Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Summary

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Abstract

Die Anstrengungen haben sich auf die Entwicklung in-vitro-Assays zur Untersuchung der Mikrogefäßen konzentriert, weil in vivo Tierstudien mehr zeitaufwendig, teuer und Beobachtung und Quantifizierung sind sehr anspruchsvoll. Jedoch haben herkömmliche in vitro Assays microvessel Einschränkungen bei der Darstellung in vivo microvessels bezüglich dreidimensionale (3D)-Geometrie und eine kontinuierliche Strömung. Mit einer Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik, haben wir eine Multi-Tiefe kreisförmigen Querschnitt endothelialisierten entwickelt Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierliche Perfusion fließen. Eine positive reflowable Photoresist wurde verwendet, um eine Master-Form mit einem halbkreisförmigen Querschnitt Mikrokanal Netzwerk herzustellen. Nach der Ausrichtung und Verbindung der beiden Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle ersicated von der Urform wurde ein zylindrischer Mikrokanal Netzwerk erstellt. Die Durchmesser der Mikrokanäle kann gut beherrscht. Darüber hinaus zeigte primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) innerhalb des Chips ausgesät, dass die Zellen mit der Innenfläche der Mikrokanäle ausgekleidet unter kontrollierten Perfusion dauernd für einen Zeitraum von 4 Tagen bis 2 Wochen.

Introduction

Mikrogefäßen als Teil des Kreislaufsystems, vermitteln die Wechselwirkungen zwischen Blut und Gewebe, unterstützt Stoffwechselaktivitäten, definieren Gewebe Mikroumgebung und spielen eine entscheidende Rolle in vielen Gesundheits-und pathologischen Bedingungen. Zusammenfassung der funktionellen microvessels in vitro konnte eine Plattform für die Untersuchung von komplexen vaskulären Erscheinungen bereitzustellen. Jedoch sind herkömmliche in vitro Assays microvessel wie Endothelzellmigration Assays Bildung endothelialer Gefäße Assays und Ratte und Maus Aortenring Assays nicht die in vivo microvessels neu in Bezug auf dreidimensionale (3D)-Geometrie und kontinuierlichen Steuerung ^1-8. Studium der Mikrogefäßen anhand von Tiermodellen und in-vivo-Untersuchungen, wie Hornhaut-Angiogenese-Assay, chick Chorioallantoismembran Angiogenese Assay und Matrigel-Plug-Assay sind zeitaufwendiger, hohe Kosten, herausfordernde bezüglich Beobachtung und Quantifizierung undethische Fragen aufwerfen, ^{1, 9-13.}

Advances in Mikrotechnik und Mikrofluidik-Chip-Technologien haben eine Vielzahl von Einblicken in biomedizinischen Wissenschaften aktiviert, während beschneidet die hohen experimentellen Kosten und Komplexitäten mit Tieren und in vivo-Studien ^14, wie einfach und streng kontrolliert biologischen Bedingungen und dynamischen Umgebungen Fluidik, die nicht hätten zugeordnet war mit herkömmlichen makroskopischen Techniken möglich.

Hier präsentieren wir einen Ansatz für eine endothelialisierten konstruieren Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss durch die einzigartige Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie, und Mikrofluidik.

Protocol

1. Photolithographie Herstellung von Fotolack Meister Mold

Das folgende Protokoll zeigt den Prozess, um die Mikrokanäle mit Durchmessern zwischen 30-60 um herzustellen. Um einen Mikrokanal mit einem kleineren Durchmesser (weniger als 30 Mikrometer), einem Dreh-Beschichtung aus Photoresist zu erhalten benötigt.

1. Übertragen Sie die Reflow Fotolack aus dem Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Reinraum 24 Stunden vor dem Gebrauch und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen.
2. Reinigen eines Silizium-Wafers und backen es für eine Stunde bei 150 ° C, damit sie austrocknen. Die Dehydratisierung wird das Photoresist Haftung auf dem Silizium-Substrat zu unterstützen.
3. Spin-Beschichtung der ersten Schicht aus Photoresist mit folgender Rezeptur:

Schritt	Zeit (Sekunden)	Geschwindigkeit (rpm)	Beschleunigung
1	2	300	höchste
2	10	0
3	3	300	höchste
4	60	600	höchste
5	10	500	höchste
6	10	600	höchste

4. Dann backen die Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sek. Nach dem Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 20-30 um betragen.
5. Schleuderbeschichten einer zweiten Schicht aus Photoresist nach der gleichen Rezeptur für die erste Schicht verwendet wird.
6. Weichbacken der Wafer erneut, indem Sie es auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sec. Nach dieser Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 40-60 um betragen.
7. Generieren positive Urmodelle indem die PHOTOResist mit UV-Licht mit einer Belichtungsdosis von 14.500 mJ / cm ² durch eine Filmmaske.
8. Verdünnen Sie die Entwickler mit deionisiertem (DI) Wasser (1:2 (v / v)). Spülen Sie den Wafer wiederholt in der Lösung, bis das Muster voll entwickelt ist. Dann waschen Sie den Wafer mit DI-Wasser und trocknen Sie sie mit Hilfe von Stickstoff.
9. Reflow: Platz der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 120 ° C für 4 min und Deckel mit einem Glas Petrischale zur Verdampfung des Lösungsmittels zu verhindern. Entfernen Sie die Wafer von der Kochstelle und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Die Photoresistdicke nach dem Reflow werden 50-60 um betragen.

2. Softlithographie Herstellung von PDMS Microchannel Netzwerk

1. Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Basis: Härter) und mischen Sie es gründlich mit einem planetarischen Zentrifugalmischers.
2. Wandelt den PDMS-Lösung auf dem Reflow Fotolack Urform. Legen Sie die gegossene PDMS in einem Exsikkator für 15 min zur Entgasung. Verwenden Stickstoffgas, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, wenn nötig.
3. Backen des PDMS in einem Ofen bei einer Temperatur von 60 ° C für 3 Stunden, um es zu härten. Entfernen Sie dann die gehärteten PDMS Schicht von der Urform.
4. Verwenden Sie eine geschärfte Puncher zu Einlass / Auslass Löcher durch Stanzen von Löchern in der Channel-Netzwerk zu erstellen. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS mit Hilfe von Stickstoff.
5. Behandle zwei PDMS-Schichten mit Sauerstoff-Plasma für 30 sec in einem Plasma-Reiniger bei einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 ^-2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m ³ / min. Dann Ausrichtung der Oberflächen der PDMS manuell unter einem optischen Mikroskop. Verwenden Sie einen Tropfen Wasser, wenn nötig für eine bessere Kontrolle der Ausrichtung.
6. Backen Sie das Gerät in einem Ofen bei 60 ° C für 30 min, um eine dauerhafte Verklebung zu erreichen.

3. HUVEC Kultur und Seeding in den Chip

1. Kultur die HUVECs mit Kulturmedium mit L-Glutamin mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt. Für the Experiment Durchgänge zwischen 2 und 5 verwendet wurden.
2. Sobald die HUVECs konfluent sind, zählen die Zellen und ernten sie nach ersten Spülen der Zellen mit HEPES gepufferte Salzlösung (HEPES-BSS), und dann behandeln die Zellen mit Trypsin / EDTA und Inkubation für 2-6 min bei 37 ° C Nachdem die Trypsinierung abgeschlossen ist, neutralisieren die Trypsin / EDTA mit Trypsin Neutralisationslösung. Zentrifuge und die Zellen in Kulturmedium mit 8% Dextran, sie zu sammeln. Dextran wurde verwendet, um die mittlere Viskosität zu erhöhen, um in besser Zellaussaat und Anhänglichkeit zu unterstützen.
3. Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoff-Plasma für 5 min mit einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 ^-2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m ³ / min. Dann laden Sie das Gerät mit DI-Wasser und Behandlung mit UV-Licht für 8 h in einer laminaren Biosicherheit Haube für die Sterilisation.
4. Eines Tages, bevor die Zellen fertig sind, waschen Sie das Gerät mit 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) anschließend mit Fibronektin (100 ug / ml, dilausgeschüttet mit 1x PBS) und Inkubation im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht.
5. Nach dem Fibronectinbeschichtung, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS dann mit Kulturmedium zu laden. Inkubieren der Vorrichtung bei einer Temperatur von 37 ° C für 15 min.
6. Legen Sie die HUVEC-Zellen in 8% Dextran Kulturmedium mit einer Zellkonzentration von 3-4 x 10 ⁶ Zellen / ml. Legen Sie eine 20 ul Tröpfchen von Zellen an einem Einlass des Geräts und kippen, um die Zellen in den mikrofluidischen Kanal einzuführen. Nach 15-20 min werden die Zellen beginnen zu den Seitenwänden der Kanäle zu befestigen. Drehen Sie das Gerät alle 15 Minuten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu schaffen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Belastung durchgeführt werden.

4. Langfristige Perfusion-Setup

Nach 5-6 h statischer Kultur, werden die angeschlossenen HUVECs beginnen, voll ausbreiten. Richten Sie Perfusion mit einem ferngesteuerten Spritzenpumpensystem mit einem stetigen Strom von 10 ul / hr. Perfusion kann f eingestellt werdenoder eine höhere Strömungsgeschwindigkeit und kann für einen Zeitraum von 4 Tagen auf 2 Wochen.

5. Zellfärbung und Mikroskop Charakterisierung

1. Wenn die Zellen Konfluenz erreichen im Inneren des Gerätes, erstens, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS gründlich zu entfernen das Medium. Dann laden Sie das Gerät mit roter Farbstoff mit Verdünnungsmittel (4 ul-1 ml) verdünnt. Legen Sie den Farbstoff ähnlich der Zelle Ladevorgang. Inkubieren der Vorrichtung in der Dunkelheit für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend Waschen der Vorrichtung mit Kulturmedium, um die Färbung zu beenden. Lange Inkubationszeit des Farbstoffes kann zelluläre Toxizität und disadhesion.
2. Legen Sie das Gerät mit blauer Farbstoff mit 1x PBS (2 Tropfen pro ml) verdünnt. Im Dunkeln für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend gründlich mit 1x PBS Gerät.
3. Untersuchen Sie die Zellfärbung unter einem inversen Lichtmikroskop. Wenn die Färbung war gut, laden die Mikrokanäle mit Befestigung Medium (3,5% Paraformaldehyd mit 1x PBS verdünnt), dann tauchendas Gerät bei der Festsetzung der mittleren und vollständig bedecken Sie es mit Alufolie. Lagern Sie das Gerät im Kühlschrank bei einer Temperatur von 4 ° C, um das Gerät vor dem Austrocknen und Ausbleichen zu verhindern. Die feste Vorrichtung ist nun bereit für die konfokale Abbildung, die von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt werden kann.

Results

Unser Ansatz für die Multi-Tiefe Mikrokanalstruktur Netzwerk herzustellen ahmt die komplexen 3D-Geometrien in vivo Mikrogefäßen, in denen die Mikrokanäle haben abgerundete Querschnitte ^15. Darüber hinaus sind die Durchmesser der übergeordneten Verzweigung Kanäle und die Kanäle Tochter etwa gehorchen Murray Gesetz zur Aufrechterhaltung der Fluidströmung an einen erforderlichen Pegel, so dass der gesamte Kanal ist niedrig und Strömungsgeschwindigkeiten gleichmäßiger im gesamten Netzwerk ^16-18.

Discussion

1. Meister Formenbau

Einer der Gestaltung und Leitprinzipien für vaskuläre Morphometrie als Murray Gesetz ^16, was bedeutet, dass die Verteilung der Gefäßdurchmesser im gesamten Netzwerk von Mindestanforderungen an die Gesamtenergieeffizienz Gegenleistung regierten Staaten bekannt. Weiter heißt es, dass der Würfel der Durchmesser eines Elternteils Gefäß an einer Verzweigung der Summe der Potenzen der Durchmesser der Tochter Schiffe gleich (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Kulturmedium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Färbung	Invitrogen	H1399
PKH Roter Farbstoff	Sigma	MINI26 und PKH26GL
Fibronektin	Gibco	PHE0023
L-Glutamin	Sigma	G7513
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Invitrogen	14040-133
HEPES gepufferte Kochsalzlösung	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsin-Neutralisationslösung	Lonza	CC-5002
PDMS-Härtungsmittel	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primäre Endothelzellen der menschlichen Nabelvene	Lonza	CC-2517
Fötales Rinderserum	Lonza	14-501F
Verdünnungsmittel C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molekulare Sonden	R37605
Dextran		Sigma 95771
3,5 % Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	15710-S
Ausrüstung
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ LITE
Exsikkator	BelArt Produkte	999320237
Inversmikroskop	Nikon	Eclipse Ti
Spritzenpumpensystem	Harvard Apparatur	PHD Ultra
Laminar Biosicherheitshaube	Thermo Scientific	1300 Serie A2
Planeten-Zentrifugalmischer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optisches Mikroskop	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-32G
Heizplatte	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Zeiss	LSM 510