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Methodenartikel

Geschlechtsstratifizierte neuronale Kulturen zur Untersuchung des ischämischen Zelltods

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DOI:

10.3791/50758

⸱

9. Dezember 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado School of Medicine, 2Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University, 3Department of Pharmacology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Primär disassoziierte embryonale Hippocampus-Neuronalkulturen sind nützlich, um die Signalmechanismen zu untersuchen, die am Neuronentod beteiligt sind. Die Geschlechtsbestimmung der Embryonen vor der Isolierung und Dissoziation des Hippocampus ermöglicht die Herstellung separater männlicher und weiblicher Kulturen, was es dem Forscher ermöglicht, geschlechtsspezifische Zellsignale zu identifizieren und zu untersuchen.

Zusammenfassung

Geschlechtsunterschiede in der neuronalen Anfälligkeit für ischämische Verletzungen und neurodegenerative Erkrankungen wurden schon lange beobachtet, aber die Signalmechanismen, die für diese Unterschiede verantwortlich sind, bleiben unklar. Die primäre disassoziierte embryonale neuronale Kultur bietet ein vereinfachtes experimentelles Modell, mit dem die neuronale Zellsignalgebung untersucht werden kann, die am Zelltod als Folge von Ischämie oder Krankheit beteiligt ist; Die meisten neuronalen Kulturen, die heute in der Forschung verwendet werden, sind jedoch gemischtgeschlechtlich. Forscher können die Auswirkungen der Behandlung mit Sexualsteroiden in gemischtgeschlechtlichen neuronalen Kulturen in Modellen für neuronale Verletzungen und Krankheiten testen und tun dies auch, aber immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass das weibliche Gehirn anders auf Androgene, Östrogene und Progesteron reagiert als das männliche Gehirn. Darüber hinaus reagieren männliche und weibliche Nagetiere bei Neugeborenen unterschiedlich auf ischämische Verletzungen, wobei Männchen nach zerebraler Ischämie stärkere Verletzungen erleiden als Weibchen. Gemischtgeschlechtliche neuronale Kulturen könnten also die experimentellen Ergebnisse verschleiern und verwirren; Wichtige Informationen könnten übersehen werden. Aus diesem Grund präpariert das Herson Lab an der University of Colorado School of Medicine routinemäßig geschlechtsstratifizierte primäre, disassoziierte embryonale neuronale Kulturen sowohl aus dem Hippocampus als auch aus dem Kortex. Die Embryonen werden vor der Entnahme von Hirngewebe geschlechtlich bestimmt, und männliches und weibliches Gewebe werden getrennt voneinander getrennt, separat plattiert und getrennt aufbewahrt. Mit dieser Methode hat das Herson Lab eine männchenspezifische Rolle des Ionenkanals TRPM2 beim ischämischen Zelltod nachgewiesen. In diesem Manuskript teilen und diskutieren wir unser Protokoll für die Geschlechtsbestimmung embryonaler Mäuse und die Vorbereitung geschlechtsstratifizierter primärer disassoziierter Neuronenkulturen im Hippocampus. Diese Methode kann angepasst werden, um geschlechtsstratifizierte kortikale Kulturen zu präparieren, und die Methode zur Geschlechtsbestimmung von Embryonen kann in Verbindung mit anderen Protokollen für jede Studie verwendet werden, in der das Geschlecht als wichtige Determinante des Ergebnisses angesehen wird.

Einleitung

Säugetiere sind sexuell dimorph, wobei Männchen und Weibchen unterschiedliche Merkmale und Merkmale aufweisen. Geschlechtsunterschiede erstrecken sich sogar auf das Gehirn und zeigen sich in der neuronalen Anfälligkeit für Verletzungen und Krankheiten (überprüft in1-5). Zum Beispiel ist das männliche Gehirn anfälliger für ischämische neuronale Verletzungen durch Schlaganfall oder Herzstillstand, gefolgt von einer Wiederbelebung (überprüft in6). Die Parkinson-Krankheit (überprüft in7) und Schizophrenie (überprüft in8) sind bei menschlichen Männern häufiger als bei Frauen, während das weibliche menschliche Gehirn anfälliger für die Alzheimer-Krankheit (überprüft in9) und Stimmungsstörungen wie Depressionen (überprüft in10) zu sein scheint. Trotz beobachtbarer Unterschiede zwischen den Geschlechtern in der Anfälligkeit für neuronale Verletzungen und Krankheiten berücksichtigen die meisten aktuellen Behandlungsparadigmen das Geschlecht nicht und sind sowohl bei Männern als auch bei Frauen ähnlich. Ein größerer Erfolg könnte erzielt werden, wenn geschlechtsspezifische Unterschiede berücksichtigt und verstanden würden.

In vivo Tiermodelle für neuronale Verletzungen und Krankheiten zeigen einen ähnlichen Sexualdimorphismus wie beim Menschen und sind entscheidend für unser Verständnis von Geschlechtsunterschieden und wie diese Unterschiede zum Überleben und zur Funktion der Neuronen beitragen. Es gibt beispielsweise Hinweise darauf, dass männliche Nagetiere anfälliger für ischämische neuronale Schädigungen sind als weibliche11-15. Es wird angenommen, dass dieser Unterschied zumindest teilweise von der molekularen Signalübertragung von Testosteron, dem primären männlichen Sexualsteroidhormon, und Östrogen, dem primären weiblichen Sexualsteroidhormon, abhängt. Studien mit gonektomierten männlichen und weiblichen Nagetieren zeigen, dass Testosteron und der Testosteronmetabolit Dihydrotestosteron (DHT) die neuronale Schädigung nach zerebraler Ischämie verschlimmern und Östrogen verringern12-14,16-18. Geschlechtsunterschiede bei zerebraler Ischämie sind jedoch sowohl bei neugeborenen als auch bei erwachsenen Tieren vorhanden19,20. Neugeborene erleben während der Entwicklung einen Anstieg des Östrogenspiegels oder des Testosterons in der Gebärmutter, haben aber nach der Geburt bis zur Pubertät einen relativ niedrigen Hormonspiegel (überprüft in21). Das Vorhandensein oder Fehlen von primärem Sexualhormon ist also nicht die einzige Determinante der geschlechtsbeeinflussten neuronalen Anfälligkeit für Verletzungen. In der Tat ist es wahrscheinlich, dass während der Entwicklung sexuelle Dimorphismen etabliert werden, die zu Unterschieden in der Zellsignalisierung und der Reaktion auf Ischämie führen, selbst wenn der Hormonspiegel niedrig ist.

Unabhängig davon, ob Geschlechtsunterschiede vom Vorhandensein von Sexualsteroidhormonen abhängen oder ob sie auf Dimorphismen zurückzuführen sind, die während der Entwicklung etabliert wurden, wird mit weiteren Studien klar, dass es Unterschiede in der Zellsignalisierung zwischen Männern und Frauen im Gehirn gibt. Im Herson Lab an der University of Colorado School of Medicine haben wir einen solchen Unterschied identifiziert. Wir haben herausgefunden, dass der Kalzium-, Natrium- und Kalium-permeable Ionenkanal TRPM2 (überprüft in22,23) den neuronalen Zelltod nach ischämischer Insult in vivo bei der männlichen, aber nicht bei der weiblichen Maus induziert24. Wir zeigen, dass die pharmakologische Hemmung oder der genetische Knockdown von TRPM2 bei der männlichen, nicht aber bei der weiblichen Maus in unserem in vivo Modell des arteriellen Verschlusses der mittleren Halsschlagader (MCAO) des Schlaganfalls24 schützend ist.

Trotz ihrer Nützlichkeit können in vivo Tiermodelle für ischämische neuronale Schädigungen zeitweise für molekulare Studien des neuronalen Todes eingeschränkt sein, aufgrund der Schwierigkeit oder Unfähigkeit, Neuronen spezifisch für die Untersuchung ins Visier zu nehmen. Aus diesem Grund verwendet unser Labor in vitro primäre, disassoziierte kortikale oder hippokampale Neuronen, um unsere in vivo-Arbeit zu ergänzen. Primär disassoziierte Neuronenkulturen stellen ein nützliches Werkzeug dar, um die zellulären Signalwege zu untersuchen, die an neuronalen Verletzungen und Krankheiten beteiligt sind. Neuronen in Kultur können in einer streng kontrollierten Umgebung gehalten werden, mit oder ohne Gliaeingabe. In Abwesenheit von Gliazellen sind alle in Kultur beobachteten Reaktionen neuronal. Pharmakologische Wirkstoffe können der Kultur verabreicht werden, ohne dass Bedenken hinsichtlich der Absorption über die Blut-Hirn-Schranke bestehen, was die Hemmung oder Aktivierung bestimmter Komponenten eines bestimmten Signaltransduktionswegs ermöglicht. In der Molekularbiologie können verschiedene Proteine von Interesse überexprimiert oder umgeschaltet werden, und es können elektrophysiologische Messungen an einzelnen Zellen durchgeführt werden, was in einem In-vivo-Modellsystem nicht möglich wäre.

Das Herson Lab erweitert die Nützlichkeit primärer dissoziierter neuronaler Kulturen, indem es zuerst die Geschlechtsbestimmung der Embryonen vornimmt, die zur Vorbereitung der Kulturen verwendet wurden. Männliche und weibliche, geschlechtsstratifizierte Neuronenkulturen zeigen deutlich, dass männliche Neuronen anfälliger als weibliche Neuronen für den neuronalen Zelltod nach Sauerstoff- und Glukosemangel sind25. Sauerstoff- und Glukosemangel ist ein akzeptiertes In-vitro-Modell der neuronalen Ischämie, da die Ischämie die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Glukose im Gehirn verringert. Darüber hinaus haben wir mit elektrophysiologischen Experimenten an disassoziierten, geschlechtstratifizierten Neuronen gezeigt, dass TRPM2 in männlichen, aber nicht in weiblichen Neuronen aktiviert ist24,26. Wir untersuchen derzeit die molekularen geschlechtsspezifischen Regulatoren der TRPM2-Aktivität24,26. Hier teilen und diskutieren wir unser Protokoll zur Etablierung von primär embryonalen disassoziierten Hippocampus-Neuronenkulturen und präsentieren repräsentative Daten mit dieser Methode, die darauf hindeuten, dass das DNA-Reparaturenzym PARP-1 auf geschlechtsspezifische Weise ähnlich wie TRPM2 zum ischämischen Zelltod beiträgt. PARP-1 wird durch DNA-Bruch aufgrund von oxidativem Stress aktiviert (überprüft in27,28). Wenn die DNA-Schäden minimal sind, verbessert die PARP-1-Aktivität das Überleben der Zellen, aber wenn die Schädigung übermäßig ist, verschlimmert eine erhöhte PARP-1-Aktivität den Zelltod. PARP-1 produziert Poly-(ADP)ribose, einen bekannten Aktivator des TRPM2-Kanals28-31, und einige Hinweise deuten darauf hin, dass PARP-1 bevorzugt im männlichen, aber nicht im weiblichen Gehirn als Reaktion auf oxidativen Stress aktiviert wird32,33. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass PARP-1 TRPM2 bei Männern, aber nicht bei Frauen aktiviert, was den neuronalen Zelltod als Reaktion auf Sauerstoff- und Glukosemangel induziert.

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Protokoll

Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden gemäß den Richtlinien des National Institute of Health für die ethische Behandlung und Pflege von Tieren und gemäß einem genehmigten IACUC-Tierverwendungsprotokoll durchgeführt.

1. Vorbereitung von Gewebekulturschalen, Nährmedien und Sezierinstrumenten, die mindestens einen Tag vor der Dissektion durchgeführt werden

sollen
  1. Bereiten Sie 1 l Boratpuffer vor: 3,1 g/l Borsäure und 4,75 g/l Borax in doppelt destilliertem H2O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,4 ein. Filtersterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
  2. Poly-D-Lysin auf 0,1 mg/ml verdünnen.
    1. Legen Sie unter einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube genügend verdünntes Poly-D-Lysin, um den Boden jeder Vertiefung einer kulturbehandelten, sterilen Gewebekulturplatte mit mehreren Vertiefungen großzügig zu bedecken. (Falls gewünscht, können vor der Zugabe von Poly-D-Lysin vorgereinigte, sterile Glasabdeckfolien auf den Boden jeder Vertiefung gegeben werden. Deckgläser können nach der Zugabe von Poly-D-Lysin schwimmen, daher sollten sie bei Bedarf mit einer sterilen Pinzette nach unten gedrückt werden.)
    2. Inkubieren Sie die Platten über Nacht im Inkubator bei 37 °C.
  3. Bereiten Sie 1 l Dissektionspuffer vor: 350 mg/l NaHCO3, 2,38 g/l HEPES, 1,44 g/l MgSO4 und 300 mg/l BSA in 1x Hanks Balanced Salt Solution ohne Ca, Mg, Natriumpyruvat oder Phenolrot. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein. Filtersterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
  4. Bereiten Sie 500 ml Plattierungsmedium vor: 10 % fötales Rinderserum, je 100 Einheiten/ml Penicillin und Streptomycin und 2,5 mM Glutamin in MEM ohne Phenolrot. Filter-sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern. Entsorgen Sie unbenutzte Medien nach 1 Monat.
  5. Bereiten Sie 500 ml Fütterungsmedium vor: 2% B-27-Ergänzung, je 100 Einheiten/ml Penicillin und Streptomycin und 2,0 mM GlutaMAX (kein Glutamin) in Neurobasal ohne Phenolrot. Filter-sterilisieren. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern. Restliches Futtermedium nach 1 Monat entsorgen.
  6. Bereiten Sie je nach Bedarf 10 ml 100 mM CaCl2, 500 mM EDTA und 1 M NaOH nach Standardmethoden vor.
  7. Autoklavieren Sie die Operations-/Sezierinstrumente und lagern Sie sie bis zur Verwendung unter sterilen Bedingungen. Dieses Verfahren erfordert zwei scharfe, extrafeine abgewinkelte Pinzetten, eine gebogene Pinzette mit feiner Spitze, eine gezackte, gebogene Pinzette, eine kleine Zange mit Rattenzähnen, eine mikrochirurgische Schere, eine feine chirurgische Schere mit schmaler Spitze, eine Schere mit mittlerer Spitze und eine Dissektionssonde mit stumpfem Ende. Zusätzliche sterile Instrumente können je nach persönlichem Vorlieben hinzugefügt werden.

2. Vorbereitung von Gewebekulturschalen, Nährmedien, Präparierinstrumenten und Präparierbereich, die am Tag der Dissektion durchgeführt werden sollen

  1. Waschen Sie die mit Poly-D-Lysin beschichteten Gewebekulturplatten. Unter der Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank wird das Poly-D-Lysin mit einer Vakuumleitung oder Pipette aspiriert, Wasser in jede Vertiefung gegeben und ~5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Saugen Sie das Wasser an und ersetzen Sie es durch sauberes, steriles Wasser. 3x wiederholen.
    1. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur vollständig trocknen.
  2. Bereiten Sie den Sezierbereich vor, indem Sie die Theke und das Sezierfernrohr mit 70 % Ethanol abwischen.
    1. Tränken Sie einen großen Kimwipe mit 70 % Ethanol und legen Sie die autoklavierten Sezierwerkzeuge aus. Mit einem weiteren Kimwipe abdecken.
    2. Füllen Sie eine große, flache Schüssel mit Eis. Beschriften und befüllen Sie eine entsprechende Anzahl von 60-mm-Kulturschalen mit Kaltdissektionslösung. Bereiten Sie genügend Gerichte vor, um die männlichen und weiblichen Köpfe, Gehirne und Hippocampus getrennt zu halten (falls zutreffend).
    3. Füllen Sie zwei größere 100-mm-Kulturschalen mit Kaltdissektionspuffer.
    4. Eine separate 100-mm-Schale ohne Puffer (trocken) beiseite stellen.
    5. Einrichtung eines Bereichs für biologisch gefährliche Abfälle und eines weiteren für tierisches Gewebe (das nach der Sektion gemäß den institutionellen Standards ordnungsgemäß zu entsorgen ist).
  3. 30 ml Beschichtungsmedium in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Diese warme Lösung wird in der Zelldissoziationsphase des Protokolls verwendet.
  4. Geben Sie 1 ml Beschichtungsmedium in jede Vertiefung der 24-Well-Gewebekulturplatte, die mit Poly-D-Lysin beschichtet ist. Verwenden Sie ein entsprechend kleineres Volumen, wenn kleinere Platten verwendet werden. Die abgedeckte Platte wird in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 gestellt, um sich während der Dissektion zu erwärmen und mit dem CO2 auszugleichen.
  5. Bereiten Sie die Papain-Lösung vor.
    1. Beschriften Sie zwei sterile konische 15-ml-Röhrchen, eines als "männlich" und das andere als "weiblich".
    2. Geben Sie in jedes Röhrchen Folgendes: 10 ml Dissektionspuffer, 150 μl 100 mM CaCl2, 10 μl 500 mM EDTA, 10 μl 1 M NaOH und 150 U Papain.
    3. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Tube dreimal umdrehen und dann in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Hinweis: Jede Durchstechflasche Papain hat eine andere Aktivitätseinheit pro mg Papain, daher ist die Menge an Papain, die der Lösung zugesetzt wird, von Durchstechflasche zu Durchstechflasche unterschiedlich. Das Papain wird anfangs trüb sein, aber die Lösung wird klar, wenn sich das Papain vollständig auflöst.

3. Entnahme, Geschlechtsbestimmung und Dissektion von E18-Embryonen

  1. Betäuben Sie die schwangere weibliche Maus mit Isofluran oder einer anderen geeigneten Anästhesie. Euthanasieren Sie die Maus unter tiefer Betäubung durch Enthauptung oder Gebärmutterhalsluxation.
  2. Reinigen Sie den Bauch des Weibchens schnell mit 70 % Ethanol. Auf Wunsch kann der Bauch rasiert werden, bevor er mit Ethanol besprüht wird, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Heben Sie die Bauchhaut mit der Rattenzahnzange an. Machen Sie mit der mittelgroßen Schere einen großen Schnitt in den Bauch, schneiden Sie durch Haut und Bauchmuskeln und legen Sie die inneren Organe frei.
  3. Entnehmen Sie die Embryonen vorsichtig, indem Sie jedes gesamte Gebärmutterhorn vom Bauch entfernen, wobei Sie darauf achten sollten, dass es nach Möglichkeit nicht mit äußerem Gewebe in Berührung kommt (um eine Kontamination zu vermeiden). Legen Sie die Gebärmutterhörner mit den Embryonen in eine Schale mit Kaltdissektionskochsalzlösung und legen Sie sie auf Eis.
  4. Entferne jedes Jungtier vorsichtig aus den Gebärmutterhörnern und dem Embryonalsack. Die Jungtiere sind zerbrechlich, daher ist es am besten, das Gebärmuttergewebe zwischen jedem Embryo zu durchtrennen, um den Embryonalsack freizulegen, und dann den Sack vorsichtig mit der Kante der kleinen, schmalen Schere auf der Oberfläche aufzuschneiden. Die Embryonalflüssigkeit und das Jungtier können dann sanft durch die Öffnung geschoben werden, ohne den Embryo zu beschädigen.
    1. Wenn der Schnitt im Embryonalsack nicht groß genug ist, damit die Flüssigkeit und das Jungtier leicht herauskommen können, vergrößern Sie den Schnitt vorsichtig, bis das Jungtier mit minimaler Kraft herausgleitet.
    2. Drücken Sie den Sack nicht zu stark zusammen, um den Embryo herauszudrücken, da dies die Embryonen ebenfalls beschädigen könnte.
  5. Entferne den Kopf von einem einzelnen Embryo. Lassen Sie den Kopf in einer Schüssel mit Präpariersalzlösung auf Eis. Legen Sie den Körper des Embryos auf den Rücken auf die trockene 100-mM-Schale unter das Präparierzielfernrohr. Mit der gebogenen Zange mit mittlerer Spitze in der einen Hand und der gezackten, gebogenen Pinzette in der anderen Hand drücken Sie den Welpen vorsichtig flach, indem Sie die Hinterbeine nach unten und ventral, die Vorderbeine nach unten und dorsal drücken.
  6. Entfernen Sie den Schwanz gegebenenfalls mit einer Schere, da der Schwanz dazu neigt, sich über den Bauch zu kräuseln und der Dissektion im Weg stehen kann.
  7. Lösen Sie die Hinterbeine und kneifen Sie den Bauch an der Wurzel der Nabelschnur, dem Nabel, zusammen. Heben Sie es sanft an. Lassen Sie die Vorderbeine los und machen Sie mit der anderen Hand und der Mikroschere ein kleines umgekehrtes "v" in den Bauch direkt über dem Nabel, wobei die Spitze des "v" auf den Schädel zeigt.
  8. Tauschen Sie die Schere wieder gegen die gebogene Pinzette aus. Drehen Sie die Pinzette so um, dass die Spitze nach oben und vom Tier weg zeigt. Mit sanfter Kraft den Brustkorb mit der geschlossenen, abgerundeten Kante der gebogenen Pinzette nach unten und dorsal drücken, während Sie mit den anderen Pinzetten nach unten und ventral ziehen und den Welpen ventral nach dorsal spreizen. Diese Spreizbewegung öffnet die Bauchhöhle und legt den Darm, die Leber und andere innere Organe frei.
  9. Schieben Sie mit der gebogenen Pinzette den Darm und die Leber mit wiederholten Schwungbewegungen ganz sanft nach vorne. Dadurch werden nach und nach die Nieren, die Blase und vor allem die inneren Geschlechtsorgane freigelegt.
    1. Männliche Jungtiere sind an den quergestreiften Hoden zu erkennen, die sich auf jeder Seite direkt unter den Nieren befinden. Die Hoden sind etwa 1/3-1/2 so groß wie die Nieren und liegen gelegentlich knapp über der Blase.
    2. Weibchen sind am ehesten an einem Mangel an Hoden zu erkennen, können aber auch an der kleinen Gebärmutter identifiziert werden, die über der Blase sitzt, und den Eileitern, die sich bis zu den Nieren erstrecken. Unter hoher Leistung im Dissektionsbereich können die Eierstöcke auch als kleine, dunkle Organe am Ende der Eileiter unmittelbar unter und manchmal beidseitig unter den Nieren identifiziert werden.
  10. Sobald das Geschlecht bestimmt ist, entsorgen Sie den Körper und legen Sie den Kopf in eine entsprechend beschriftete Schale (männlich oder weiblich). Halten Sie die Köpfe in Sezierlösung auf Eis.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.10, bis jedes Jungtier geschlechtlich bestimmt wurde. Um beste Ergebnisse zu erzielen, wischen Sie das Geschirr zwischen jedem Sezieren mit einem Kimwipe sauber. Flüssigkeit macht die Welpen rutschig und für die Sektion schwer zu greifen.
  12. Sobald alle Embryonen geschlechtlich bestimmt und der männliche und der weibliche Kopf getrennt wurden, fahren Sie mit dem Rest der Sektion fort, wobei Sie besonders darauf achten, dass sämtliches männliches und weibliches Gewebe getrennt bleibt.
  13. Übertragen Sie jeweils ein Gehirn in eine 100-mM-Schale, die mit Kaltdissektionspuffer gefüllt ist. Verwenden Sie im Präparierbereich die gebogene Pinzette, um die Augen des Embryos zu durchstechen und ihn für die Dissektion zu verankern. Machen Sie mit der mikrochirurgischen Schere einen flachen Schnitt in der Mittellinie und spalten Sie die Haut und den Schädel entlang der Mittellinie, von der Schädelbasis bis zum Oberkopf knapp über dem Nasengang.
  14. Schieben Sie die Haut und den Schädel sanft beidseitig zur Seite und ziehen Sie das Gehirn sehr sanft heraus, indem Sie es vorsichtig mit der Basis der mikrochirurgischen Schere oder mit einer geschlossenen, abgewinkelten Pinzette vom Vorderhirn in Richtung Hirnstamm schöpfen.
    1. Übertragen Sie das extrahierte Gehirn vorsichtig mit der Pinzette in eine saubere, beschriftete Schale, die mit Kaltdissektionspuffer gefüllt ist. Bewahren Sie das Gericht auf Eis auf.
    2. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne entnommen wurden.
    3. Dieser Schritt sollte zwei Platten des ganzen Gehirns im Dissektionspuffer erhalten, eine für männliches und eine für weibliches Gewebe.
  15. Stellen Sie eine saubere Schale unter den Sezierstab und füllen Sie ihn mit Präparierpuffer. Gießen Sie gerade so viel Lösung, dass das Gehirn während der gesamten Dissektion des Hippocampus feucht bleibt; Zu viel führt dazu, dass das Gehirn schwebt und die Handhabung erschwert wird. Falls gewünscht, die Sezierschale mit sterilem Wachs vorbestreichen. Das Wachs bietet eine rutschfeste Arbeitsfläche und schützt die Spitzen empfindlicher Sezierinstrumente; Das Kratzen am Boden einer unbeschichteten Schale kann die scharfen Kanten der Werkzeuge verbiegen oder stumpf machen.
  16. Ändern Sie den Präparierbereich auf eine hohe Leistungseinstellung und passen Sie den Fokus entsprechend an. Übertragen Sie vorsichtig ein Gehirn nach dem anderen in die Sezierschale. Ziehen Sie mit der extrafeinen Pinzette jede Gehirnhälfte auseinander und kneifen Sie sie vom Hirnstamm ab.
  17. Entfernen Sie sehr vorsichtig die Hirnhäute von jeder Hemisphäre. (Die Hirnhäute sind eine rosafarbene Membran, die reich an Blutgefäßen ist und eine häufige Quelle für Gliakontamination in einer Neuronenkultur ist.)
    1. Um die Hirnhäute zu entfernen, kneifen, heben und ziehen Sie vorsichtig an der Membran und achten Sie darauf, das darunter liegende Hirngewebe nicht zu durchstechen.
    2. Ziehen Sie die Hirnhäute vom Gehirn weg, so dass das Gehirn ein wenig unter die Pinzette rollen kann, aber halten Sie sie an Ort und Stelle, damit die Membran weggezogen werden kann.
  18. An diesem Punkt können Sie das Gehirn weiter präparieren, um das Gewebe Ihrer Wahl zu verwenden. Sezieren Sie zum Beispiel den Hippocampus von jeder Hemisphäre. Platzieren Sie eine Halbkugel mit der seitlichen Seite nach unten. Beobachten Sie die große Herzkammer, die einen Lappen bildet, der den Hippocampus bedeckt. Toupieren Sie diesen Lappen vorsichtig zurück, bis der halbmondförmige Hippocampus zu sehen ist. Der Hippocampus ist leicht erhöht und sitzt zwischen Mittelhirn und Kortex.
  19. Halten Sie mit zwei Paar scharfer, extrafeiner Pinzetten die Gehirnhälfte mit einer Hand offen und schneiden Sie mit der anderen den Hippocampus von der Großhirnrinde und dem Mittelhirn ab.
    1. Legen Sie den Hippocampus in eine korrekt beschriftete Schale (männlich oder weiblich), die mit Dissektionspuffer gefüllt und auf Eis gehalten wird.
    2. Präparieren Sie den Hippocampus von der restlichen Hemisphäre und wiederholen Sie diesen Vorgang mit jedem Gehirn.
  20. Füllen Sie die Hippocampi in entsprechend gekennzeichnete konische 15-ml-Röhrchen um.
    1. Zweimal vorsichtig mit Kaltdissektionspuffer waschen. Verwenden Sie die Vakuumabsaugung in dieser Phase sehr vorsichtig. Die Hippocampi sind klein und können unwiederbringlich im Vakuum verloren gehen. Verhindern Sie dies, indem Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen lassen, so viel Flüssigkeit wie möglich mit einer Pipette aus dem Röhrchen entfernen, die Lösung verwerfen und durch frischen, sauberen Dissektionspuffer ersetzen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.20.1.

4. Neuronale Dissoziation

  1. Übertragen Sie die Hippocampi in eine entsprechend gekennzeichnete, vorgewärmte Papainlösung. In ein 37 °C heißes Wasserbad geben und 8-10 Minuten inkubieren, dabei die Röhrchen vorsichtig umdrehen, um alle 2-3 Minuten zu mischen.
  2. Die Papainmischung und das Taschentuch aus dem Wasserbad nehmen. Lassen Sie das Gewebe sich absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig so viel wie möglich von der Papainlösung mit einer Pipette, wobei Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens belassen. Waschen Sie das Tuch 3x mit Plattationsmittel. Das Serum in den Galvanikmedien löscht die enzymatische Verdauung von Papain. Ein Trypsin-Inhibitor ist erforderlich, wenn kein Serum in den Beschichtungsmedien verwendet wird.
  3. Entfernen Sie das Beschichtungsmedium.
    1. Geben Sie 2 ml frisches neurobasales Medium hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einer serologischen 5-ml-Pipette, die auf die langsamste Geschwindigkeit eingestellt ist.
    2. Die Dissoziation erfolgt durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren von 8x. Achten Sie darauf, keine Blasen in die Lösung zu bringen. Um beste Ergebnisse zu erzielen, nehmen Sie die Lösung und das Gewebe in die Pipette und geben Sie die Lösung dann an der Seite des konischen Röhrchens ab, so dass das Gewebe an der Seite hinunter und zurück zum Boden des Röhrchens gleiten kann.
  4. Lassen Sie das Gewebe nach der 8. Verreibung absetzen und sammeln Sie das trübe Medium darauf. Dieses Medium enthält dissoziierte Zellen.
    1. Übertragen Sie es in ein neues, beschriftetes Röhrchen.
    2. Geben Sie weitere 2 ml in das nicht getrennte Gewebe.
    3. Noch einmal 8x trituieren.
    4. Ernten Sie die trüben Medien.
    5. Wiederhole diesen Vorgang 3-5x. Ein Teil des undissoziierten Gewebes bleibt zurück. Es ist zwar möglich, zu trituieren, bis das gesamte Gewebe dissoziiert ist, aber eine übermäßige Verreibung führt zu einer schlechten neuronalen Gesundheit und wird nicht empfohlen.
  5. Geben Sie bei Bedarf zusätzliches Medium in die konischen Röhren, um das Volumen und die Gewichte zwischen männlichem und weiblichem Gewebe auszugleichen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einer Spinneimerzentrifuge bei 228 x g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 2 ml frischem Beschichtungsmedium und filtrieren Sie die Lösung durch ein Netzzellensieb in ein sauberes, beschriftetes, konisches 50-ml-Röhrchen.
  7. 50 μl Zellsuspension zu 450 μl 0,4 % Trypanblau hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen 2 Minuten lang in Trypanblau, mischen Sie vorsichtig und laden Sie 10 μl auf ein Hämozytometer. Zählen Sie die Zellen mit Ausnahme derjenigen, die den Farbstoff Trypanblau aufgenommen haben; dunkelblaue Zellen sind tot oder sterben ab.

5. Beschichtung und Kulturpflege

  1. Berechnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension, das in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte gegeben werden soll, um die gewünschte Zelldichte zu erhalten. Neuronenkulturen reagieren sehr empfindlich auf die Zelldichte und eignen sich am besten für mittlere bis hohe Dichte, es sei denn, sie werden mit Gliazellen kokultiviert oder mit glialkonditionierten Medien gefüttert. In diesem Protokoll werden die Zellen mit 150.000-200.000 Zellen/cm2 plattiert.
  2. Nehmen Sie die mit Plattiermedium vorgefüllte Gewebekulturplatte aus dem Inkubator (vorbereitet in Schritt 2 oben).
    1. Schwenken Sie die Zellsuspension vorsichtig in dem konischen 50-ml-Röhrchen und pipettieren Sie dann das gewünschte Volumen der Zellsuspension (oben in Schritt 5.1 berechnet) in die Mitte jeder Vertiefung.
    2. Wiederholen Sie den Vorgang und schwenken Sie die Zellsuspension jedes Mal vor dem Pipettieren, um eine gleichmäßige Zelldichte in jeder Vertiefung zu gewährleisten. Die Zellen setzen sich schnell ab und die Zelldichte kann sich von Vertiefung zu Vertiefung ändern, wenn der Wirbelschritt übersprungen wird.
  3. Nachdem die Zellen in jede Vertiefung gegeben wurden, schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu verteilen, und setzen Sie die Schale sofort wieder in den Inkubator ein. Lassen Sie die Zellen mindestens 24 Stunden lang ungestört.
  4. Mindestens 24 Stunden nach dem Plattieren der Zellen das komplette neurobasale Fütterungsmedium auf 37 °C erwärmen. Aspirieren Sie das Plattierungsmedium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch das Fütterungsmedium. Aspirieren und ersetzen Sie jeweils aus einer Vertiefung, um neuronalen Stress zu minimieren und das Überleben der Zellen zu verbessern.
  5. Neuronenkulturen sollten alle 4-7 Tage gefüttert werden, indem die Hälfte des Mediums vorsichtig entfernt und eine gleiche Menge frisches Medium wieder hinzugefügt wird. Unter diesen Bedingungen können Kulturen zwei Wochen lang aufbewahrt werden. Bei primären neuronalen Kulturen ist ein gewisser Zelltod zu erwarten. Mit zunehmender Reife der Kulturen nimmt die Dichte also ab. In diesem Protokoll nimmt die Zelldichte bis zum 10. Tag in vitro um etwa 30 % ab.

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Ergebnisse

Eine korrekte Geschlechtsbestimmung von embryonalen Mäusen ist ein entscheidender Schritt bei der Herstellung geschlechtsaufgeteilter primärer Neuronenkulturen. Um sicherzustellen, dass die Hippocampi von männlichen und weiblichen Tieren getrennt voneinander aus korrekt bestimmten Nachkommen kultiviert wurden, wurden die Embryonen nach Geschlecht sortiert und ihr Kortex sowie Hippocampus isoliert. Nach standardisierten Verfahren wurde genomische DNA aus dem jeweils gewonnenen Gewebe jedes Embryos extrahiert, wobei sorgfä...

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Diskussion

Geschlechtsstratifizierte primär disassoziierte neuronale Kulturen des Hippocampus, in denen männliche und weibliche Hippocampus getrennt voneinander präpariert, disassoziiert und kultiviert werden, stellen ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der geschlechtsspezifischen Zellsignalgebung beim Zelltod von Neuronen dar. Während Neurowissenschaftler in der Regel primäre neuronale Kulturen verwenden, variieren die Protokolle je nach ihren spezifischen experimentellen Zielen und Interessen. Viele Forscher entscheiden sich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Arbeit wurde teilweise von der Walter S. and Lucienne Driskill Foundation und dem NIH R01NS058792 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B27 SupplementInvitrogen17504-044
BoraxSigma71997
BorsäureSigmaB6768
Rinderserum AlbuminSigmaA4503
Fötales RinderserumInvitrogen26140-079
GlutaMAXInvitrogen35050-061
GlutaminInvitrogen25030-081
HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein PhenolrotInvitrogen14175-095
MEM, kein Glutamin, kein PhenolrotInvitrogen51200-038
Neurobasal, kein Glutamin, kein PhenolrotInvitrogen12348-017
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15070-063
Poly-D-Lysin, MW 70.000-150.000SigmaP0899
Trypanblau 0,4%Invitrogen15250-061
AUSRÜSTUNG
Dumont #5/45 Abgewinkelte PinzetteFine Science Tools11251-35
Dumont #7 – Feine gebogene PinzetteFine Science Tools11274-20
mit Wellenschliff (London)Fine Science Tools11080-02
Extra feine Graefe Pinzette 1 x 2 ZähneFine Science Tools11153-10
Moria FederschereFine Science Tools15396-00
Mittelgroße OperationsschereRoboz SurgicalRS-6812
Extra feine MikropräparierschereRoboz SurgicalRS-5880
24-Well-GewebekulturplattenFisher87721
Zellsieb, 40 & Mikro; M Nylon MeshBD Biosciences352340
Zange

Referenzen

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