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Ein schnelles Protokoll zur Integration extrachromosomaler Arrays mit hoher Übertragungsrate in das Genom von C. elegans

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DOI:

10.3791/50773

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9. Dezember 2013

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1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein schnelles und materialsparendes Verfahren zur Integration von transgenen extrachromosomalen Arrays in das Genom von Caenorhabditis elegans mittels ultravioletter (UV) Bestrahlung. Darüber hinaus eignet sich dieses Protokoll besonders gut für transgene Linien, die extrachromosomale Arrays mit hoher Geschwindigkeit übertragen.

Zusammenfassung

Die Mikroinjektion von DNA in das Zytoplasma der synzytialen Gonade von Caenorhabditis elegans ist die Haupttechnik zur Etablierung transgener Linien, die partielle und variable Übertragungsraten von extrachromosomalen Arrays zur nächsten Generation aufweisen. Darüber hinaus sind transgene Tiere mosaikartig und exprimieren das Transgen in einer variablen Anzahl von Zellen. Extrachromosomale Arrays können mittels UV-Bestrahlung in das Genom von C. elegans integriert werden, um nicht-mosaikartige transgene Stämme mit einer 100%igen Übertragungsrate des Transgens zu etablieren. Insofern werden F1-Nachkommen von UV-bestrahlten transgenen Tieren auf Tiere gescreent, die eine heterozygote Integration des Transgens tragen, was zu einer Mendelschen Übertragungsrate von 75% auf die F2-Nachkommen führt. Eine der Herausforderungen dieser Methode besteht darin, zwischen dem prozentualen Anteil der transgenen Übertragung in einer Population vor (X% transgene Tiere) und nach der Integration (≥75% transgene F2-Tiere) zu unterscheiden. Daher erfordert diese Methode die Wahl einer nicht-integrierten transgenen Linie mit einem Anteil an transgenen Tieren, der deutlich unter der Mendelschen Segregation von 75 % liegt. Folglich werden nicht-integrierte transgene Linien mit einer extrachromosomalen Array-Übertragungsrate auf die nächste Generation von ≤60% in der Regel für die Integration bevorzugt, und die transgene Integration in hochtransmittierende Stämme ist schwierig. Hier zeigen wir, dass die Effizienz der Integration extrachromosomaler Arrays in das Genom erhöht wird, wenn hochtransmittierende transgene Linien verwendet werden (≥80%). Das beschriebene Protokoll ermöglicht die einfache Selektion mehrerer unabhängiger Linien mit homozygoter Transgenintegration in das Genom nach UV-Bestrahlung von transgenen Würmern, die eine hohe Rate an extrachromosomaler Array-Übertragung aufweisen. Darüber hinaus ist diese Methode recht schnell und materialsparend. Die Möglichkeit, schnell verschiedene Linien zu erzeugen, die ein bestimmtes integriertes Transgen exprimieren, ist von großem Interesse für Studien, die sich auf das Genexpressionsmuster und die Regulation von Genexpressionen, die Proteinlokalisierung und Überexpression konzentrieren, sowie für die Entwicklung subzellulärer Marker.

Einleitung

Transgene werden in C. elegans ausgiebig für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt. Transgene Stämme werden typischerweise durch DNA-Injektion in die synzytiale Hermaphroditen-Gonadeerzeugt 1,2. Die DNA, die das Transgen von Interesse trägt, wird zusammen mit Plasmiden, die für die Coinjektionsmarker1,3,4 kodieren, coinjiziert. Coinjektionsmarker sind etablierte Transgene, die entweder zur Expression eines fluoreszierenden Proteins oder zu einem spezifischen Verhaltens- oder morphologischen Phänotyp führen. Die injizierten DNAs ordnen sich neu an, um extrachromosomale Arrays mit mehreren Kopien zu bilden; Somit werden das Transgen von Interesse und der Coinjektionsmarker zusammen übertragen5,4. Transgene Linien werden in der F2-Generation von injizierten Tieren selektiert, indem dem Phänotyp gefolgt wird, der durch die Expression des Coinjektionsmarkers (Fluoreszenz oder spezifischer Phänotyp)1 induziert wird. Transgene Linien weisen partielle und variable Übertragungsraten der extrachromosomalen Arrays auf die nächste Generation auf. Je nach Stamm erben 10-100% (100% ist ein seltenes Ereignis) der Tiere extrachromosomale Arrays. Darüber hinaus sind transgene Tiere mosaikartig und exprimieren das Transgen in einer variablen Anzahl von Zellen. Dieses Mosaik korreliert wahrscheinlich mit der Übertragungsrate an die nächste Generation. Sowohl in der Keimbahn als auch in somatischen Zellen hängt die Übertragungsrate von der Segregation der extrachromosomalen Arrays während der Zellteilung ab. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu vermeiden, besteht darin, das Transgen in das Genom zu integrieren. Klassischerweise beruht die Integration eines Transgens in ein Chromosom auf der Bestrahlung (ultraviolett oder gamma) von transgenen Würmern, die extrachromosomale Arrays tragen3. Kurz gesagt, 50-100 Hermaphroditen werden im Larvenstadium L4 bestrahlt. In der F1-Generation werden 200-800 transgene Tiere selektiert und einzeln auf Platten kultiviert. Gemäß der Mendelschen Segregation würden transgene F1-Tiere, die eine heterozygote Integration des Transgens in das Genom tragen, 1/2 der transgenen Nachkommen produzieren, die heterozygot für das integrierte Array sind, 1/4 der transgenen Nachkommen sind homozygot für das integrierte Array und 1/4 der Nachkommen, die das Array nicht integriert haben (Abbildung 1). Daher werden Platten, die die F2-Generation enthalten, visuell auf ≥75% transgene Tiere gescreent, wie durch die Expression des Coinjektionsmarkers beobachtet wird. Etwa 1/3 der F2-Tiere, die als Integrantenkandidaten ausgewählt wurden, werden als homozygot für das integrierte Array angenommen und produzieren 100% der homozygoten F3-Tiere. Daher werden von jeder ausgewählten Platte drei bis acht transgene F2-Tiere einzeln kultiviert und Platten mit 100 % transgenen Nachkommen ausgewählt. Anschließend werden acht F3-Tiere einzeln kultiviert, um die 100%ige Vererbung des Transgens zu bestätigen.

Die Hauptnachteile dieser Methode sind, dass

  1. Es erfordert ein visuelles Screening von mehreren hundert F1-Platten für ≥75% transgene F2-Nachkommen, was aufgrund des variablen und unvorhersehbaren Prozentsatzes der Übertragung von nicht integrierten extrachromosomalen Arrays zeitaufwändig ist. Um das Screening von F1-Platten zu vermeiden, können alternativ mehrere aufeinanderfolgende Hungerschritte nach der Bestrahlung von P0-Tieren durchgeführt werden; gefolgt von der Auswahl von 100 transgenen Tieren und dem Screening auf 100% transgene Nachkommen3.
  2. Es ist nicht für Stämme geeignet, die einen Prozentsatz an extrachromosomaler Array-Übertragung von mehr als 60 % aufweisen, da es schwierig ist, diesen Prozentsatz von 75 % zu unterscheiden.
  3. Da nur Stämme mit einer relativ geringen Transmissionsrate verwendet werden können, ist eine hohe Anzahl an bestrahlten transgenen P0-Tieren sowie die Beobachtung zahlreicher F1- und F2-Tiere erforderlich, was sehr zeitaufwändig ist und eine beträchtliche Anzahl von Platten erfordert.

Die Bestrahlung von Würmern induziert vermutlich Doppelstrangbrüche in der DNA und die Integration von extrachromosomalen Arrays in die Chromosomen erfolgt während der DNA-Reparatur. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Chancen auf eine erfolgreiche Bestrahlungs-vermittelte Integration direkt proportional zur Anzahl der Keimbahnzellen sind, die ein extrachromosomales Array tragen. Stämme mit einer hohen Übertragungsrate können mehr transgene DNA-Arrays enthalten als Stämme mit einer niedrigen Übertragungsrate, wie in2 vorgeschlagen, und weisen eine höhere Anzahl von Keimbahnzellen auf, die extrachromosomale Arrays tragen. Daher folgerten wir, dass Transgene in stark transmittierenden Linien einfacher zu integrieren sein könnten als in Linien mit einer niedrigen Übertragungsrate. Das Standardprotokoll schließt jedoch die Möglichkeit der Integration von Transgenen mit hoher Übertragungsfrequenz aus, da der Anteil transgener Tiere mit einem nicht integrierten extrachromosomalen Array kaum von dem der Nachkommen eines F1-Tieres unterschieden werden kann, die eine heterozygote Integration des Transgens in das Genom tragen (Abbildung 1).

Hier zeigen wir, dass für ein bestimmtes Transgen die Anzahl der integrierten Linien, die nach der Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht wiederhergestellt werden, vom anfänglichen Prozentsatz der Transmission des nicht integrierten Arrays abhängt. Wir stellen ein verbessertes Protokoll für die UV-Bestrahlungs-vermittelte Transgenintegration vor, das besonders relevant für Linien ist, die eine hohe Rate an Transgen-Array-Transmission aufweisen.

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Protokoll

1. Kultivierung transgener Nematoden vor der Integration

Transgene Linien können wie in1 beschrieben erzeugt werden. Diese Linien enthalten in der Regel ein Co-Injektionsmarker-Plasmid, das entweder zur Expression eines fluoreszierenden Proteins oder zu einem spezifischen Verhaltens- oder morphologischen Phänotyp in einem bestimmten Entwicklungsstadium führt1,3. Dieses Integrationsprotokoll kann auf Stämme angewendet werden, die fluoreszierende oder nicht-fluoreszierende Co-Injektionsmarker exprimieren. Im folgenden Beispiel wurde ein Stamm mit einem fluoreszierenden Coinjektionsmarker verwendet.

  1. Kulturplatten vorbereiten:
    1. Bereiten Sie etwa 500 60 mm große Petrischalen vor, die aseptisch mit je 10 ml Nematodenwachstumsmedium (NGM) gegossen werden6,7.
    2. Jede Platte wird mit 0,3 ml gesättigter Escherichia coli OP50-Kultur nach dem Standardverfahren6,7 besiedelt.
  2. Bewerten Sie die Transmissionsrate der zu integrierenden transgenen Linie:
    1. Für jede transgene Linie werden zehn fluoreszierende trächtige adulte Tiere auf zehn separate Kulturplatten unter einem fluoreszierenden Stereoskop mit einem Wurmstocher entnommen, wie in7 beschrieben.
    2. Kultivieren Sie die Tiere in einem Wurmbrutkasten bei 15-25 °C (je nach genetischem Hintergrund), damit sich die Würmer vermehren können.
    3. Beobachten Sie jeden Tag die Nachkommenschaft, um zu beurteilen, in welchem Entwicklungsstadium der Co-Injektionsmarker exprimiert wird und am besten beobachtet werden kann. Die Expression der meisten der derzeit verwendeten Co-Injektionsmarker wird im L4-Larvenstadium oder im Erwachsenenalter beobachtet.
    4. Bewerten Sie die Transmissionsrate der Nachkommen, indem Sie den Prozentsatz der fluoreszierenden Nachkommen durch Beobachtung unter einem Fluoreszenzstereoskop bestimmen.
  3. Wählen Sie eine transgene Linie für die Transgenintegration:
    1. Wählen Sie die transgene Linie mit der höchstmöglichen Transmissionsrate (idealerweise ≥80%).
  4. Erhalten Sie eine Population transgener Tiere, die im L4-Larvenstadium für die Integration synchronisiert sind:
    1. Entnehmen Sie 30 fluoreszierende trächtige adulte Tiere auf fünf Kulturplatten (sechs Tiere pro Platte).
    2. Lassen Sie die Würmer 3-4 Stunden bei 15 °C Eier legen.
    3. Entfernen Sie die erwachsenen Tiere von den Tellern, nachdem Sie überprüft haben, ob mindestens 30 Eier pro Teller vorhanden sind.
    4. Die Tiere werden in einem Wurmbrutkasten bei 15-25 °C kultiviert, bis die Nachkommen das Larvenstadium L4 erreichen (96 Std. bei 15 °C oder 36 Std. bei 25 °C).

2. UV-Bestrahlung und Rückgewinnung von transgenen Würmern

  1. Bestrahlung durch Würmer:
    1. Entnehmen Sie 30-100 fluoreszierende transgene L4-Tiere auf separate Kulturplatten (15-20 Tiere pro Platte).
    2. Legen Sie die Platten mit abgenommenen Deckeln in einen UV-Vernetzer. Bestrahlen Sie die Würmer mit 0,012 J/cm2. Beachten Sie, dass die Stämme mehr oder weniger empfindlich auf UV-Strahlung reagieren und dass die Ergebnisse je nach verwendetem UV-Strahler unterschiedlich sein können. Es kann ein Dosisbereich zwischen 0,010-0,015 J/cm2 getestet werden.
  2. Rückgewinnung von Würmern nach Bestrahlung:
    1. Stellen Sie die Platten mit bestrahlten Würmern über Nacht bei 15 °C zur Wiederherstellung auf.
    2. Überprüfe, wie viele Tiere am Leben sind. In unseren Händen ist eine Überlebensrate von etwa 80-90% für eine effiziente Bestrahlung angepasst.
    3. Die bestrahlten Tiere werden bei 15-25 °C gezüchtet, bis die Nachkommen das Entwicklungsstadium erreicht haben, das die Beobachtung der Co-Injektionsmarker-Expression gemäß Schritt 1.2 ermöglicht.

3. Isolierung von integrierten transgenen Linien

  1. Auswahl an F1-Tieren:
    1. Einzelne 150-200 fluoreszierende F1-Tiere auf separate Kulturplatten auffüllen. Für hochstrahlende Leitungen (≥80%) reichen 100 F1-Tiere aus.
    2. Halten Sie diese F1-Platten bei 15-25 °C, bis die Nachkommen ein geeignetes Stadium für die Beobachtung von fluoreszierenden F2-Tieren erreicht haben.
    3. Verwerfen Sie alle F1-Platten, die entweder i) keine Nachkommen aufweisen, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier steril war oder gestorben ist, oder ii) keine oder nur wenige fluoreszierende F2-Tiere, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier das Transgen nicht mit der erwarteten Rate übertragen hat. Dieser Schritt ist schnell und stellt einen echten Vorteil im Vergleich zum Standardprotokoll dar, das eine Schätzung des Prozentsatzes fluoreszierender F2-Würmer erfordert, um F1-Platten mit ≥75% fluoreszierenden Nachkommen auszuwählen (Tabelle 1).
  2. Auswahl an F2-Tieren:
    1. Einzeln vier fluoreszierende transgene F2-Tiere aus jeder ausgewählten F1-Platte. Bei der Verwendung von fluoreszierenden Transgenen (z. B. mCherry8, gfp9 oder dsRed10) wählen Sie F2-Würmer mit einem hohen Fluoreszenzgrad, da dies darauf hindeuten könnte, dass diese Tiere homozygot für das integrierte Array sind. Beachten Sie, dass es bei der Auswahl von F2-Tieren wichtig ist, keine Eier oder Larven mit sich zu führen, um falsch negative Ergebnisse im nächsten Schritt zu vermeiden.
    2. Züchten Sie F2-Tiere bei 15-25 °C.
  3. Isolierung und Validierung von integrierten transgenen Stämmen:
    1. Sieb F2-Platten auf 100% fluoreszierende transgene F3-Würmer. Das Sieb ist recht schnell, da das Vorhandensein eines einzelnen nicht fluoreszierenden Wurms darauf hinweist, dass die Platte weggeworfen werden sollte. Ein F2-Tier, das homozygot für das integrierte Transgen ist, ergibt 100% homozygote fluoreszierende Nachkommen.
    2. Einzelne acht fluoreszierende F3-Tiere aus ausgewählten Platten, um die 100%ige Vererbung des Transgens zu bestätigen. Theoretisch reicht es in diesem Schritt aus, ein Tier auszuwählen. Die Auswahl von acht fluoreszierenden F3-Tieren kann jedoch notwendig sein, um die Selektion unfruchtbarer oder ungesunder Tiere zu vermeiden, da die Bestrahlung zufällig Mutationen induzieren kann, die Gene betreffen, die für die Physiologie des Wurms wichtig sind.
    3. Wenn möglich, sollten mehrere unabhängige integrierte transgene Stämme gehalten werden, d. h. Stämme, die von verschiedenen F1-Tieren stammen.

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Ergebnisse

Integrationen von Transgenen in zwei verschiedenen Linien, die extrachromosomale Arrays mit etwa gleicher Häufigkeit übertragen (50–60 %), wurden mithilfe des Standard- und des verbesserten Protokolls durchgeführt (Tabelle 1). Mit dem Standardprotokoll konnten drei unabhängige integrierte Linien nach UV-Bestrahlung von 91 transgenen L4-Tieren gewonnen werden, während mit dem verbesserten Protokoll eine integrierte Linie nach UV-Bestrahlung von 30 transgenen L4-Tieren erhalten wurde. Dies legt nahe, dass ...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine effiziente Methode, um extrachromosomale transgene Arrays in das Genom von C. elegans zu integrieren. Unter Verwendung verschiedener nicht-integrierter Linien, die das gleiche Transgen Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) mit unterschiedlichen Raten (10-15%, 50-60% und >80%) übertrugen, zeigten wir, dass die Anzahl der nach UV-Bestrahlung wiedergefundenen integrierten Stämme vom anfänglichen Transmissionsgrad der nicht-integrierten Linie abhängt (Tabelle 2

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Offenlegungen

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Claire Lecroisey und Laurent Ségalat für die Generierung von nicht-integriertem Pdyc-1::d yc-1::gfp; Pmyo-2::d sRed und Pmyo-3::gfp transgene Stämme. Wir danken Andy Fire für das Geschenk des Pmyo-2::d sRed-Plasmids und Pamela Hoppe für das Geschenk des Pmyo-3::gfp-Plasmids. Diese Arbeit wurde vom französischen Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS) und der Claude-Bernard-Universität Lyon gegründet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgarProlabo20768.292für NGM (Nematoden-Wachstumsmedium) Zubereitung (6,7)
NaClChimie-Plus40045für NGM
Zubereitung Bacto-PeptonBD211820für NGM Zubereitung
KH2PO4Roth3904-1für NGM Zubereitung
K2HPO4Prolabo26930.293für NGM-Präparate
MgSO4RothP027.2für NGM-Präparate
CaCl2Prolabo22317.297für NGM-Präparate
CholesterinRectapurfür NGM-Präparate
LB-BouillonSigmaL3022für die Kultur von OP50
bakterien AUSRÜSTUNG
U.V. VernetzerFischer ScientificWellenlänge 254 nm
Mikroskop SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Petrischale, 60 mmCMLBPS55E6
Platindraht 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Zur Herstellung einer Hacke für Würmer (7)

Referenzen

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Schlagwörter

UV BestrahlungAuswahl transgener LinienFluoreszenz Screeninghomozygote IntegrationAnalyse der bertragungsrateScreening der F1 NachkommenF2 PlattenselektionGenerierung unabh ngiger St mme

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