bei Bedarf zugeschnitten und komprimiert werden.
    4. Speichern und exportieren Sie dann als Datei, die von einer Analysesoftware gelesen werden kann, z. B. als .tiff für die Analyse mit ImageJ.
  3. Analysieren Sie die Daten.
    1. Ein erfolgreicher Exonuklease-Assay führt zu einer sequentiellen Degradation des Substrats entlang des Oligonukleotids in Richtung des Fluorophors, was zu einem charakteristischen leiterartigen Muster von fluoreszierenden DNA-Fragmenten auf dem Gel führt. Spezies mit höherer Beweglichkeit auf dem Gel (die weiter laufen) sind kleiner als das nicht abgebaute Ausgangssubstrat und stellen daher Produkte des Exonuklease-Abbaus dar.
    2. Verwenden Sie das Werkzeug "Gele" in ImageJ, um die relativen Intensitäten der Spezies in jeder Spur in Abhängigkeit von ihrer Mobilität zu quantifizieren, um den Grad der Degradation und damit die Exonuklease-Aktivität in jeder Probe zu bestimmen.

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Ergebnisse

Die in vitro-Analyse der Exonuklease-Aktivität erfordert neben der eigentlichen Analyse eine Reihe von Vorbereitungsschritten. Ein Überblick über die Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

Vor der Durchführung von fluoreszenzbasierten Exonuklease-Assays ist es entscheidend, die Detektion des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Substrats nach Trennung in Harnstoff-Acrylamid-Gelen mithilfe eines geeigneten Fluoreszenz-Bildgebungssystems zu optimieren. Die Wahl des F...

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Diskussion

Die Bestimmung der Exonuklease-Aktivität von gereinigten Proteinen erfordert die Analyse von DNA-Spaltprodukten. Die sequentielle Spaltung der DNA durch Exonukleasen kann durch Trennung von markierten Spaltprodukten auf Acrylamidgelen sichtbar gemacht werden. In der Vergangenheit beinhaltete dies die Endmarkierung des DNA-Substrats mit einer Radiomarkierung (z. B. 32P oder 35S), jedoch mit den Nachteilen, die mit der Verwendung von Radiomarkierung verbunden sind (Kosten, Sicherheitsprobleme...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem ratsübergreifenden New Dynamics of Ageing Programme für die Finanzierung dieser Arbeit [ES/G037086/1] und Prof. Dave Sherratt (Department of Biochemistry, University of Oxford) für den Zugang zum Fuji FLA-3000.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz/Material
Kundenspezifische OligonukleotideEurogentecEs ist notwendig, diese in hoher Reinheit z. B. mit PAGE-Aufreinigung zu erhalten.
5'FLOfluorescein-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 AcrylamidlösungSevern Biotech20-2400-05ACHTUNG: starkes Neurotoxin, daher sollten immer
Handschuhe getragen werdenHis-Trap-Säulen (1 ml)GE Healthcare17-5247-01
Alle anderen Reagenzieneines namhaften LieferantenMolekularbiologische Qualität ist erforderlich (DNase-frei); Mikrofuge-Röhrchen sollten ebenfalls DNase- und RNase-frei
Equipment
Hoefer SE400 GelapparatHoeferSE400-15-1.5
FLA-3000 (Phosphor und Fluoreszenz) imager)Fuji
Image Reader V2.02FujiFilm
Image Gauge V3.3FujiFilm
sein

Referenzen

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DmWRNexo CharakterisierungWRN Exonuklease Aktivit tFluoreszenz DNA SubstratAcrylamid Harnstoff GelFluoreszenzbildgebungNuklease Polarit tsanalyseBestimmung der Prozessivit tSubstratpr ferenzpr fungQuantifizierung der Nuklease Aktivit t
Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren
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