Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren In Vivo

Zusammenfassung

Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.

Zusammenfassung

Membranproteine ​​sind essentiell für die Lebensfähigkeit der Zellen und sind daher wichtige therapeutische Ziele ^3.1. Da sie in den Komplexen ⁴ funktionieren, sind Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung ihrer Wechselwirkungen notwendig ^5. Zu diesem Zweck haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment genannt Membran-Dorn ^6. Diese Technik kombiniert in vivo Vernetzen unter Verwendung des reversiblen Vernetzungsmittel Formaldehyd mit Affinitätsreinigung von Strep-tag eine Membran Köderprotein. Während des Verfahrens sind vernetzte Beuteproteine ​​mit der Membran Köderprotein co-gereinigt und anschließend durch Kochen getrennt. Daher können zwei wichtige Aufgaben bei der Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) von Membranproteinen mit Membran-Dorn ausgeführt werden: erstens die Bestätigung einer vorgeschlagenen Interaktionspartner durch Immunoblotting, und zweitens die Identifizierung neuer Interaktionspartner von Massenspektrometrie-Analyse . Außerdem, selbst low Affinität, sind vorübergehende PPI durch diese Technik nachweisbar. Schließlich ist Membran-SPINE anpassungsfähig an nahezu jeden Zelltyp, so dass es zutreffend als ein leistungsfähiges Werkzeug, um Screening PPI von Membranproteinen zu identifizieren.

Einleitung

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seinen Interaktionspartnern kennen. Mehreren klassischen Techniken zur Identifizierung von Interaktionspartnern von löslichen Proteinen zur Verfügung. Jedoch sind diese Techniken nicht ohne weiteres übertragbar, um Proteine ​​aufgrund ihrer hydrophoben Natur ⁴ Membran. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment (Membran-spine) ⁶ entwickelt. Es basiert auf der Methode DORN, die nur für lösliche Proteine ​​geeignet war ⁷ basiert.

Membran-SPINE profitiert von zwei Vorteile des Vernetzungsmitte....

Protokoll

Hinweis: Detaillierte Informationen zur Puffer im Protokoll angegeben ist in Tabelle 1 verfügbar.

1. Fixierung von Protein-Protein-Interaktionen durch Formaldehyd-Vernetzungs in lebenden Zellen

1. Um zu beginnen vorzubereiten Wachstumsmedien, Stammlösungen und Puffer P1
   1. Bereiten 500 ml Medium: Das Medium sollte Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen Membran Köderprotein und Beuteproteine ​​unterstützen. Darüber hinaus sollte ein Versuch unter Bedingungen, bei denen keine Wechselwirkung zu erwarten ist (z. B. ohne Vernetzung) durchgeführt werden.
      Anmerkung: Wir vergleichen Protein-Pro....

Ergebnisse

Membran SPINE-Analyse erlaubt die Co-Reinigung von Membranproteinen und transient interacting protein Partnern. Die Co-Reinigung unter Verwendung der Vernetzungsmittel Formaldehyd erreicht. Zwei Parameter sind wichtig, um unspezifische Vernetzungen verhindern: die Formaldehyd-Konzentration und der Vernetzungszeit. Die ausreichende, aber nicht übermäßige Verwendung von Formaldehyd kann leicht durch Immunoblotting gesteuert werden. Formaldehyd vernetztem Protein-Komplexe durch Kochen aber nicht durch SDS-Behandlung abgetr.......

Diskussion

Membran SPINE Analyse ist ein biochemischer Ansatz, ermöglicht ein, um zu bestätigen und um zu diesem Punkt unbekannte Interaktionspartner von Membranproteinen zu identifizieren. Membran SPINE vereint in vivo Vernetzung durch Formaldehyd mit Reinigung eines Strep-markierten Membranköderprotein. Die Kombination mit Immunoblotting erleichtert den Nachweis von vorhergesagten Wechselwirkungspartner (Fig. 2). Zusätzlich wird die Verbindung mit MS-Analyse erlaubt die Identifikation unbekannter Intera.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
37% Formaldehyd	Roth	4979.1	Sollte nicht älter als ein Jahr sein
DNaseI	Sigma	DN25
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225
Mikromagnetischer Stab	Roth	0955.2	5 mm lang, 2 mm Durchmesser
Triton X-100	Roth	6683.1	Standardreinigungsmittel zur Solubilisierung
n-Dodecyl-β-Maltosid	Glycon	D97002-C	das beste Reinigungsmittel zur Solubilisierung von CpxA
1 ml Strep-Tactin Superflow-Schwerkraft-Flow-Säule	IBA	2-1207-050
Strep-Tag Proteinreinigungspuffer Set	IBA	2-1002-001	Enthält Puffer W und Puffer E
Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat	Pierce	34080
SilverQuest Silberfärbekit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Färbekit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultrazentrifuge