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Methodenartikel

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

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⸱

DOI:

10.3791/50736

⸱

27. September 2013

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University , 2Department of Bioengineering, Stanford University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Methode der Programmierung Stammzellen zu therapeutischen Angiogenese-Faktoren für Überexpression mit biologisch abbaubaren polymeren Nanopartikel. Beschriebenen Verfahren umfassen die Polymersynthese, die Transfektion von Fettgewebe abgeleitete Stammzellen in vitro, und die Validierung der Wirksamkeit der programmierten Stammzellen Angiogenese in einem Maushinterlauf-Ischämie-Modell zu fördern.

Zusammenfassung

Gesteuert Gefäßwachstum ist entscheidend für eine erfolgreiche Geweberegeneration und Wundheilung sowie zur Behandlung von ischämischen Erkrankungen, wie Schlaganfall, Herzinfarkt oder peripheren arteriellen Erkrankungen. Direkte Zustellung von angiogenen Wachstumsfaktoren hat das Potenzial, neue Blutgefäßwachstum zu stimulieren, wird aber oft mit Einschränkungen wie mangelnde Ausrichtung und kurze Halbwertszeit in vivo assoziiert. Die Gentherapie bietet einen alternativen Ansatz durch die Bereitstellung von Genen angiogenen Faktoren kodieren, aber oft mit Viren erfordert, und wird von Sicherheitsbedenken begrenzt. Hier beschreiben wir eine kürzlich entwickelte Strategie zur Stimulierung von Gefäßwachstum durch Programmierung von Stammzellen zur angiogenen Faktoren in situ überexprimieren mit biologisch abbaubaren polymeren Nanopartikel. Insbesondere verwendet unsere Strategie Stammzellen als Lieferfahrzeuge unter Ausnutzung ihrer Fähigkeit, gegen ischämische Gewebe in vivo zu wandern. Mit den optimierten Polymer Vektoren, Fettgewebe gewonneneStammzellen modifiziert, um einen angiogenen Gens vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) kodiert, überexprimiert. Wir beschriebenen Prozesse für die Polymersynthese, die Nanopartikelbildung, Transfektion Stammzellen in vitro, als auch Verfahren zur Validierung der Wirksamkeit der VEGF-exprimierenden Stammzellen zur Förderung der Angiogenese in einem Mausmodell Ischämie der Hintergliedmaßen.

Einleitung

Das Ziel dieser Technik ist die Förderung der therapeutischen Angiogenese mit nicht-viral programmierten Stammzellen Überexpression therapeutischen Faktoren an der Stelle der Ischämie. Stammzellen wurden ex vivo ersten modifizierten mit biologisch abbaubaren Nanopartikel im Labor synthetisiert und in einem Mausmodell der Ischämie der Hintergliedmaßen, um ihr Potenzial zur Verbesserung der Angiogenese und Gewebebergungs validieren dann transplantiert.

Gesteuert Gefäßwachstum ist ein wichtiger Bestandteil erfolgreicher Geweberegeneration sowie zur Behandlung verschiedener ischämischer Erkrankungen, wie Schlaganfall, Ischämie der Extremitäten und Myokardinfarkt. Verschiedene Strategien wurden entwickelt, um das Gefäßwachstum, einschließlich Wachstumsfaktor Lieferung und zellbasierte Therapie zu fördern. 1. Trotz der in den Tierkrankheitsmodellen beobachtete Wirksamkeit sind diese Verfahren immer noch mit Einschränkungen wie die Notwendigkeit für supraphysiologischen Dosen Wachstumsfaktor Lieferung oder unzureichende parakrineFreigabe durch Zellen allein. Eine mögliche Strategie, um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, ist die Stammzelltherapie und Gentherapie, wobei Stammzellen genetisch ex vivo vor der Transplantation programmiert, um wünschenswerte therapeutische Faktoren überexprimieren kombinieren. Dieser Ansatz hat sich in verschiedenen Krankheitsmodellen einschließlich Ischämie der Hintergliedmaßen 2, Herzerkrankungen 3, 4 und Knochenheilung Nervenverletzung 5, etc nachgewiesen. Jedoch beruhen die meisten Gentherapietechniken auf virale Vektoren, die mit Sicherheitsbedenken wie potenzielle Immunogenität und Insertionsmutagenese zugeordnet sind. Biomaterialien vermittelte nicht-viralen Gentransfer kann diese Einschränkungen zu überwinden, aber oft leiden unter niedrigen Transfektionseffizienz. Zur Beschleunigung der Entdeckung von neuartigen Biomaterialien für effiziente nicht-viralen Gentransfer haben neuere Studien kombinatorischen Chemie und Hochdurchsatz-Screening-Ansatz verwendet. Biologisch abbaubare Polymerbibliotheken, wie Poly (β-amino ester) (PBAE) entwickelt und gesiebt, die zur Entdeckung der führenden Polymere mit deutlich verbesserte Transfektionseffizienz im Vergleich zu den herkömmlichen Polymer Vektor Kollegen geführt. 6-7

Hier beschreiben wir die Synthese PBAE und Überprüfung ihrer Fähigkeit, aus Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen (ADSCs) in vitro zu transfizieren, gefolgt von der anschließenden Transplantation von genetisch modifizierten ADSCs überexprimieren, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) in einem Mausmodell der Ischämie der Hintergliedmaßen . Die Ergebnisse wurden durch die Verfolgung Zellschicksal mit Biolumineszenz-Bildgebung, Bewertung Gewebe Reperfusion mittels Laser-Doppler-Perfusion Imaging (LDPI) und Bestimmen der Angiogenese und Gewebebergungs histologisch ausgewertet.

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Protokoll

1. Polymer Synthesis

  1. In einer Abzugshaube, wiegen 3.523 mg Butandiol-(C) und Transfer in ein Glasszintillationsröhrchen enthält einen Rührstab.
  2. Pre-Wärme-5-Amino-1-Pentanol (32) auf 90 ° C, um das Salz löslich zu machen, dann in einem Abzug, wiegen 1.533 mg 32 und zu der Scintillations-Fläschchen mit C. Diese Methode wird in einem Mol-Verhältnis führen C: 32 = 1:1,2.
  3. Sofort die Küvette, die beide Lösungen auf einer Rührplatte. Stellen Rührgeschwindigkeit bei 600 Umdrehungen pro Minute.
  4. Übertragen Sie die Szintillationsfläschchen zu einem Ofen bei 90 ° C eingestellt Eingestellt Rührgeschwindigkeit auf 1000 Upm für 4 Stunden. Wenn der Rührstab stecken bleibt, verringern Sie die Geschwindigkeit. Nach 4 h niedriger Geschwindigkeit auf 300 Upm und halten bei 90 ° C für weitere 12-16 Stunden.
  5. 5 g C32 zu 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) in einem Glasszintillationsröhrchen einen Rührstab enthielt. In Folie wickeln und Wirbel auf High, bis sie vollständig aufgelöst.
  6. In einem separaten Glasszintillationsröhrchen containing einem Rührstab, mit 10 mM Tetraethyleneglycoldiamine (122). 40 ml THF.
  7. Legen Sie beide Fläschchen (C32 und 122) auf einer Rührplatte für 5 min miteinander kombinieren, dann. Decken Sie in der Folie und lassen bei Raumtemperatur unter Rühren bei 400 Umdrehungen pro Minute für 24 Stunden. Das Endprodukt wird als C32-122.
  8. Wiegen Sie 5 x 50 ml-Falcon-Röhrchen für jede Charge von 5 g C32-122. Beachten Sie die Masse jedes Rohr in einem Notebook.
  9. Übertragungs 30 ml wasserfreiem Diethylether zu je 50 ml Falcon-Röhrchen.
  10. Über 10 ml C32-122 zu je 50 ml-Falcon-Röhrchen.
  11. Vortex-Falcon-Röhrchen kräftig dann zentrifugieren bei 2.500 rpm für 2 min. Hinweis: Das extrahierte Polymer wird an der Basis des Röhrchens zu sammeln.
  12. Entsorgen Sie die obere Lösung und wiederholen Sie die Schritte 1.9 und 1.11 zwei weitere Male.
  13. Die offenen Röhrchen mit den extrahierten C32-122 im Exsikkator und Vakuum über Nacht. Sicherstellen, dass alle Rohre vor Licht geschützt.
  14. Wiegen Sie alle Röhrchen, die C32-122, um die endgültige Masse der BestimmungPolymer extrahiert.
  15. Löse das extrahierte Polymer in wasserfreiem DMSO bei einer Konzentration von 100 mg / ml.
  16. Bewahren Sie die gelösten Polymers bei -20 ° C vor Licht und Feuchtigkeit geschützt.

2. Zellaussaat

  1. Vorbeschichtung der Basis eines T-150-Gewebekulturkolben, der mit 0,1% (w / v) Gelatine. Die Gelatine sollte in der Flasche für 30-45 min zu bleiben. Die Gelatine-Beschichtung hilft, Haftung ADSCs.
  2. Saugen Gelatine aus der Vor-beschichtet T-150-Kolben.
  3. Add 4 x 10 6 ADSCs (≤ Gang 3) in den Kolben in 20 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 10 ng / ml bFGF.
  4. Setzen Sie den T-150-Kolben im Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 über Nacht.
  5. Am folgenden Tag beginnen Transfektion Verfahren.

3. Nanopartikel-Herstellung und Transfektion

  1. Das folgende Verfahren ist für die Herstellung von Nanopartikeln enthaltend 16,1 ug Plasmid-DNA pro1,0 x 10 6 Zellen in einer Polymer-Gewichtsverhältnis von 30:1 Plasmid.
  2. Verdünnte Plasmid-DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) zu einer Endkonzentration von 120 ug / ml in Natriumacetatpuffer (25 mM) in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.
  3. Verdünnen C32-122 (100 mg / ml) bis zu einer Endkonzentration von 3,6 mg / ml in Natriumacetatpuffer (25 mM) in einer zweiten 15 ml-Falcon-Röhrchen.
  4. Die Inhalte der einzelnen Falcon-Röhrchen in einem einzigen 15 ml Falcon-Röhrchen und Wirbel sofort auf hoch für 10 sek.
  5. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur stehen lassen für 10 min für die Nanopartikelbildung auftreten.
  6. Während der Inkubation ersetzen Medium in Zellkulturflasche mit 7,8 ml vollständig ergänzt DMEM pro 1,0 x 10 6 Zellen transfiziert.
  7. Übertragen Sie die Nanopartikel-Lösung für die Zellkulturflasche und kippen nach vorne und nach hinten, um gleichmäßig verteilt.
  8. Platzieren der Zellkulturflasche in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Stunden.
  9. Nach 2 Stunden, ersetzen Sie den Nanokel haltigen Medien mit DMEM.
  10. Nach weiteren 2 h Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 werden die Zellen bereit für die in vivo-Injektion.

4. Ischämie der Hintergliedmaßen Ordnung

  1. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Stanford University Animal Care und Verwenden Ausschuss und genehmigt APLAC Protokollen durchgeführt. Die Erzeugung der Mausmodell der Ischämie der Hintergliedmaßen wie zuvor beschrieben durchgeführt. 8 Bitte beachten Sie die Referenz für detaillierte Anweisungen. Eine kurze Beschreibung ist unten angegeben.
  2. Platzieren Sie die Maus unter Anästhesie mit 1-3% Isofluran Dosierung durch Einatmen und Sauerstoffflussrate von 1 l / min. Stellen Sie sicher, Narkosetiefe von Zehen-und Zuziehen, Verringerung der Atemfrequenz, und Lethargie.
  3. Entfernen Sie Haare aus der Bauchregion und den beiden hinteren Gliedmaßen Bereiche der Maus mit Rasierschaum.
  4. Machen Einschnitt in der Mitte der medialen Oberschenkel in Richtung Mittellinie und dann durch darüberliegende Fettpolster Ex geschnittenstellen die Oberschenkelarterie.
  5. Ligation der Arterie an zwei Standorten: distale Stadt (in der Nähe der Knie) und der proximalen Seite (distal des Leistenbandes).
  6. Um die Ligationen zu erstellen, trennen Sie die Arterie von der Vene und Faden 5-0 Seidenfaden um die Arterie. Binden Sie die Arterie mit zwei Knoten, um die Ligation zu machen.
  7. Entfernen Sie die Arterie zwischen den beiden Ligation Punkten.
  8. Mit PBS Waschen Sie den OP-Bereich und dann nähen, der Schnitt geschlossen.
  9. Die Anästhesie kann nun entfernt werden. Halten Sie die Maus warmen, bis Wiedererwachen. Für die postoperative Pflege, 2-4 mg / kg Lidocain subkutan an der Einschnittstelle vor dem Wiedererwachen injiziert werden. Weitere Schmerz-Management kann subkutane Abgabe von 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin bei 12 und 24 Stunden umfassen. Überwachung des Gesundheitsstatus der Mäuse einmal täglich für sieben Tage durch Beobachtung von Veränderungen der Atemmuster, offene Schmerzen oder Leiden und Hautfarbe.
  10. Bestätigen Ischämie der Hintergliedmaßen durch Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebung.

5. Zellinjektionen

  1. Wenn die transfizierten Zellen und die Mäuse sind bereit, waschen transfizierten Zellen mit PBS, trypsinize, Zentrifuge, und dann zählen.
  2. Die Zellen in einer Dichte von 10 x 10 6 Zellen pro ml in PBS.
  3. Zellsuspensionen sollten in einem Volumen von 110 &mgr; l in getrennte Eppendorf-Röhrchen getrennt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass jede Maus erhält eine gleiche Anzahl von Zellen.
  4. Platzieren Sie jede Maus in Narkose (2,5% Isofluran, 1 L / min Sauerstoff-Fluss).
  5. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit Alkoholtupfern.
  6. Mit Hilfe einer 27 G Tuberkulin-Spritze in die Spritze zu ziehen, die Zellen auf und ab, um sicherzustellen, eine homogene Suspension erreicht. Auszuarbeiten 100 ul der Zellsuspensionsvolumen in die Spritze.
  7. Injizieren Sie die Hälfte der Zellsuspension in die Adduktoren-Region und dann zu injizieren, die andere Hälfte in den Wadenmuskel Region. Nach der Injektion, lassen Sie die Spritze in Platz für mindestens 15 bis 30 Sek.ein Austreten der Zellsuspension.
  8. Geeignete Kontrollen für die Tierstudie, die folgenden: 1) Zellen, die mit einem nicht-kodierenden Plasmids (z. B. Plasmid, ohne die biologische Aktivität) transfiziert, 2)-Zellen allein und 3) PBS.
  9. Bei Injektionen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Maus aus der Narkose und warm halten, bis die Maus wieder erwacht.

6. Biolumineszenz-Imaging

  1. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) beginnen, zu betäuben Mäuse wie oben beschrieben.
  2. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit Alkoholtupfern.
  3. Verwendung Insulinspritze, Last 100 ul 15 mg / ml D-Luciferin (Substrat für Luciferase). Halten Substrat weg vom Licht.
  4. Um intraperitoneale Injektionen durchführen, halten Mäuse durch die Haut ihrer zurück zu ziehen, ihre vorderen Haut straff. Setzen Sie die Nadel intraperitoneal in der Bauchregion und injizieren 100 ul Substrat.
  5. Legen Sie die Maus in die Luciferase IVIS Imaging-Kammer unter Narkose.
  6. Bild der Mäuse mit einer Belichtungszeit von 1,0 min. Wenn Parameter eingestellt sind, beginnen, um Bilder zu erwerben.
  7. Wenn das Bild erworben, markieren Sie den Bereich von Interesse, um die Luciferase-Signal zu messen. In diesem Fall kennzeichnen die ischämische Extremität an der Zellinjektionsstelle.
  8. Weiterhin die Luciferase-Signal messen jede 3-5 min, bis das Signal einen Spitzenwert erreicht und beginnt zu sinken. Dies ist der für den Vergleich zwischen Mäusen und über mehrere Zeitpunkte genutzt Wert.
  9. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Mäuse aus der Kammer und Anästhesie. Halten Mäuse warmen, bis Wiedererwachen.

7. Laser Doppler Perfusion Imaging

  1. Laser-Doppler-Perfusions-Bildgebung wird wie zuvor beschrieben durchgeführt. 8 Das Verfahren wird hier kurz beschrieben.
  2. Vor der Doppler-Bildgebung der Maus sollte in den Bereichen, die über beide Hinterbeine und die Bauchregion zu Artefakt wegen Haar verhindern sauber rasiert sein.
  3. Bei den Doppler-Bild erstellt, das mouse sollte, wie oben beschrieben narkotisiert.
  4. Wärmen Sie die Maus, um 36 ° C auf einer heißen Platte, während Überwachung der Körpertemperatur durch rektale Thermometer.
  5. Platzieren Sie die Maus auf einer nicht-reflektierenden schwarzen Oberfläche und halten narkotisierten von Nasenkegel. Die Maus sollte sich auf seine Rückenfläche mit seinen Gliedmaßen gleichmäßig ausgesetzt platziert werden.
  6. Positionieren der Laser-Doppler-Sensor etwa 15 cm über die Maus und das Laserzeiger von dem Sensor in Richtung der Leistenregion der Maus.
  7. Wenn die Maus und die Doppler-Sensor in Position sind, können die Bilder unter Verwendung der Software LDPIwin durch Drücken der Start-Taste getroffen werden.
  8. Relative Perfusionsmessungen könnte durch Angabe beider Hinterbeine (ischämischen und nicht-ischämischen) als Region of Interest (ROI) entnommen werden. Das Verhältnis von Durchschnittsdurchblutung des ischämischen dem nicht-ischämischen Hinterlauf wird zeigen die relative Durchblutung.

8. Tissue Ernteverfahren

  1. Bei der Ernte der Maus tis vorbereitetverklagen, für die Histologie und / oder biochemischen Verarbeitung sollte die Maus eingeschläfert werden. Hier wird die Maus durch Aussetzen zu 5% Isofluran für 3-5 min, dann euthanizing die Maus durch zervikale Dislokation getötet.
  2. Schneiden Sie die darüber liegende Haut der Hinterlauf umgebenden Umfangsrichtung am distalen und proximalen Bauchregion an der Hintergliedmaße. Die Haut wird von der ventralen zur dorsalen Flächen geschnitten, so dass die Haut kann wieder über den Hinterlauf an den Fuß gezogen werden.
  3. Beim Ziehen der Haut zurück, konnte die Gliedmaße durch die Verwendung einer Schere stumpf an der Becken-und Oberschenkelgelenk geschnitten amputiert werden.
  4. Zwei Haupt Gewebe werden zur Analyse entnommen: die medialen Adduktoren und die Wadenmuskulatur.
  5. Für die Histologie für Kryoschneiden einbetten einen oder beide Gewebe im optimalen Schneidtemperatur (OCT).
  6. Für die biochemische Analyse, sammeln eine oder beide Gewebe in einem 1,5 ml Eppendorf und tauchen in ein Bad aus flüssigem Stickstoff für mindestens 2 min. Die Proben könnenbei -80 ° C zur weiteren Verarbeitung gespeichert.

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Ergebnisse

Beim Vermischen der positiv geladenen Polymer (C32-122) und negativ geladenen DNA-Plasmid Selbstorganisation in Nanopartikel. Nanopartikelbildung kann durch Elektrophorese-Analyse bestätigt werden, dh die Komplexbildung zwischen C32-122 und Plasmid-DNA wird die Mobilisierung der DNA während der Elektrophorese zu verhindern. Das Polymer dient als Transfektionsreagenz um eine verbesserte Aufnahme von DNA in die Zielzellen und die anschließende Expression der Proteine ​​kodiert (Fig. 2) zu erleich...

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Diskussion

Hier berichten wir über eine Methode, um adulte Stammzellen zu programmieren, um therapeutische Faktoren überexprimieren mit nicht-viralen, biologisch abbaubare Nanopartikel. Diese Plattform ist besonders nützlich zur Behandlung von Krankheiten, bei denen Stammzellen natürlich Hause kann, wie Ischämie und Krebs. 9-10 Ferner erlaubt die nicht-virale Gen-Abgabeplattform für transiente Überexpression von therapeutischen Faktoren, die für die meisten Geweberegeneration und Wunde Heilungsprozesse. Transfektionspro...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich bei American Heart Association Nationale Entwicklung Scientist Grant (10SDG2600001), Stanford Bio-X Interdisziplinäre Initiative Program und Stanford Medical Research Program Wissenschaftler für die Finanzierung bestätigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMInvitrogen11965
Fötales RinderserumInvitrogen10082
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15070
Basischer Fibroblasten-WachstumsfaktorPeprotech100-18B
1,4-Butandiol-Diacrylat (90 %)Sigma Aldrich411744Akronym: C
5- Amino-1-pentanol (97 %)Alfa Aesar2508-29-4Akronym: 32
Tetraethylenglycoldiamin > 99 %)Molecular Biosciences17774Akronym: 122
Sodium AcetateG-BiosciencesR010
Phosphate Buffered SalineInvitrogen14190-144
Tetrahyofuran wasserfrei (> 99.9 %)Sigma Aldrich401757
Diethylether wasserfrei (> 99 %)Fisher ScientificE138-4
DMSO wasserfrei (> 99,9 %)Sigma Aldrich276855
GelatineSigma AldrichG9391
Trypsin-EDTAInvitrogen25200
D-LuciferinGoldBio
Optimale Schnitttemperatur (O.C.T)Tissue-Tek4583
Ratte Anti-Maus CD31BD Pharmingen550274
Alexa Fluor 594 Anti-Ratten-IgGInvitrogenA11007

Referenzen

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