Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.
Einleitung
Primären Neuronen eine der schwierigsten Zelltypen zu transfizieren, wie sie sind postmitotischen und sind sehr empfindlich gegenüber Mikroumweltveränderungen. Es gibt vier häufigsten verwendeten Arten von Verfahren zur Expression von exogenen Genen und Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) in diesen Zellen ein. Jeder hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Zum Beispiel wird in der Regel auf Elektroporation frisch isolierten Neuronen 2 durchgeführt, wie Zellen müssen in Küvetten für die Transfektion übertragen werden. Virus-Infektion kann in der Regel sehr hohen Wirkungsgrad erreichen, 3, ist aber arbeitsintensiv und riskant für die Betreiber....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vorbereiten Rat Astrocyte Kultur für konditionierte Medien und Astrocyte-Neuron-Kokulturen.
- Bereiten Dissektion Puffer (BSS, siehe Tabelle 1 für Rezept) und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Anesthetize neonatalen Rattenjungen (P0-P2) mit Isofluran in einem 500 ml-Becherglas.
- Bei Jungtieren sind unbeweglich, Spray mit 70% Ethanol und enthaupten.
- Entfernen Sie das Gehirn.
- Halten Sie den Kopf fest mit einem Paar von Dumont Nr. 5 Pinzette und einer feinen Schere verwenden, um einen Mittelschnitt durch die Haut und Schädel zu machen.
- Expose das Gehirn durch die Reflexion der Schädel an den Seiten....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Wenn die verschiedenen Parameter der Transfektion optimiert und sorgfältig von Experiment zu Experiment gesteuert, ist es möglich, Transfektionseffizienzen von bis zu 50% zu erhalten. Fig. 1 zeigt ein Feld von Neuronen, die mit GFP auf DIV4 transfiziert sind. Das Feld enthält insgesamt 28 Neuronen, von denen 16 wurden transfiziert. Dies entspricht einem Wirkungsgrad von über 50%. Eine Probenahme von anderen Bereichen auf dem gleichen Deck zeigt den Gesamtwirkungsgrad liegt bei 50% (Daten nicht gezeigt)........
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Es gibt mehrere wichtige Parameter, die sorgfältig für konsequent erfolgreiche Transfektionen 10,11 kontrolliert werden müssen. Der kritischste Parameter zur Calciumphosphat-Transfektion ist der pH-Wert von 2 x HBS, die in unseren Händen variiert üblicherweise zwischen 7,10 bis 7,15. Es wird empfohlen, drei Chargen von Titeln mit pH-Werten in 0,05-Schritten, um die Differenz zwischen den pH-Meter ausmachen. Alternativ stellt die Clontech Säugetier Transfektion Kit 2x HBS, die durchweg guten Wirkungsgrad ergib.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Konflikte Interesse erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von NIH NS065183 und Start-up-Fonds von der Rutgers Robert Wood Johnson Medical School unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Pinzette | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Feine Schere | Fine Science Tools | 14090-09 | gerade / scharf 8,5 cm |
| Vannas-Tubinger Federschere | Fine Science Tools | 15008-08 | abgewinkelt / scharf / 8,5 cm / 5 mm Schneide |
| Zange mit Standardmuster | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student chirurgisch Schere | Fine Science Tools | 91401-14 | stumpf / 14,5 cm |
| Federschere | Fine Science Tools | 15006-09 | abgewinkelt / 9 cm / 10 mm Schneide |
| Isofluran | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Natriumpyruvat | Sigma | S8636 | |
| Glukose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7,3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasale Medien | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Ergänzung (50x) | Gibco/ Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2,5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosin Arabinosid | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurensäure | Sigma | K3375 |
Referenzen
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
