Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

Zusammenfassung

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca ^{2 +-Aequorin} Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Zusammenfassung

TRPV4 (Transient Receptor Potentiale, Vanilloid-Familie, Typ 4) ist weit verbreitet in Wirbel Geweben exprimiert und wird von mehreren Stimuli, unter anderem durch mechanische Kräfte aktiviert. Bestimmte Mutationen verursachen TRPV4 komplexe erbliche Knochen oder neuronalen Erkrankungen in Menschen. Wildtyp-oder mutierten TRPV4 Transgene werden üblicherweise in kultivierten Säugerzellen exprimiert und durch Fura-2-Fluorometrie und Elektroden untersucht. In Bezug auf den Mechanismus der Mechanosensitivität und der molekularen Grundlagen von Krankheiten, ist die gegenwärtige Literatur verwirrend und umstritten. Um bestehende Methoden zu ergänzen, beschreiben wir zwei zusätzliche Methoden, um die molekularen Eigenschaften des TRPV4 zu untersuchen. (1) Rat TRPV4 und ein Aequorin Transgen in Hefezellen transformiert. Ein Hypo-osmtic Schock der Trans Bevölkerung ergibt eine luminometrische Signal aufgrund der Kombination von Aequorin mit Ca ^{2 +} durch die TRPV4 Kanal veröffentlicht. Hier TRPV4 wird von seiner üblichen Säugetierpartnerproteine ​​isoliertund offenbart seine eigene Mechanosensitivität. (2) von TRPV4 cRNA in Xenopus-Oozyten injiziert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die makroskopische TRPV4 Strom mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme sucht. Der aktuelle Anstieg bei der Entfernung von inerten Osmotikums aus der Eizelle Bad ist bezeichnend für Mechanosensitivität. Die Mikroampere (10 ^-6 bis 10 ^-4 A) Ströme von Oozyten sind viel größer als die subnano zu Nanoampere (10 ^-10 bis 10 ^-9 A) Ströme aus kultivierten Zellen, was zu klareren und Quantifizierungen sicherer Abschätzungen. Mikroskopische Ströme reflektieren die Aktivitäten der einzelnen Kanalproteine ​​können auch direkt unter einer Patch-Clamp-registriert werden, auf der Zelle herausgeschnitten oder-Modus. Das gleiche Eizelle bietet mehrere Patch-Proben, die eine bessere Datenreplikation. Ansaugung zu den Patches können TRPV4 aktivieren, um direkt beurteilen Mechanosensitivität. Diese Verfahren sollten auch bei der Untersuchung anderer Arten von TRP-Kanälen sein.

Einleitung

TRP (transient receptor Potenziale) aus sieben Unterfamilien der Kationenkanäle, ^1,2 sensorischen Funktionen dienen. Bei Säugetieren TRPV die Vanilloid Unterfamilie der TRP, sechs Sorten. TRPV4 (Typ 4) ^3,4 reagiert auf Wärme, bestimmte Chemikalien, osmotische Schwellung oder Scherbeanspruchung. Das TRPV4-Gens wurde wiederholt von Kandidaten-Gen und / oder Expression Klonen ^5-8 isoliert. Die letztere Methode folgte die Antwort des Genprodukts zu Hypo-Osmolarität. TRPV4 in fast allen Organen und Funktionen in der Entwicklung, Physiologie und Pathologie von vielen unterschiedlichen Zelltypen ^3,4 ausgedrückt.

Protokoll

1. Hefe Luminometrie Methoden

Verwenden BYYT Stamm von Saccharomyces cerevisiae. Es ist ein yvc1-TOK1-Derivat von BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, TOK1 :: kanMX4). Trans Zellen mit den leu-wählbar Aequorin-exprimierenden Plasmid pEVP1/Aeq und ura wählbare rat-TRPV4-exprimierenden Plasmid p416GPDV4, wie in Batiza et al. Loukin ²⁶ und et al. Beschrieben ²⁴ Verwenden Sie Standard-Methoden von Plasmid-Bau und Umbau ²⁷ . Hefestamm und Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.

1. 2 ml Kultur von Hefe-Zellen über Nacht a....

Ergebnisse

In einem typischen Experiment Luminometrie, wird ein Bereich von 400-1200 mOsM hypotone unten Schocks durch Zugabe von 200 ul von Schock-Lösungen unterschiedlicher niedrigen Osmolarität zu 20 ul Kultur bei 1.400 mOsM erreicht. Die TRPV4 Aktivität ist offensichtlich, wenn die RLU der experimentellen wird, daß von zwei negativen Kontrollen verglichen: Hefezellen mit leeren p416GPDV4 Plasmid oder eine, die die TRPV4 Gen mit einer Mutation an der Ionenfilter (Fig. 1) ²⁴ enthält, transfor.......

Diskussion

Wie in der Einleitung erwähnt, die häufig verwendet, um Funktionen zu studieren TRPV4 Methoden führte manchmal in Widersprüche und Kontroversen. Die zwei Sätze von hier beschriebenen Methoden bieten einige Vorteile und kann die vorhandenen Methoden zu ergänzen. Während wir nur die Studien zu TRPV4 beschreiben, können die Verfahren auch auf andere Ionenkanäle als auch studieren.

1. Hefe Luminometrie Methoden

Angehende Hefe hat eine native Ca ^{2 +-Einstrom} .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dampfdruckosmometer	Wescor	Wescor 5500	Logan, UT, USA
Sirius Einröhren-Luminometer	Titertek-Berhold	Sirius	Huntsville, LA, USA
Mikroplatten-Luminometer	Titertek-Berthold	Mithras LB940	Huntsville, LA, USA
Luminometrie-Software	Titertek-Berthold	MikroWin2000	Huntsville, LA, USA
Patch-Klemme und Software	Axon Instrument	HS2A Kopftisch, VG-2Ax100 virtuelle geerdete Badklemme, GeneClamp 500 Verstärker, Digidata 1440 Digitizer, pClamp10 Software	Union City, CA, USA
Manometer	Bio-Tec		Winooski, VT, USA
Pipettenabzieher	Sutter Instrument Co	Modell P-97	Novata, CA, USA
Mikroinjektor	Drummond Scientific	Nanoinject II	Broomall, PA, USA
Luciferin Coelenterazin	Invitrogen		Carlsbad, CA, USA
T7 RNA-Polymerase Reaktion	Ambion	mMessage mMachine	Austin, TX, USA
Gentamicin	Sigma
Ruthenium rot	Sigma
Mikropipetten	Drummond	100 Mikroliter Mikropipetten	Broomall, PA, USA
High-Fidelity PfuUtra Polymerase	Stratagene		La Jolla, CA, Vereinigte Staaten von Amerika