Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Summary

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Abstract

Biomarker werden immer wichtiger in der klinischen Entscheidungsfindung, sowie Grundlagenforschung. Diagnose Myokardinfarkt (MI) wird weitgehend durch Erfassen herz-spezifische Proteine ​​in Patienten Serum oder Plasma als Indikator einer Myokard-Schädigung zurückzuführen. Nachdem vor kurzem gezeigt, dass Herzmyosin Protein-C (cMyBP-C) im Serum nach MI erkennbar, haben wir es als möglicher Biomarker MI vorgeschlagen. Biomarker sind in der Regel mit herkömmlichen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assays nachgewiesen. Allerdings erfordert diese Technik eine große Probenvolumen hat einen kleinen dynamischen Bereich und kann nur ein Protein zu einem Zeitpunkt zu messen.

Hier zeigen wir, ein Multiplex-Immunoassay, bei dem drei kardialen Proteine ​​gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Messen cMyBP-C in Uniplex oder zusammen mit Creatin-Kinase MB und Troponin I zeigten eine vergleichbare Empfindlichkeit. Diese Technik nutzt die Meso-Skala Entdeckung(MSD) Verfahren zum Multiplexen in einer 96-Well-Platte mit Elektrochemilumineszenz zur Detektion kombiniert. Während nur geringe Probenvolumina benötigt werden, sind eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich erreicht. Mit dieser Technik, maßen wir cMyBP-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I-Spiegel im Serum von 16 Patienten mit MI und verglichen die Ergebnisse mit 16 Kontrollpersonen. Wir konnten alle drei Marker in diesen Proben erkennen und fand alle drei Biomarker nach MI erhöht werden. Diese Technik ist daher geeignet für den empfindlichen Nachweis von kardialen Biomarkern im Serum.

Introduction

Die Messung von geringen Mengen an Protein in komplexen biologischen Proben, wie Serum, ist von wachsender Bedeutung für die klinische Behandlung der Patienten sowie der Grundlagenforschung. So ist ein Anstieg der Serumspiegel von kardialen Biomarkern wie Troponin I, in einer klinischen Umgebung, die mit akutem Myokardinfarkt (MI) ^1. Um Proteine ​​im Serum zu erkennen, ist Standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die am häufigsten verwendete Technik, da sie hohe Empfindlichkeit aufweist und ermöglicht eine absolute Quantifizierung des Analyten. Jedoch erfordern herkömmliche ELISAs eine relativ große Menge der Probe (in der Regel 100 ul), haben ei....

Protocol

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. Am Tag vor dem Experiment, Mantel der 96er MSD bloßen Standard-Platte mit Capture-Antikörper. Für cMyBP-C, mit einem Volumen von 30 ul monoklonalen Maus-anti-cMyBP-C-Antikörper (Gelatine frei) in einer Konzentration von 5 g / ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Da das gut ist hydrophob, Pipette die Lösung in der unteren Ecke des Brunnens, dann tippen Sie auf die Seiten der Platte, um die Lösung über den gesamten gut verteilt.
3. Die Platte wird mit Abklebefolie abgedeckt und O / N bei 4 ° C ohne Schütteln.
4. Entfernen Sie die Capture-Antikörper-Lösung, indem die Lösung über einen Waschbecken un....

Results

Die Grundprinzipien und Workflow des 3-Komplex Assays sind in Abbildung 1 dargestellt, und die gesamte Workflow wird in Tabelle 1 beschrieben. Uniplex Assays arbeiten nach dem gleichen Prinzip der Ausnahme, dass der gesamte Boden ist gut mit einem Capture-Antikörper beschichtet. Signalerfassung durch ECL in dem ein elektrisches Signal an den Boden des Bohrlochs angelegt wird, durchgeführt. Dies wiederum löst eine lokale Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion der Lese-Puffer m.......

Discussion

In dieser Studie zeigen wir die Anwendbarkeit eines Multiplex-Immunoassay zum Nachweis von mehreren kardialen Biomarkern im Serum von Patienten. Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA. Zuerst wird in der ECL-Assay-Kit statt kolorimetrischen Nachweis verwendet. In ECL, stimuliert ein elektrisches Signal die lokale Produktion der gemessenen Eigenschaft (Licht), damit Entkopplung der Stimulation Ereignis aus dem Signal, das Hintergrund ¹⁴ reduziert. Dies ermöglicht eine hohe Empfi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) mit Tensid	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Vor Gebrauch filtern
Myosin-bindendes Protein C-Antikörper, Maus monoklonal (E7), gelatinefrei	Santa Cruz	SC-137180L	Für die Beschichtung muss der Antikörper gelatinefrei
Platten und Ausrüstung
Multi-Array 96-Well-Standardplatte	Meso Scale Discovery	L15XA-3
Ein Prototyp einer 96-Well-Platte mit 3 Plex und vier Spots und cMyBP-C, cTnI und CK-MB	Meso Scale	Discovery N452A-1
ThermaSeal Versiegelungsfolie	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A		der Mesoskala
MTS 2/4 digitaler Mikrotiterschüttler	IKA	3208001