Enteric bakterielle Invasion von intestinalen Epithelzellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Ist erheblich verstärkt unter Verwendung eines vertikalen Diffusion Chamber Modell

Zusammenfassung

Durchführen Zellkultur-Assays zur Untersuchung von bakteriellen Adhäsion und Invasion unter aeroben Bedingungen in der Regel nicht repräsentativ für die In vivo Umwelt. Eine Vertikale Diffusion Chamber Modell ermöglicht Untersuchung der Wechselwirkungen des menschlichen Erreger Campylobacter jejuni Mit intestinalen Epithelzellen unter mehr In vivo-Ähnlichen Bedingungen, was zu einer erhöhten bakteriellen Invasion.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Wir haben ein in vitro-Modell der Infektion, die Kokultur von Bakterien und Wirtszellen ermöglicht unter verschiedenen mittel-und Gas-Bedingungen entwickelt. Die vertikale Diffusion Chamber (VDC) Modell imitiert die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien unter Bedingungen mit sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe sein wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Platzieren polarisiert intestinalen Epithelzellen (IEC) in Monoschichten Snapwell Einsätze in einer VDC gewachsen erstellt separate apikalen und basolateralen Kompartimenten. Basolateralen Kompartiment mit Zellkulturmedium gefüllt, verschlossen und mit Sauerstoff durchströmt während die apikale Fach mit Brühe gefüllt ist, offen gehalten und inkubiert unter mikroaeroben Bedingungen. Sowohl Caco-2 und T84 IECs können im VDC unter diesen Bedingungen ohne ersichtlichen nachteilige Auswirkungen auf das Überleben der Zelle oder Monoschicht Integrität beibehalten. Cokultivierung Experimente mit verschiedenen C durchgeführt jejuni Wildtyp-Stämme und unterschiedliche IEC Linien in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer reproduzierbar in einer Erhöhung der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen führen ^1. Das Umfeld, in dem VDC-Modell erstellt mehr imitiert die Umwelt durch C. angetroffen jejuni im menschlichen Darm und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro Infektion Assays unter Bedingungen, die stärker die in vivo Realität zu imitieren. Wir schlagen vor, dass die Verwendung des VDC-Modell ermöglicht neue Interpretationen der Wechselwirkungen wettenween bakterielle Erreger und Wirtszellen.

Einleitung

Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Mit solchen Zellkulturassays, bakterielle Adhäsion an Wirtszellen, die Identifizierung von Wirtszellen Rezeptoren Wirtszelle Signalwege und Bakterienbefall von Wirtszellen sind alle im Detail untersucht, was in vielen wichtige Beobachtungen. Jedoch sind solche Zellkultur-Assays werden unter aeroben Bedingungen, die nicht repräsentativ für die in vivo-Umgebung kann durchgeführt. Eine wesentliche Einschränkung der in-vitro-Modellen verwendet werden, um Magen-Darm-Infektionen zu studieren, ist, dass die Kultur Bedingunge....

Protokoll

1. Das Wachstum der IEC Monoschichten auf Spezial 0,4 um Filter

1. Kultur Caco-2-Zellen in modifiziertem essentiellen Dulbecco (DMEM) mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren in einem ergänzt Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C in 5% CO ₂ und 95% Luft. Seed 4 x 10 ⁵ Caco-2 IECs pro 0,4 um Filter zu wachsen Polarisation über 21 Tage, die Änderung der Medien alle 2-3 Tage.
2. Messen Sie den TEER der Polarisation Status der Monoschicht mit einem Volt-Ohm-Widerstand Meter bestätigen. In unseren Studien, die TEER von 21 Tage Caco-2-Zellen in....

Ergebnisse

Cokultivierung Experimente mit einer C durchgeführt jejuni Wildtypstamm und IECs in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer einen Anstieg in der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen in einem Zeitpunkt nachgewiesen -abhängigen Weise ^1. Diese Beobachtung war reproduzierbar mit zwei verschiedenen C. jejuni Wildtypstämmen (11168H und 81-176) und zwei verschiedene IEC-Leitungen .......

Diskussion

Die Verwendung von in vitro-Zellkultur Methoden, um die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen zu studieren, ist eine Technik, die weit verbreitet in vielen Forschungslabors eingesetzt. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Die weit verbreitete Infektion in vitro Modelle sind besonders ungeeignet für das Studium mik.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Spezielles vertikales Diffusionssystem für die Verwendung mit Snapwell-Einsätzen	Harvard Apparatus	66-0001	Verteiler & sechs Snapwell-Kammern
Kappen	Harvard Apparatus	66-0020
O-Ringe	Harvard Apparatus	66-0007
Klemmen	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell-Filter (Porengröße 0,4 μ m)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm Widerstandsmessgerät	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II Spektralphotometer	Biochrom	80-3003-72