Methodenartikel

Kultivierung und Pflege

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DOI:

10.3791/50787

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14. September 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Clostridium difficile ist ein pathogenes Bakterium, das eine strikte Anaerobier ist und bewirkt, dass Antibiotika-assoziierten Diarrhoe (AAD). Hier, Methoden zur Isolierung, Kultivierung und Pflege von C. difficile vegetativen Zellen und Sporen werden beschrieben. Diese Techniken erfordern eine anaerobe Kammer, die regelmäßige Wartung erfordert, um den richtigen Bedingungen sorgen für optimale C. difficile Anbau.

Zusammenfassung

Clostridium difficile ist ein Gram-positive, anaerobe, sporenbild Bakterium, das vor allem für Antibiotika-assoziierten Diarrhoe (AAD) verantwortlich ist und der eine bedeutende nosokomiale Erreger. C difficile ist notorisch schwierig zu isolieren und zu kultivieren und ist extrem empfindlich, auch geringe Mengen an Sauerstoff in der Umgebung. Hier sind Verfahren zur Isolierung von C. difficile aus Stuhlproben und anschließend Kultivierung C. difficile zur Herstellung von Glycerin-Stammlösungen für die Langzeitlagerung dargestellt. Techniken zur Herstellung und Auflisten Sporenvorräte im Labor für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Mikroskopie abwärts und Tierstudien werden ebenfalls beschrieben. Diese Techniken erfordern eine anaerobe Kammer, die eine konsistente anaerobe Umgebung zu angemessenen Bedingungen für eine optimale C gewährleisten hält difficile Wachstum. Wir stellen Protokolle zum Übertragen von Materialien in und aus der Kammer ohne Camit erheblichen Sauerstoffkontamination zusammen mit Vorschlägen für die regelmäßige Wartung erforderlich, um die entsprechenden anaeroben Umgebung für die effiziente und konsequente C aufrecht difficile Anbau.

Einleitung

Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das ein obligat anaerobe und eine potenziell tödliche Magen-Darm-Erreger von Mensch und Tier ist. Ursprünglich im Jahre 1935 beschrieben, als Kommen Organismus in Stuhlproben von Neugeborenen 1, C. gefunden difficile wurde später gezeigt, dass der Erreger der Pseudomembrankolik mit Antibiotika-Behandlung 2 zugeordnet werden. C difficile-Infektionen (CDI) in der Regel durch Antibiotika-Behandlung, die in der Störung der normalen Darmflora führt, die Schaffung einer Nische für C voraus difficile zu gedeihen 2. C difficile als ruhende Sporen fäkal-oralen Weg übertragen und anschließend keimt innerhalb des Magen-Darm-Trakt, wodurch vegetativen Zellen fähig ist, mehrere Toxine und verursachen schwere Krankheit und Colitis 3. CDI sind oft resistent gegen herkömmliche Behandlungen und diese inInfektionen werden häufig wiederkehrende 4. Als Ergebnis sind CDI für bis zu 4,8 Milliarden Kosten im Gesundheitswesen in den USA 07.05 $ verantwortlich.

C. difficile ist sehr empfindlich auf geringe Mengen an Sauerstoff in der Umgebung. Für C. difficile in der Umwelt verbleiben und effizient von Host zu Host übertragen werden kann, ist die Bildung einer metabolisch inaktiven Sporen kritischen 8. Da der Labor Wartung und Manipulation von C. difficile erfordert einen kontrollierten anaeroben Umgebung, diese Techniken erfordern den Einsatz einer anaeroben Kammer. Verwendung von anaeroben Kammern hat in erhöhte Gewinnung und Isolierung von obligaten Anaerobiern 9-11 geführt und hat eine Reihe von molekularen Techniken, um in einer anaeroben Atmosphäre durchgeführt werden dürfen.

Zusätzlich zu C. difficile, die anaerobe Kammer Gebrauch und die Wartung hier beschriebenen geltenzu anderen obligat anaerobe Bakterien wie Clostridien anderen Spezies (zB C. perfringens), andere Magen-Darm-Arten (z. B. Bacteroides 12) und parodontalen Krankheitserreger (zB Peptostreptococcus Art 13).

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Protokoll

Hinweis: C. difficile ist ein Mensch und Tier Krankheitserreger, der Magen-Darm-Erkrankung verursachen können. Experimente mit C. difficile, müssen mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen zur Biosicherheit (BSL-2) durchgeführt werden.

1. Anaerobe Kammer Betriebs-und Wartungs

C. difficile ist eine strenge anaerobe und ist extrem empfindlich auf niedrige Sauerstoffkonzentrationen in der Atmosphäre. Daher wird eine gesteuerte, anaeroben Umgebung für die erfolgreiche Manipulation erforderlich. Die Verwendung einer anaeroben Kammer (Abbildung 1A) bietet die stabile Umgebung und die idealen Bedingungen für eine effektive Kultivierung von C. difficile und andere anaerobe Bakterien 14. Hier kann eine Atmosphäre, die ein Gasgemisch (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) stabil gehalten werden.

Um alle Elemente in die Kammer ohne nennensSauerstoffKontamination einzuführen,Eine Luftschleuse verwendet werden (Fig. 1B). Diese Einrichtung arbeitet als ein Gasaustausch und arbeitet automatisch, manuell oder semi-manuell. Die Luftschleuse hat zwei Türen: ein Zugang zu der Außenseite der Luftschleuse und der andere Zugang zu dem Inneren der anaeroben Kammer. Je nach Modell kann die Luftschleuse eine zusätzliche Tür zu haben, die den Zugang zu einem angrenzenden anaeroben Kammer anbieten können, das spart die Kosten für einen separaten Luftschleuse. Sofern nicht aktiv bewegten Elemente in die oder aus der Kammer, sollten beide Türen stets geschlossen bleiben, um eine Sauerstoffkontamination zu vermeiden. Die Luftschleuse besitzt einen Ein / Aus-Schalter auf der Vorderseite und eine Platte, die vier Tasten. Die Gasleitungen und Vakuumpumpschlauch in der Rückseite des Luftschleuse, in der Nähe der Platte, wenn die Schalter für die vollständige manuelle Bedienung der Einheit angeordnet ist. Es wird empfohlen, dass zwei Spülzyklen mit Stickstoff (N 2) verwendet werden, vor dem Füllen des Austausch mit Gasgemisch (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2), die Menge an Sauerstoff in die Kammer eingeführt zu reduzieren. Es ist auch wichtig, um nicht eine der Türen verlassen länger als die Menge Zeit benötigt, um Gegenstände in den und aus dem Austausch und zu bewegen offenen sorgfältig planen Experimente, die Frequenz des sich bewegenden Gegenstände in und aus der Kammer zu verringern. Die unterschiedlichen Betriebsverfahren für Vinyl anaeroben Kammern sind unten aufgeführt. Bevor Sie die folgenden Protokolle, sicherzustellen, dass diese mit den Anweisungen des Herstellers mit der Kammer vorgesehen kompatibel sind.

  1. Automatischer Modus
    Dies ist eine programmierbare und kundenModus und wird vollständig von der Luftschleuse durchgeführt. Um die Luftschleuse zu programmieren, um die Anweisungen des Herstellers beziehen. Eine empfohlene Programm zur typischer Eintrag in die Kammer beinhaltet zwei Spülzyklen mit Hilfe von Stickstoff, gefolgt von Nachfüllen der Luftschleuse mit einer Gasmischung, die eng mit der Atmosphäre innerhalb des cham gehalten Spieleber. Während jeder Vakuumzyklus, die Standard-Werk Verfahren empfehlen ein Vakuum bis 20 inHg und Spülen bis 1 inHg.
    1. Sicherzustellen, dass die innere Schleusentür vollständig geschlossen ist.
    2. Öffnen Sie die äußere Schleusentür.
    3. Legen Sie Gegenstände in Luftschleuse und schließen Sie die äußere Schleusentür. Wenn die Einführung von Flüssigkeiten, schrauben die Kappen auf halbem Weg zu effizienten Gasaustausch zu gewährleisten. Versiegelten Verpackungen und Behälter sollte vor Beginn des Zyklus geöffnet werden; Verzicht Dabei können sich verformen und Schäden Kunststoffprodukte und Container. Um die Sterilität zu erhalten, öffnen Sie die Pakete nur effizient genug, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
    4. Drücken Sie die Taste Start.
    5. Warten, bis die Luftschleuse wurde durch das Programm wieder eingeschaltet und die Anzeige "Anaerobe."
    6. Öffnen inneren Schleusentür.
    7. Verschieben Sie die Elemente in die Kammer.
    8. Schließen Sie Innentür.
  2. Semi-manuelle Modus
    Dieser Modus kann beim Übertragen von Objekten in die oder aus der Kammer verwendet werden und ist notwendig, wenn cycling das Gas in der Kammer erforderlich ist.
    1. Sicherzustellen, dass die innere Schleusentür vollständig geschlossen ist.
    2. Öffnen Sie die äußere Schleusentür.
    3. Legen Sie Gegenstände in Luftschleuse und schließen Sie die äußere Schleusentür. Wenn die Einführung von Flüssigkeiten, schrauben die Kappen auf halbem Weg zu effizienten Gasaustausch zu gewährleisten. Sealed-Pakete, wie Impfösen und 96-Well-Platten müssen vor dem Beginn des Zyklus geöffnet werden.
    4. Drücken Sie Menü.
    5. Drücken Sie Start. Die Luftschleuse wird die Funktion jeder Taste anzeigen und reagiert nicht, bis dieser abgeschlossen ist:
      • Pfeil nach oben: aktiviert die Vakuumpumpe.
      • Pfeil nach unten: leitet den Stickstoff (Spülung) Gasstrom.
      • Beginn: löst den Gasfluss-Mix.
      • Menü: zur Standardanzeige zurück.
    6. Drücken Sie die "Up", Entfernen von Gas aus der Luftschleuse, bis das Display 20 inHg.
    7. Drücken Sie auf "Down" Füllen der Schleuse mit Stickstoff, bis das Display weniger als 1 inHg. Ov nichtershoot, da diese positive Druck innerhalb der Luftschleuse zu schaffen, die ihre Integrität beeinträchtigen können.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 6 und 7, eine zusätzliche Reinigungszyklus durchzuführen.
    9. Drücken Sie die "Up", bis im Display 20 inHg.
    10. Drücken Sie auf "Start", Füllen der Austausch mit Gasgemisch, bis das Display weniger als 1 inHg.
    11. Öffnen inneren Schleusentür.
    12. Verschieben Sie die Elemente in die Kammer.
    13. Schließen Sie Innentür.
  3. Manueller Modus
    Dieser Modus kann verwendet werden, wenn die automatische oder halb-manuelle Modi funktionieren nicht oder es ist keine Leistung an die Luftschleuse. Dieser Modus funktioniert nicht, wenn die Schleuse auf, daher ist es schwierig, den Druck in der Luftschleuse zu bestimmen. Da das Vakuum zu ziehen und Gasspülung Zeiten ist abhängig von Vakuum-und Gasdurchflussraten bzw. die Verwendung eines Druckmesser im Austausch erforderlich ist, um den Druck zu überwachen und das Risiko von Personenschäden und Schäden an der Luftschleuse zu reduzieren.
    1. Sicherzustellen, dass die innere Schleusentür vollständig geschlossen ist.
    2. Öffnen Sie die äußere Schleusentür.
    3. Legen Sie Elemente, einschließlich der Manometer, in Luftschleuse und schließen Sie die äußere Schleusentür. Wenn die Einführung von Flüssigkeiten, schrauben die Kappen auf halbem Weg zu effizienten Gasaustausch zu gewährleisten. Sealed-Pakete, wie Impfösen und 96-Well-Platten müssen vor dem Beginn des Zyklus geöffnet werden.
    4. Suchen Sie die drei Schalter auf der Rückseite der Luftschleuse mit "Manual Control Schalter". Diese werden individuell beschriftet als:
      • Vakuum
      • Stickstoff
      • Gas-Mix
    5. Klappen Sie den Vakuumschalter zum Umschalten bis das Manometer liest etwa 20 inHg.
    6. Klappen Sie den Stickstoff Kippschalter bis das Manometer liest etwa 1 inHg.
    7. Klappen Sie den Vakuumschalter zum Umschalten bis das Manometer liest etwa 20 inHg.
    8. Klappen Sie den Stickstoff Kippschalter bis das Manometer liest etwa 1 inHg.
    9. Klappen Sie den Vakuumschalter zum Umschalten bis das Manometer liest etwa 20 inHg.
    10. Klappen Sie den Gas Mix Kippschalter bis das Manometer liest etwa 1 inHg.
    11. Öffnen inneren Schleusentür.
    12. Verschieben Sie die Elemente in die Kammer.
    13. Schließen Sie Innentür.

2. Die Kultivierung, Aufzählen und Lagerung C. difficile aus Stuhlproben

Dieses Verfahren wurde entwickelt, um C zu erholen difficile aus Stuhlproben, die Sporen und in der Folge beibehalten isolierte Kolonien als vegetative Zellen oder Sporen in langfristige Lagerung als Glyzerin. Alternativ kann dieses Verfahren verwendet, um die Anzahl der C aufzuzählen difficile vorhanden in Stuhlproben (zB von Tierversuchen). Um C selektiv und unterschiedlich bereichern difficile, Taurocholat-Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (TCCFA) wird verwendet, um das Wachstum von normalen Fäkalflora 15-16 hemmen. Cycloserin ist bakteriostatisch für Gram-negative Bakterien, während Cefoxitin hemmt breiter Wachstum von sowohl Gram-negative und-positive Bakterien, mit Ausnahme von C. difficile und die meisten geben Kokken Stämme. Ein pH-Indikator Neutralrot, in dem Medium aufgenommen werden, da die Fermentation von Fructose zu einer Abnahme des pH-Wertes und einer anschließenden Farbwechsel von rot / orange nach gelb führen. Um effizient zu erholen Sporen von C. difficile als vegetative Bakterien, die Gallensalz Natriumtaurocholat wird verwendet, um die Keimung 17-18 induzieren. Da C. difficile-Sporen bildet, Alkohol oder einer Wärmebehandlung der Proben verwendet werden, zu reduzieren oder zu eliminieren vegetativen Zellen, Begrenzung des Wachstums von kontaminierenden Flora, die den Wirkungsgrad erhöhen kann von C. difficile Recovery 19. Wie oben erwähnt, ist es wichtig, vor Verringerung aller Platten für mindestens 1-2 h in die anaerobe Kammer vor der Verwendung, um die Entfernung des Restsauerstoffs zu sichern. Air drying die Platten vor der in der Kammer können Kondensation zu reduzieren. Flüssige Medium möglicherweise bis zu 24 h, je nach dem Volumen und der Oberfläche-zu-Luft-Verhältnis des verwendeten Behälters zu reduzieren.

Bevor Sie beginnen, sollten die folgenden Punkte in den anaeroben Kammer platziert werden:

  • Stuhlprobe
  • Sterile Tupfer
  • Sterile Impfösen
  • 1x PBS (siehe Materialien)
  • TCCFA Platten (siehe Materialien)
  • BHIS (Brain Heart Infusion Medium mit Hefeextrakt)-Platten und Brühe (siehe Materialien)
  • 50% Glycerin (sterilisiert)
  • 10% L-Cystein (sterilisiert)
  • Kryo-Lagerung Fläschchen

* Alternativ können isolierte Kolonien auf Agar-Platten BHIS bei -80 ° C verteilt werden, und anschließend abgekratzt und in BHIS flüssigen Medium resuspendiert mit 15% Glycerin für die langfristige Lagerung ** Es ist wichtig zu beachten, dass Gram-Färbung ist nicht eine wirksame Strategie zur Identifizierung C. difficile direkt aus Stuhlproben 23 ; C difficile muss zunächst von den anderen im Stuhl vorhanden Flora isoliert werden.

  1. Resuspendieren der Stuhlprobe in 1x PBS (dies kann unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden), und sicherzustellen, dass die Stuhlprobe vollständig in 1x PBS durch Vortexen resuspendiert. Wenn Aufzählung C. difficile aus dem Stuhl, wiegen die Stuhlprobe vor der Zugabe von 1 × PBS.
  2. Machen serielle Verdünnungen des resuspendierten Stuhlprobe in 1x PBS für geeignete Isolierung oder Aufzählung der koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm Stuhl.
  3. Unter aseptischen Bedingungen gelten 100 ul jeder seriellen Verdünnung auf TCCFA Platten.
  4. Mit einer Reihe von sterilen Impfösen, streifen die angelegte Kultur für isolierte Kolonien oder gleichmäßig verteilt die angelegte Kultur auf der Oberfläche der Platte TCCFA für die Zählung von Kolonien.
  5. Die Platte anaerob für 48 Stunden bei 37 ° C. Es ist möglich, zu erkennen und zu identifizieren, C. difficile Kolonien innerhalb von 24 h, bezogen aufdie flache, unregelmäßig, Boden-Glas-Optik der Kolonien 15, obwohl genauere Identifizierung und Zählung wird nach 48 Stunden erreicht.
  6. Mit einer sterilen Impfösen, Subkultur keine Kolonien, die auf C erscheinen difficile auf vorge reduziert BHIS Agar-Platten, mit 0,03% L-Cystein-20 ergänzt. Wählen Sie ein Einzelkolonie und Streifen auf den Teller in den Quadranten, mit einer neuen sterilen Impföse für jeden Quadranten, um isolierte Kolonien zu erhalten. Alternativ zählen die C. difficile-Kolonien von jeder Verdünnung (dies kann unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden), und berechnet die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Gramm Stuhlprobe.
  7. Bestätigen C. difficile-Identifikation über Gram-Färbung. Nach Gram-Färbung, C. difficile als lila Stangen erscheinen und einige Zellen Terminal Endosporen enthalten. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Identifizierung der Gene, die das Toxin B kodieren kann weitere Bestätigung lieferntoxigenen Stämmen von C. difficile 21, während Multilocus Sequenz Typisierung (MLST) erfolgreich für die Identifizierung und genaue Typisierung von unbekannten und nicht toxigene Stämme von C. ist 22 difficile.
  8. Um einen Bestand von C zu halten difficile bei -80 ° C, wählen Sie eine einzelne, isolierte Kolonie von der Agar-Platte BHIS mit einer sterilen Impföse und resuspendieren Kolonie in 10 ml vorge reduziert BHIS Flüssigmedium mit 0,03% L-Cystein ergänzt. *
  9. Inkubieren über Nacht anaerob bei 37 ° C, oder bis die Kultur trüb.
  10. Hinzufügen von 333 &mgr; l 50% Glycerol und 666 &mgr; l der C difficile-Kultur auf eine 1,8 ml Kryo-Rohr, um eine 15% Glycerin Lager des isolierten Stammes erstellen.
  11. Verschließe das kryogene Rohr, gut mischen und sofort den Stock aus dem anaeroben Kammer und in einem -80 ° C Gefrierschrank für langfristige Lagerung.

3. Kultivierung C. difficile Gefrorene aus Glycerol Stocks

Dieses Verfahren bietet für die Wiederherstellung von C. difficile aus bei -80 ° C gelagert Glycerinstamm Da wiederholte Frost-Tau-Zyklen können vegetativen Zellen zu töten, ist es wichtig, die Glycerin-Aktien zu jeder Zeit eingefroren zu halten. Wir empfehlen nicht den Einsatz von Trockeneis für die Übertragung von Stämmen in die und aus der Kammer, wie die Verdampfung von Trockeneis kann die Umwelt in der Kammer ändern. Stattdessen empfehlen wir die Verwendung von gefrorenem Kühl Racks Glycerin Aktien während des Transports eingefroren zu halten. Aus verschiedenen selektiven und differentiellen Zwecken werden drei Medien allgemein zum Kulti C verwendet difficile. TCCFA, wie oben diskutiert, ist selektiv für C. difficile und enthält Natriumtaurocholat, ein keim. Hirn-Herz-Infusion mit Hefeextrakt (BHIS) ergänzt ist eine häufig verwendete, angereicherten, nicht-selektiven Medium, das für das Wachstum einer großen Vielzahl von Organismen (2A) 24 ermöglicht. Häufig, L-Cysteine wird BHIS als Reduktionsmittel 20 aufgenommen. Schließlich wird die Zugabe von Blut in das Medium (2B) ermöglicht eine effizientere Sporulation als auf TCCFA und liefert für die Erkennung der einzigartigen grünliche oder gelbgrün Fluoreszenz von C. ausgestellt difficile unter langwelligem UV-Licht (UV) 15 (Abbildung 2C). Beim Kultivieren C. difficile-Sporen von Aktien, ist es wichtig zu bedenken, dass Natriumtaurocholat müssen dem Medium zugesetzt werden, um die Keimung zu gewährleisten.

Bevor Sie beginnen, sollten die folgenden Punkte in den anaeroben Kammer platziert werden:

  • Gefrorene Glycerin Lager (auf Rack-Kühlung)
  • Sterile Impfösen
  • TCCFA oder BHIS Platten (siehe Materialien)
  • BHIS Brühe (siehe Materialien)
  • 50% Glycerin (sterilisiert)
  • Kryo-Lagerung Fläschchen
  1. Legen Sie die gefrorenen Glycerin Lager von C. difficile in einem Rack-Kühlung, die bei -80 ° C gelagert wurde prIOR zu verwenden, um dem Auftauen zu verhindern.
  2. Bringt die gefrorenen Glycerin Lager auf Trockeneis in den anaeroben Kammer.
  3. Unter aseptischen und sterilen Impföse ein, legen Sie eine kleine Menge der Lager auf der Platte und Streifen über einen Quadranten der Platte.
  4. Drehen Sie die Platte 90 ° und mit einer neuen sterilen Impföse weiterhin Streifen über dem zweiten Quadranten.
  5. Wiederholen der dritten und vierten Quadranten, um die Isolierung von Einzelkolonien zu gewährleisten.
  6. Sofort den gefrorenen Glycerin Lager aus der anaeroben Kammer und zum -80 ° C
  7. Die Platte anaerob über Nacht bei 37 ° C Einzelne isolierte Kolonien sollte nach Wachstum über Nacht beobachtet werden.

4. Reinigende Sporen von C. difficile

Als Sporenbildung ist für das Überleben in sauerstoffreichen Umgebungen und für die effiziente Übertragung von Krankheiten 8 erforderlich ist, ist die Herstellung der Sporen Aktien oftefür nachgelagerte Anwendungen, um nicht zu Mikroskopie und Tierstudien beschränkt n erforderlich. Es ist wichtig zu beachten, dass die Aufzählung Sporen erfordert Wiederholung, um die Reproduzierbarkeit der Zählungen zu gewährleisten. Und Abpipettieren mehrmals zwischen Verdünnungen reduziert auch Verlust seit Sporen haften Kunststoff auch.

Die Sporenbildung von C. difficile ist nicht so homogen, wie schnell oder anderen sporogenen Arten. Zur Optimierung der Sporenproduktion und Wiederherstellung, entweder Sporulationsmedium (SMC) oder 17,25 70:30 Medium 26 wird empfohlen. Andere üblicherweise verwendete Medien sind BHIS, die 4-5 Tagen Wachstum erfordert, bevor eine effiziente Sporulation gesehen 27 und Clospore ein flüssiges Medium, das hohe Titer von Sporen produziert (7. Oktober - 8. Oktober Sporen pro ml) nach 72 h Wachstum. Andere Protokolle verwenden eiskaltem Wasser anstatt 1x PBS 20, jedoch kann die Verwendung einer isotonischen Lösung von Sporen aneinander kleben und Kunststoffoberflächen zu reduzieren. Alternativeinige Forscher weiter zu reinigen, deren Sporen mit einer Saccharose-Gradienten zu vegetativen Zellen und Zelltrümmer 29 vollständig zu entfernen.

Bevor Sie beginnen, sollten die folgenden Punkte in den anaeroben Kammer platziert werden:

  • Sterile Impfösen
  • BHIS, SMC und / oder 70:30 Platten (siehe Materialien)
  • BHIS Brühe (siehe Materialien)
  • 1x PBS, steril filtriert (siehe Materialien)
  1. Kultur-Stämmen aus gefrorenen Glycerin Lager auf vorge reduziert BHIS Platten und Inkubation anaerob über Nacht bei 37 ° C
  2. Restreak auf mehrere vorreduziertes SMC oder 70:30 Platten und Inkubation anaerob bei 37 ° C für 24-48 Stunden. Sporenbildung kann über Phasenkontrastmikroskopie verfolgt werden. Sporen erscheint hell, während vegetative Phase und Mutterzellen Phase dunkel erscheinen. * Alternativ können Sporen von 70:30 flüssigen Medium nach 24-48 Stunden gereinigt werden, welche 10 5 bis 10 6 Sporen pro Milliliter in Abhängigkeit von der strai ergibtn verwendet.
  3. Mit einer sterilen Impföse, kratzen Platten und Resuspendieren der Zellen in 10 ml sterilem 1x PBS.
  4. Entsorgen Platten und entfernen Sporensuspension aus der anaeroben Kammer. Die Zellen zu pelletieren bei 3.000 × g für 15 Minuten. In 1x PBS waschen die Zellen zweimal, jedes Mal vollständig Resuspendieren des Zellpellets.
  5. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C bis zur Lyse des vegetativen und Mutterzellen zu unterstützen.
  6. Inkubation bei 70 ° C für 20 min, um alle restlichen vegetativen Zellen zu töten.
  7. Um zu bestimmen, koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Milliliter, seriell verdünnt jedes Sporenzubereitung in 1x PBS und Platte auf BHIS + 0,1% Natriumtaurocholat. Inkubation erfolgt für mindestens 24 Stunden vor der Aufzählung Kolonien.
  8. Sporen können in 1x PBS entweder bei Raumtemperatur oder 4 ° C für die Langzeitspeicher gespeichert werden. Bei 4 ° C gelagert wird, kann es nützlich sein, den Sporenzubereitung bei 55 ° C für 15 min erwärmen, um eine effiziente Keim wiederherzustellen.

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Ergebnisse

Ein Beispiel C difficile auf BHIS und Columbia anaerobe Schafblut-Agar-Medien gezüchtet in Fig. 2 zu sehen ist. C. difficile bildet unregelmäßige Kolonien, die flach sind und einen Boden-Glas-Optik, die auf beiden Medien ist evident. Hier wird ein Erythromycin-sensitive klinischen Isolat von C. difficile, 630E 30 wird auf BHIS Agar, einer angereicherten, nicht-selektives Medium für 24 Stunden bei 37 ° C (2A) gewachsen. Kolonien auf Columbia anaerobe...

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Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine einfache und schnelle Wiederherstellung von C difficile aus einer Vielzahl von Stuhlproben, einschließlich Menschen, Mäuse und Hamster, sowie die Langzeitlagerung von C difficile Glycerin oder Sporen Aktien. C difficile kann eine schwierige Organismus zu kultivieren, aber sorgfältige Wartung einer anaeroben Umgebung und die Anwendung aseptischer Techniken können für robustes Wachstum und eine Verringerung der Verschmutzung bieten.

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir möchten Coy Laboratories für die freundliche Bereitstellung von Bildern der anaeroben Kammer danken. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss DK087763 (SMM) und einem STEP / HHMI Lehrplanentwicklung Fellowship (ANE) unterstützt.

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Materialien

TCCFA agar


24
24

4










BHIS Medium











SMC Sporulation Medium



424








70:30 Medium





424




Blood agar

35

1X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)



24
24

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Proteose Pepton Nr. 2BD212120
Na2HPO4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4 (wasserfrei)FisherM65
á'...-FruktoseFisherL96
NatriumtaurocholatSigmaT4009
á'...-CycloserinSigmaC6880
CefoxitinFlukaC4786
Gehirn Herz InfusionsmediumBD237300
Proteose PeptonBD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris-BaseFisherBP152
AgarBD214010
L-CysteinSigmaC7755
BactoPeptonBD211684
Kolumbianisches Schafblut-AgarFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
GlycerinFisherBP2291
Sterile ImpfösenFisher22363596
Sterile TupferFisher1495990
Coy Vinyl Anaerobe Kammer und ZubehörCoy Laboratory Products, InckundenspezifischDiese Artikel werden pro Laborbedarf
Materials<
individuell bestellttd colspan="4"> Proteose Pepton Nr. 2 (Difco) 40 g NaHPO 5 g KHPO 1 g NaCl 2 g MgSO (wasserfrei) 0,1 g Fruktose 6 g Agar 20 g Mit entionisiertem Wasser auf 1 L bringen und bei 121 μg autoklavieren; C für 20 min sterilisieren. Nach dem Autoklavieren zugeben: 10 ml 10% (w/v) Natriumtaurocholat, filtersterilisiert (in Wasser auflösen; Endkonzentration 0,1%) 25 ml 10 mg/ml á'...-Cycloserin, filtersterilisiert (in Wasser auflösen; Endkonzentration, 250 μ g/ml) 1,6 ml von 10 mg/ml Cefoxitin, filtriert sterilisiert (in Wasser auflösen; Endkonzentration, 16 μ g/ml) Gehirn Herz Infusion 37 g Hefeextrakt 5 g Für Platten 15 g Agar zugeben. Mit entionisiertem Wasser auf 1 L bringen und bei 121 °C autoklavieren; C für 20 min zum Sterilisieren. Optional (nach dem Autoklavieren hinzufügen): 3 ml 10 % (w/v) L-Cystein (in Wasser auflösen; Endkonzentration 0,03 %) 10 ml 10 % (w/v) Natriumtaurocholat (in Wasser auflösen; Endkonzentration 0,1 %) BactoPepton 90 g Protease Pepton 5 g (NH)SO 1 g Tris-Base 1,5 g Agar 15 g Mit entionisiertem Wasser auf 1 L bringen und bei 121 μg autoklavieren; C für 20 min sterilisieren. Optional (nach dem Autoklavieren hinzufügen): 3 ml 10% (w/v) L-Cystein (in Wasser auflösen; Endkonzentration 0,03%) BactoPepton 63 g Protease Pepton 3,5 g Gehirn Herz Infusion 11,1 g Hefeextrakt 1,5 g (NH)SO 0,7 g Tris-Basis 1,06 g Für Platten 15 g Agar hinzufügen. Mit entionisiertem Wasser auf 1 L bringen und bei 121 °C autoklavieren; C für 20 min sterilisieren. Nach dem Autoklavieren 3 ml 10 % (w/v) L-Cystein (Endkonzentration 0,03 %) hinzufügen. Die Verwendung von vorgefertigten anaeroben Agarplatten aus Columbia-Schafsblut (Fisher Scientific, L21928) wird empfohlen. NaCl 8,01 g KCl 0,2 g NaHPO 1,44 g KHPO 0,27 g Mit entionisiertem Wasser auf 1 l bringen und den pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen. Vor Gebrauch sterilisieren.

Referenzen

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

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