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Methodenartikel

Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

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DOI:

10.3791/50816

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31. Dezember 2013

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1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Zusammenfassung

TRPV4 (Transient Receptor Potentiale, Vanilloid-Familie, Typ 4) ist weit verbreitet in Wirbel Geweben exprimiert und wird von mehreren Stimuli, unter anderem durch mechanische Kräfte aktiviert. Bestimmte Mutationen verursachen TRPV4 komplexe erbliche Knochen oder neuronalen Erkrankungen in Menschen. Wildtyp-oder mutierten TRPV4 Transgene werden üblicherweise in kultivierten Säugerzellen exprimiert und durch Fura-2-Fluorometrie und Elektroden untersucht. In Bezug auf den Mechanismus der Mechanosensitivität und der molekularen Grundlagen von Krankheiten, ist die gegenwärtige Literatur verwirrend und umstritten. Um bestehende Methoden zu ergänzen, beschreiben wir zwei zusätzliche Methoden, um die molekularen Eigenschaften des TRPV4 zu untersuchen. (1) Rat TRPV4 und ein Aequorin Transgen in Hefezellen transformiert. Ein Hypo-osmtic Schock der Trans Bevölkerung ergibt eine luminometrische Signal aufgrund der Kombination von Aequorin mit Ca 2 + durch die TRPV4 Kanal veröffentlicht. Hier TRPV4 wird von seiner üblichen Säugetierpartnerproteine ​​isoliertund offenbart seine eigene Mechanosensitivität. (2) von TRPV4 cRNA in Xenopus-Oozyten injiziert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die makroskopische TRPV4 Strom mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme sucht. Der aktuelle Anstieg bei der Entfernung von inerten Osmotikums aus der Eizelle Bad ist bezeichnend für Mechanosensitivität. Die Mikroampere (10 -6 bis 10 -4 A) Ströme von Oozyten sind viel größer als die subnano zu Nanoampere (10 -10 bis 10 -9 A) Ströme aus kultivierten Zellen, was zu klareren und Quantifizierungen sicherer Abschätzungen. Mikroskopische Ströme reflektieren die Aktivitäten der einzelnen Kanalproteine ​​können auch direkt unter einer Patch-Clamp-registriert werden, auf der Zelle herausgeschnitten oder-Modus. Das gleiche Eizelle bietet mehrere Patch-Proben, die eine bessere Datenreplikation. Ansaugung zu den Patches können TRPV4 aktivieren, um direkt beurteilen Mechanosensitivität. Diese Verfahren sollten auch bei der Untersuchung anderer Arten von TRP-Kanälen sein.

Einleitung

TRP (transient receptor Potenziale) aus sieben Unterfamilien der Kationenkanäle, 1,2 sensorischen Funktionen dienen. Bei Säugetieren TRPV die Vanilloid Unterfamilie der TRP, sechs Sorten. TRPV4 (Typ 4) 3,4 reagiert auf Wärme, bestimmte Chemikalien, osmotische Schwellung oder Scherbeanspruchung. Das TRPV4-Gens wurde wiederholt von Kandidaten-Gen und / oder Expression Klonen 5-8 isoliert. Die letztere Methode folgte die Antwort des Genprodukts zu Hypo-Osmolarität. TRPV4 in fast allen Organen und Funktionen in der Entwicklung, Physiologie und Pathologie von vielen unterschiedlichen Zelltypen 3,4 ausgedrückt.

Auffällig sind die> 50 menschliche autosomal dominant TRPV4 Mutationen, wodurch periphere Neuropathien und / oder Skelettdysplasien (Anomalien in der Skelettentwicklung) 11.09. Die Skelettdysplasien reichen von leichten brachyomia Typ 3 (Typ-3-Zwergwuchs), Dysplasie, spondylometaphysäre Kozlowski-Typ, um SeveWieder Dysplasien, einige verursachen neonatalen oder embryonale Tod. Obwohl alle Arten der Mechanismen möglich scheint, erklärt keiner die Vielfalt, Komplexität, Variabilität und gelegentliche Überschneidungen dieser Krankheiten 4.

Wie andere TRP-Kanäle 1, ist TRPV4 ein Tetramer. In Ratten-oder Menschen TRPV4 wird jede Untereinheit von 871 Resten bestand. Zentrales Element ist ein sechs Transmembran-Helices (S1-S6), die geeignet in einer Weise ähnlich zu spannungsabhängigen K +-Kanäle angeordnet sind. Dort S1 bis S4 bilden eine Umfangs Domäne und die S5 und S6 bilden die Permeation Porendomäne. Zwischen S5 und S6 von TRPV4 ist eine kurze Porenhelix gefolgt von der Sequenz LDLFKLTIGMGDL, von denen vier vermutlich konvergieren, um die Kationenfilter bilden. Die 470-Rest N-terminalen cytoplasmatischen Segment enthält 6 Ankyrin Wiederholungen bekannt, Proteine ​​oder kleine Liganden zu binden. Die C-terminale 152-Rückstand cytoplasmatischen Segment eine Calmodulin-Bindungssequenz unter anderen möglichen Seiten, ot bindenihr Elemente 3.

TRPV4 ist ein Kationenkanal, der im Wesentlichen schließt Anionen ein. Während seiner physiologischen Funktion ist um Stimuli an Ca 2 +-Einstrom zu transduzieren, ist es auch durchlässig für andere Kationen mit einer Eisenman-Sequenz IV Durchlässigkeit, bei einer Begünstigung zweiwertiger P Ca: P Na ~ 7 12. Einzelkanalleitfähigkeit richtet bei ~ 90 pS nach außen und nach innen ~ 40 pS 6,13,14. Heterolog exprimiert Strom (unten) kann durch hypo-osmotischen Schwellung, Schubspannung, Wärme oder 15 aktiviert werden. Es wird auch von mehrfach ungesättigten Fettsäuren 16,17 und das synthetische Ester phorbal 4αPDD 18 aktiviert. Derzeit ist die potenter Agonist GSK1016790A 19 und Antagonist GSK2193874, wirksam bei 10 -9 bis 10 -8 M-20, die beide von Hochdurchsatz-, Kleinmolekülbild entdeckt.

Zwei Schlüsselbereiche der Forschung zu bleiben verwirrend TRPV4: (1) Schon als TRPV4 ist weitgehend für seine Mechanosensitivität studiert, ist seine molekulare Basis umstritten. Ein Modell beschreibt Hypo-Osmolarität irgendwie aktiviert Phospholipase A2 (PLA2), die mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA) Arachidonsäure (AA), die umgewandelt Säure (EET) von einem Epoxygenase Epoxyeicosatrienoide ist zu produzieren, und die Bindung von EET aktiviert TRPV4 16, 17. Doch selbst TRPV4 wurde gezeigt, direkt an Membran Strecke 14 (unten) zu reagieren, um eine einfachere Erklärung. (2) Die TRPV4 Mutante Pathologien sind verwirrend. Die Grundlage, muss man wissen, ob die Erkrankungen, die durch den Verlust, der Verringerung oder die Erhöhung der Kanalaktivitäten. Auch hier ist die Literatur alles andere als klar. Während mehrere Skelett-Dysplasie-Allele wurde berichtet, dass höhere Aktivitäten haben, (Gain-of-function, GOF) 4,21, mehrere wurden gemeldet, Aktivitäten (Loss-of-function, LOF) 10,22 reduziert. Eine systematische Untersuchung von 14 Allele gefunden, sie zuAlle GOF werden Mutationen (unten) 23. Die Behauptung, dass einige sind LOFs scheint den Phänotyp des TRPV4-/ widersprechen - Knockout-Maus, die lebensfähig oder fruchtbar sind, mit nur geringfügigen Mängeln, trotz einem vollständigen Verlust des TRPV4-Funktion.

Ein Teil dieser Kontroversen methodische Herkunft. Laboratories verwenden unterschiedliche Methoden oder Varianten einer Methode und verwenden unterschiedliche Beurteilungsstandards. Am häufigsten wird TRPV4 transient in kultivierten Säugerzellen exprimiert (HEK, CHO, HeLa) und der Anstieg des Innen [Ca 2 +] auf Agonisten oder hypotonen Stimulation mit Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 eingetragen. Die übermäßige Abhängigkeit von dieser fluorimetrischen Test ist kritisiert worden, ein. Das Expressionsniveau in verschiedenen Populationen, die Verteilung darin sowie die wirksame Farbstoffkonzentration, müssen kontrolliert und dokumentiert werden. Zuverlässiger ist die direkte elektrophysiologische Untersuchungen. Auch dieser, wie commonly praktiziert wird, ist auch nicht ohne Probleme. Da die Expressionsmengen in einzelnen kultivierten Zellen sind schwierig zu steuern, Ganzzellströme großen Schwankungen. Da ferner die Ströme klein sind, werden zuverlässige Statistiken müssen auf große Stichproben, die oft nicht praktisch verlassen. Patch-Clamp-Untersuchungen nur selten durchgeführt. Einige dieser Aufnahmen zeigen Gruppen von Aktivität Bursts statistische Auswertung anspruchs 16,17 zu machen.

Um die molekularen Mechanosensitivität besser zu verstehen, haben wir zwei weitere Systeme entwickelt, um TRPV4 zu untersuchen. (1) Um TRPV4 weg von seiner üblichen Säugetier Partner zu isolieren, haben wir Ratten TRPV4 in Bäckerhefe 24 ausgedrückt. Die funktionelle Expression von TRPV4 in diesem evolutionär entfernten Zusammenhang zeigte, dass es noch osmotische Kraft zu reagieren, ohne seinen üblichen Partnern. Da Hefe macht keine PUFA wie AA oder EET, und sein Genom hat keine PLA2 oder Epoxygenase Gene, die diese expression zeigt auch, dass sie nicht erforderlich sind, um für TRPV4 Kraft zu spüren. Mit TRPV4 in den molekularbiologisch am ehesten zugänglich Eukaryonten ermöglicht auch eine effiziente zukunfts oder Reverse-25 genetische Manipulationen. (2) Für umfassende Analysen der biophysikalischen TRPV4, ausgedrückt wir TRPV4 in Xenopus-Oozyten. Anders als kultivierte Zellen, die Unter nA nA (10 -10 bis 10 -9 A) Ströme ergeben, eine Oozyte exprimiert Ströme in uA ist (10 -6 bis 10 -4 A). Viel größere Rauschsignal über eine bessere Quantifizierung und selbstbewusster Vergleich. TRPV4, so ausgedrückt, kann auch als Einzelmoleküle unter Verwendung eines Patch-Clamp sucht werden. Eine einzige Eizelle ermöglicht wiederholte Patch Probenahme, wieder machen Quantifizierung zuverlässiger. Solche Studien haben gezeigt, dass TRPV4 Kanal selbst kann direkt durch Membran Strecke Kraft 14 aktiviert werden. Die Analysen zeigten, dass 14-Dysplasie repräsentativen Skelett Allele sind alle gain-of-function-Mutationen. Ferner ist die degree des konstitutiven Ca 2 + Leck Parallelen der Schwere der Erkrankungen der Skelett 23.

Aufgrund ihrer Neuheit und Nützlichkeit sind die detaillierten Verfahren dieser beiden Methoden hier versammelt, um Wiederholungen in Zukunft Forschung auf TRPV4 oder ähnliche Kanäle ermöglichen.

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Protokoll

1. Hefe Luminometrie Methoden

Verwenden BYYT Stamm von Saccharomyces cerevisiae. Es ist ein yvc1-TOK1-Derivat von BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, TOK1 :: kanMX4). Trans Zellen mit den leu-wählbar Aequorin-exprimierenden Plasmid pEVP1/Aeq und ura wählbare rat-TRPV4-exprimierenden Plasmid p416GPDV4, wie in Batiza et al. Loukin 26 und et al. Beschrieben 24 Verwenden Sie Standard-Methoden von Plasmid-Bau und Umbau 27 . Hefestamm und Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.

  1. 2 ml Kultur von Hefe-Zellen über Nacht auf post-logarithmischen Phase in ein 30 º C-Schüttler in leu-ura-"DCD" Dropout-Medium 28 (a Sulfat abgereicherte Variante der CMD-Leu-ura-Medium 29), ergänzt mit 1 M Sorbitol . Beimpfen von 200 &mgr; l dieser Kultur in 1,8 ml frisches Medium mit 2 &mgr; M des luciferi ergänztn Coelenterazins. Wachsen in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für weitere 24 h ohne Schütteln.
  2. Messung der Osmolarität der Kultur (typischerweise bei 1400 mOsM) und andere Lösungen (unten) mit Hilfe eines Dampfdruck-Osmometer.
  3. Aliquot 20 ml frisches Kultur in ein 12 mm Luminometerröhrchen für ein einzelnes Rohr Luminometer.
  4. Für die hypotonischen Schock, 200 ul einer Lösung, enthaltend 25 mM NaEGTA (pH 7,2) oder Namen (pH 7,2) und 500-100 mM NaCl (insgesamt Osmolarität 1,200-400 mOsM), je nach dem Grad der gewünschten Schlag. Die Lumineszenz vor kontinuierlich zu überwachen und mindestens 120 Sekunden nach dem osmotischen downshock, unterbrochen nur von der kurzen Verdünnungsbetrieb. Registrieren Luminometer Ausgang auf einem Desktop-Computer als relative Lumineszenz-Einheiten (RUL).

Obwohl nicht für die Untersuchung von transgenen TRPV4 haben wir eine Variante des obigen Protokolls in einem automatisierten System verwendet werden, um die Antworten von einer Vielzahl von Hefestämmen zu untersuchen. Studie of die Antworten auf die hypo-30 oder 31 hyperosmotische Reize der Hefe deletome (die Sammlung von 4.906 Hefe-Single-Gen Deletanten) mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometer und mit entsprechender Software ausgewertet war erfolgreich.

2. und 3. Eizellenelektrophysiologie Methoden

Elektrophysiologie hat grundlegende Methoden 32. PCR verstärken die offenen Leserahmen von Wildtyp-oder mutierten TRPV4 mit High-Fidelity-Polymerase und PfuUtra in pGH19 33 integriert. Dies erfordert eine genaue Insertion des ORFs zwischen den 5 'und 3'-UTR des Xenopus-β-Globin-Gens und stromabwärts von einem T7-RNA-Polymerase-Promotor. Linearisieren der Konstruktion stromabwärts der 3'-UTR und als Template in einem in vitro T7-RNA-Polymerase-Reaktion verwendet. Verwenden Sie Standard-molekularbiologische Techniken 34.

Verwenden Stadium V-VI Oozyten von X. laevis. Tierhaltung, Teil ovariectomy, defolliculation und Dotter Umschlag Entfernung folgen Standardverfahren 32,33,35. Inject 2-40 ng cRNA-Lösung pro Eizelle mit einem Drummond Nanoinject II Automatik Mikroinjektor. Injizieren ~ 30 Oozyten für jeden Satz von Experimenten. Nach TRPV4-cRNA Injektion, Inkubation der Oozyten in der ND96 Medium mit Gentamicin (100 ug / ml) und 1 uM Ruthenium Red 14.

2. Zweielektroden-Spannungsklemmen

  1. Ziehen Borosilikatglas Aufnahme Präzisionspipetten von Einweg-Mikropipetten 100 ul einzeln mit einer Pipette Magnet.
  2. Ziehen sowohl Spannungs-Mess-und Strominjektionspipette Elektroden werden gezogen, um eine Spitzenöffnung von ~ 1 Mikrometer Durchmesser haben.
  3. Backfill-Elektroden mit 2 M KCl was 0,1-0,2 mOhm Widerstand. Montieren Sie sie auf HS2A headstages, die zusammen mit einem VG-2Ax100 virtuelle geerdete Bad Klemme, werden zu einem Verstärker Geneclamp 500 Schnittstelle über eine Digidata 1440 Digitalisierer verbunden. Erwerben Daten mit pClamp10 Software.
  4. Zeigen die Eizelle in einem 1 ml Bad in einer vorgefertigten Kunststoffkammer auf der Stufe eines Binokular mit 20-facher Vergrößerung montiert getestet werden. Die Badlösung virtuell geerdet durch eine 3 M KCl-Agar-Brücke und einem chlorierten Silberdraht in der Nähe der Eizelle eingebracht und an einem VG-2A virtuellen Masse Stufe verbunden.
  5. Konstruieren Sie die Kammer für die kontinuierliche Perfusion mit Kunststoffschläuche als Ein-und Auslauf Lösung. Verbinden der Einlaßleitung ist mit einem vorgefertigten Perfusionssystem, die eine Mannigfaltigkeit von sechs 50-ml-Spritze Schalen, jede mit einer anderen Lösung gefüllt ist, verbunden. Gravity Feed Raten einer beliebigen Lösung gesteuert wird, um ~ 3.2 ml / min mit "Keck" Rampe Schellen an den Schläuchen.
  6. Montieren Sie beide Elektroden mit ihren headstages auf Mikromanipulatoren. Führen Elektrodendurchführungen der Eizelle durch Mikromanipulation.

3. Patch-Clamp-Untersuchung der Direkt Mechanosensitivität

"> Die grundlegenden Methoden der Patch-Clamp-Pipette einschließlich Vorbereitung, GOhm-Dichtung Bildung und die Bildung von Ein-Zelle herausgeschnitten oder Betriebsarten sind die in Hamill et al. Conn 36 und 32.

  1. Füllen Borosilikat-Glaspipetten mit einem ~ 1 um Durchmesser Öffnung an der Spitze (Blasenzahl 5-6) mit 98 mM KCl, 1 mM MgCl 2 und 10 mM K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Befestigen der Patch-Clamp-Pipette durch einen Kunststoffschlauch mit einer 5 ml Spritze durch eine T-Verbindung, die auch mit einem Manometer. Verwenden Sie einen Computer, um sowohl die Elektrode und die Manometer Ausgänge verarbeiten. Erwerben Daten bei 10 kHz, und spielen dann wieder durch einen achtpoligen Bessel-Filter bei 1 kHz für die Analyse.
  3. Verschiedenen Patches aus demselben Eizelle wiederholt ausgeschnitten werden. Diese Praxis macht die Untersuchung der molekularen TRPV4 Tätigkeit effizienter und zuverlässiger.

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Ergebnisse

In einem typischen Experiment Luminometrie, wird ein Bereich von 400-1200 mOsM hypotone unten Schocks durch Zugabe von 200 ul von Schock-Lösungen unterschiedlicher niedrigen Osmolarität zu 20 ul Kultur bei 1.400 mOsM erreicht. Die TRPV4 Aktivität ist offensichtlich, wenn die RLU der experimentellen wird, daß von zwei negativen Kontrollen verglichen: Hefezellen mit leeren p416GPDV4 Plasmid oder eine, die die TRPV4 Gen mit einer Mutation an der Ionenfilter (Fig. 1) 24 enthält, transfor...

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Diskussion

Wie in der Einleitung erwähnt, die häufig verwendet, um Funktionen zu studieren TRPV4 Methoden führte manchmal in Widersprüche und Kontroversen. Die zwei Sätze von hier beschriebenen Methoden bieten einige Vorteile und kann die vorhandenen Methoden zu ergänzen. Während wir nur die Studien zu TRPV4 beschreiben, können die Verfahren auch auf andere Ionenkanäle als auch studieren.

1. Hefe Luminometrie Methoden

Angehende Hefe hat eine native Ca 2 +-Einstrom ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Wir möchten Andrea Kremsreiter für hervorragende technische Unterstützung danken. Madison - Die Arbeit in unserem Labor wird von NIH GM096088 und Vilas Vertrauen der Universität von Wisconsin unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DampfdruckosmometerWescorWescor 5500Logan, UT, USA
Sirius Einröhren-Luminometer Titertek-BerholdSiriusHuntsville, LA, USA
Mikroplatten-LuminometerTitertek-BertholdMithras LB940Huntsville, LA, USA
Luminometrie-SoftwareTitertek-BertholdMikroWin2000Huntsville, LA, USA
Patch-Klemme und SoftwareAxon InstrumentHS2A Kopftisch, VG-2Ax100 virtuelle geerdete Badklemme, GeneClamp 500 Verstärker, Digidata 1440 Digitizer, pClamp10 SoftwareUnion City, CA, USA
ManometerBio-TecWinooski, VT, USA
PipettenabzieherSutter Instrument CoModell P-97Novata, CA, USA
MikroinjektorDrummond ScientificNanoinject IIBroomall, PA, USA
Luciferin CoelenterazinInvitrogenCarlsbad, CA, USA
T7 RNA-Polymerase ReaktionAmbionmMessage mMachineAustin, TX, USA
GentamicinSigma 
Ruthenium rot Sigma 
Mikropipetten Drummond100 Mikroliter MikropipettenBroomall, PA, USA
High-Fidelity PfuUtra Polymerase StratageneLa Jolla, CA, Vereinigte Staaten von Amerika

Referenzen

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