Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

Zusammenfassung

Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

Zusammenfassung

Bei der Differenzierung der Hokulären Keimzellen ändert sich die Struktur des Kernchromatins dynamisch. Im Folgenden wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die dreidimensionale Chromatinanordnung von Hodenkeimzellen bei Mäusen erhalten werden soll; Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Bei dieser Methode werden Hodentubuli direkt mit einem Permeabilisierungsschritt behandelt, der zytoplasmatisches Material entfernt, gefolgt von einem Fixierungsschritt, der Kernmaterialien fixiert. Tubules werden dann dissoziiert, die Zellsuspension ist zytospun, und Zellen haften an Dias. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und die Kombination dieser Nachweismethoden anwendbar. Als Beispiel für eine mögliche Anwendung der 3D-Diamethode wird gezeigt, dass ein Cot-1-RNA-FISH entstehende RNAs erkennt. Die 3D-Diamethode wird die detaillierte Untersuchung räumlicher Zusammenhänge zwischen Chromatinstruktur, DNA und RNA während der Differenzierung von Hodenkeimzellen erleichtern.

Einleitung

In Hoden unterscheiden sich Keimzellen von diploider Spermatogonie durch Meiose zu reifem, haploiden Spermatozoen. Dabei wird die Kernchromatinstruktur von Keimzellen kontinuierlich und dynamisch umgestaltet. Oberflächenbreiten werden häufig für die zytologische Untersuchung einzelner spermatogener Zellen verwendet. Eine vorherrschende Methode der Oberflächenausbreitung verwendet hypotonische Behandlung, durch die einzelne spermatogene Zellen verteilt und abgeflacht werden¹. Diese Bedingungen sind optimal für die detaillierte Analyse meiotischer Chromosomen. Chromosomale Merkmale wie synaptische Status und Rekombinationsschwerpunkte sind mit dieser Methode leicht zu beobachten. Die hypotonische Behandlung stört jedoch die subnukleare Chromatinarchitektur, so dass diese Technik nicht für die strukturelle Analyse von Kernen geeignet ist. Daher wurde eine verbesserte Methode entwickelt, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet (Abbildung 1). Die 3D-Diamethode hat den Nachweis der entstehenden RNA-Lokalisierung in Kernen ermöglicht, da sie ursprünglich optimiert wurde, um Genexpression und Chromatinzustände während der Differenzierung von Hokulären Keimzellen durch RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)^2,3zu untersuchen. Diese 3D-Methode ist auch auf die Kombination von Immunfluoreszenz, DNA und RNA FISH anwendbar. Zusätzlich hat diese Methode bei der Entdeckung von postmetiotischem Sexchromatin (PMSC) unterstützt, einem stillen Fach der Geschlechtschromosomen, die in postmetiotischen Spermaatiden gefunden werden².

Die 3D-Folienmethode wurde ursprünglich durch die Kombination von zwei wesentlichen Schritten der Gleitvorbereitung optimiert, die häufig für die Kernfärbung verwendet werden: der Befestigungsschritt zur Fixierung von Kernmaterialien und der Permeabilisierungsschritt zur Entfernung von zytoplasmatischen Materialien, um die Zugänglichkeit von Färbereagenzien wie Antikörpern und FISH-Sonden zu verbessern. Wie bereits in einer anderen Publikation³beschrieben, wurde festgestellt, dass der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt vorausgehen muss, um optimale Ergebnisse mit niedrigem zytoplasmatischen Hintergrund zu erzielen. Bei dieser 3D-Diamethode werden der Permeabilisierungsschritt und der nachfolgende Fixierungsschritt direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt und es folgt die mechanische Dissoziation von Keimzellen mit Zangen vor dem Zytospinnen auf Dias. Eine alternative Methode für RNA FISH von spermatogenen Zellen wurde in einem anderen Labor entwickelt⁴. Bei dieser Methode muss der Permeabilisierungsschritt im Einklang mit der 3D-Methode dem Fixierungsschritt vorausgehen, um optimale Ergebnisse von RNA FISH zu erhalten.

Das folgende Protokoll beschreibt die 3D-Diamethode und liefert ein Beispiel für eine mögliche Anwendung, Cot-1 RNA FISH zum Nachweis von kernimimten RNAs. Cot-1 DNA besteht aus sich wiederholenden Elementen im Genom. Hierbei wird eine Cot-1-DNA-Sonde zu einem Intron und UTR der entstehenden Transkripte hybridisiert, wodurch die transkriptionsaktiven Regionen im Kern^5,6erkannt werden. 3D-Dias sind vielseitig und können auf eine Kombination von Immunfluoreszenz-, DNA- und RNA-FISH-Techniken angewendet werden, um eine detaillierte Untersuchung der räumlichen Beziehungen zwischen Chromatinarchitektur zu erhalten.

Protokoll

1.3D Slide-Vorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:
   1. CSK Puffer: 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl₂. PH auf 6,8 mit 1 M NaOH einstellen. Bewahren Sie den CSK-Puffer bei 4 °C auf.
   2. CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100: Fügen Sie 200 l Triton X-100 bis 40 ml CSK-Puffer hinzu. Mischen Sie die Lösung mit Magnetrührer, bis Triton X-100 vollständig aufgelöst ist. Bewahren Sie den CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100 bei 4 °C auf.
   3. 4% Paraformaldehyd (PFA)-PBS, pH 7,4: 4 g PFA in ca. 70-80 ml Wasser auflösen. Um den Auflöseprozess zu beschleunigen, fügen Sie ca. 20 l 4 N NAOH hinzu und halten Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 60 °C, bis sich die PFA vollständig aufgelöst hat und die Lösung transparent ist. Dieser Vorgang dauert ca. 1 Std. Nachdem PFA vollständig aufgelöst hat, 10 ml 10x PBS hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen mit Wasser auf 100 ml ein und kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (25 °C) ab. Verwenden Sie für jedes neue Experiment eine frisch vorbereitete Lösung.
      Hinweis: Erhalten Sie eine institutionelle Genehmigung für alle Tierarbeiten und halten Sie sich an die einschlägigen Tierpflegerichtlinien.
2. Euthanisieren männliche Mäuse. Mit Zangen und Schere, verbrauchen Sie die Hoden von der Maus. Legen Sie die Hoden in PBS (oder RPMI 1640) auf. Führen Sie nach der Entfernung von Hoden schnell die folgenden Schritte 1.3-1.4 aus, um den Abbau der RNA zu verhindern.
3. Rupture die Hoden auf einer kleinen Petrischale und entfernen Sie die Tunika albuginea. Entwirren Sie die seminiferous tubulies in PBS auf Eis mit Zangen.
4. Mit Zangen mehrere Tubuli (mehrere Tubules ca. 5-10 mm lang) in einen Brunnen einer 4-Well-Schale mit 500 ml CSK-Puffer + 0,5% Triton X-100 auf Eis übertragen und 6 min brüten. Eine Überexposition gegenüber dem CSK-Puffer kann zu einer Unterbrechung der Zellen führen.
5. Mit Zangen, übertragen Sie alle Tubuli auf einen Brunnen einer 4-Well-Schale mit 4% PFA-PBS-Lösung. Dieser Schritt kann ohne Stereomikroskop vorgeformt, aber optional verwendet werden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Gleichzeitig beginnen Sie mit der Vorbereitung von 12 Zytospinkammern während der Inkubationszeiten.
6. Mit Zangen, übertragen Sie alle Tubuli auf einen Brunnen einer 4-Well-Schale, die PBS enthält. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Auf der Rückseite einer Glasrutsche alle Tubuli in 30 l PBS übertragen (die Oberseite der Rutsche sollte aufgrund kationischer Ladung vermieden werden). Mit den Spitzen von zwei Zangen, reißen Sie die Tubuli in Stücke. Schneiden Sie die Tubuli in horizontaler Richtung, indem Sie Tubules zwischen den Spitzen zweier Zangen schneiden und die Zangen horizontal ziehen. Fahren Sie mit diesem Schritt für ca. 10-20 Sek. fort.
8. Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren mit einer P20 Pipette.
9. Die Suspension in ein Mikrozentrifugenrohr geben, mit PBS auf ca. 1,3 ml verdünnen. Tragen Sie 100 l Suspension auf jede der 12 Zytospinkammern auf (insgesamt 1,2 ml). In diesem Schritt muss die Konzentration der Zellen nicht bestimmt werden.
10. Cytospin die Proben bei 2.000 U/min für 10 min bei Raumtemperatur. Nach dem Zytospinnen, trockene Dias auf Laborbank für ein paar Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem die Rutschen für einige Minuten vollständig trocknen durften, gehen Sie zum nächsten Schritt.
11. Waschen Sie die Dias mit einem Coplin-Glas, das PBS enthält, 5 min bei Raumtemperatur.
12. Dias in ein Coplin-Glas mit 70% Ethanol übertragen und mindestens 2 min vor Beginn der RNA FISH warten. Die Rutschen sind für einige Wochen in 70% Ethanol bei 4 °C stabil. Zur Langzeitlagerung dehydrieren Sie Dias mit serieller Behandlung mit 80% und 100% Ethanol in Coplin-Gläsern für je 2 min und lufttrocken die Dias vollständig dehydrieren. Bei -80 °C in einer Schiebebox aufbewahren.

2. Cot-1 DNA Probe Vorbereitung durch Zufällige Primierung

1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:
   1. Hybridisierungspuffer: Mischen Sie die verfahrenen Komponenten, um 900 ml Hybridisierungspuffer zu erstellen; diese Lösung wird verwendet, um Sonden zu lagern. Dieser Hybridisierungspufferbestand ermöglicht die Zugabe von 10% Volumen der RNase-Inhibitorlösung (Ribonucleosid Vanadyl Complex) vor der Hybridisierung.

      Komponente	Menge (l)	Endgültige Konzentration
      Formamid	500	50% (v/v)
      50% Dextran	200	10% (mit/v)
      20x SSC	100	2x
      1% BSA	100	0.1%

      Vor der Hybridisierung 1/10 Vol von 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex oder Wasser in den Hybridisierungspufferstock geben, um der endgültigen Konzentration zu entsprechen. Bei -20 °C ist diese Mischung seit mehr als einem Jahr stabil.
   2. 20x SSC: 88,2 g Natriumcitrat und 175,3 g NaCl in ca. 800 ml Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit ein paar Tropfen von 1 M HCl ein. Fügen Sie Wasser hinzu, um die endige Lautstärke auf 1 L einzustellen. Sterilisieren durch Autoklavieren. Nach der Zubereitung kann 20x SSC bei Raumtemperatur gelagert werden.
   3. 50% (w/v) Dextran: Wasser rühren und langsam 50 g Dextransulfat hinzufügen. Halten Sie das Rühren über Nacht bei Raumtemperatur. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 100 ml einzustellen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
2. Fügen Sie die unten aufgeführten Bestandteile zu einer PCR-Röhre hinzu. Mit einer PCR-Maschine die Lösung 5 min bei 95 °C mischen und inkubieren.

   Komponente	Menge pro Reaktion (l)	Finale
   Kinderbett-1 DNA: 1 mg/ml	1	1 g
   Random 9mer Primer (aus Kit)	10
   Wasser	27

3. Zentrifugieren Sie kurz und legen Sie auf Eis.
4. Fügen Sie die folgenden Komponenten hinzu. Mit einer PCR-Maschine 30 min bei 37 °C mischen und inkubieren. (Einzelheiten zum verwendeten Kit finden Sie in der Tabelle der Reagenzien und Ausrüstungen).

   Komponente	Menge pro Reaktion (l)	Endgültige Konzentration
   Mischung aus Schritt 2.2	38
   5x Nukleotidpuffer (vom Kit)	9.2
   Cy3-dUTP (1 mM)	0.8	16 M
   Klenow (ab Kit)	2

5. Fügen Sie 2 l Stop-Puffer (vom Kit) hinzu, um die Reaktion abzubrechen.
6. Reinigen Sie die gestoppte Reaktion mit Mikrospinsäulen.
7. Fügen Sie der gereinigten Fraktion 50 g Hering-Sperma-DNA (50-fache Überschuss an Schablonen-Cot-1-DNA) hinzu.
8. Messen Sie das Gesamtvolumen mit einer Pipette. 0,7x Volumen von 100% Ethanol und 0,1x Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,2), gut mischen und Zentrifuge für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit (17.000 x g) mit einer Mikrozentrifuge bei 4 °C mischen.
9. Entfernen Sie die Flüssigkeit, und fügen Sie 200 l 70% Ethanol, gut mischen und Zentrifuge für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.
10. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit. Trocknen Sie den Niederschlag für 10-30 min bei Raumtemperatur.
11. Lösen Sie das Pellet in 20 l Hybridisierungspuffer. Da das Pellet oft schwer aufzulösen ist, Pipette wiederholt. Alternativ kann ein Wirbelmischer auch verwendet werden, um das Pellet effizient aufzulösen. Sonden können bis zum Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt werden.

3. Kinderbett-1 RNA FISH

1. Fügen Sie die unten aufgeführten Komponenten zu einer PCR-Röhre hinzu. Mit einer PCR-Maschine 10 min bei 80 °C inkubieren, gefolgt von einem Vorglühen von ca. 10-30 min bei 42 °C. Bei 42 °C bis zur Hybridisierung aufbewahren. Ribonucleoside Vanadyl Complex ist optional; es kann durch Wasser ersetzt werden.

   Komponente	Menge pro Reaktion (l)	Finale
   Cot-1 DNA-Sonde (50 ng/l)	2	100 ng
   Ribonukleosid Vanadyl Komplex (200 mM)	2	20 mM
   Hybridisierungspuffer	hinzugefügt zu 20

2. Dehydrieren gleitet in einem Coplin-Glas mit 80% Ethanol für 2 min, gefolgt von einem Coplin-Glas mit 100% Ethanol für 2 min. Trockenrutschen komplett auf der Laborbank bei Raumtemperatur.
3. Eine Spitzenboxkammer (gefüllt mit 2-3 cm Wasser) in einem 42 °C Inkubator im Voraus vorheizen. Legen Sie die Rutsche auf die Spitzenboxkammer. Kurz zentrifugieren Sie die vorannealed Sonden und Pipette direkt auf die dehydrierten Dias. Vermeiden Sie Blasen zu machen. Bedecken Sie die Rutsche vorsichtig mit einem Deckelschlupf.
4. Hybridisieren Sie für 6 Stunden bis über Nacht (14-15 Std.) bei 42 °C.
5. Bereiten Sie Waschlösungen in Coplin-Gläsern vor (zwei Gläser mit 2x SSC und 50% Formamid und zwei Gläser mit 2x SSC). Bei 42 °C 30 min im Wasserbad vorheizen.
6. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Deckelschlupf vom Rand des Schlittens zu entfernen. Vermeiden Sie Kratzproben. Schlitten in einem Coplin-Glas mit 2x SSC und 50% Formamid für 5 min bei 45 °C waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
7. Schlitten in einem Coplin-Glas mit 2x SSC für 5 min bei 45 °C waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
8. Fügen Sie den Dias 20 l DAPI-Montagemedien hinzu und decken Sie sie mit einem Deckbedeckungsbeleg ab. Drücken Sie das Abdeckungsglas vorsichtig, um zusätzliche Montagemedien zu entfernen. Blot zusätzliche Montagemedien mit Reinigungsgewebe. Die Dias sind für die Mikroskopie-Evaluierung bereit.

Ergebnisse

Abbildung 2zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer 3D-Folie . In diesem Experiment wurde Cot-1 RNA FISH durchgeführt, um eine aufkommende Transkription zusammen mit Derimmunostainierung mit Anti-CBX1- und H2AX-Antikörpern zu erkennen. Um RNA FISH und Immunostaining zu kombinieren, wurde zunächst eine Immunfärbung durchgeführt, gefolgt von RNA FISH, wie in³beschrieben. CBX1 ist ein Heterochromatin-Protein, das pericentromer Heterochromatin und stille Geschlechtschromosomen in der Meiose, einem...

Diskussion

Bei der 3D-Folienvorbereitung geht der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt voraus. Diese Schritte werden direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt, wodurch die dreidimensionale Chromatinstruktur erhalten bleibt. Eine alternative Möglichkeit zur Erhaltung der Chromatinstruktur für RNA/DNA FISH besteht darin, den Permeabilisationsschritt und den Fixierungsschritt gleichzeitig durchzuführen. Diese alternative Technik wurde in Beuteltierkeimzellen und in Mauspräimplantationsembryonen^7,8durchgeführt. We...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluorfluoreszenz-Markierungskit	Agilent	300380
Heringssperma DNA-Lösung	Invitrogen	15634-017
Ethanol. 200 proof (absolut)	Pharmco-aaper	111000200
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889
Formamid deionisiert	American Bioanalytical	AB00600-00500
Natriumcitrat tribasisches Dihydrat	Sigma-Aldrich	C8532
Rinderserumalbumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextransulfat-Natriumsalz aus Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	76240
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	221465
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Säulen	GE Healthcare	27-5330-01
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5424
Pinzette	VWR	300-050
Mikrozentrifugenröhrchen	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Objektträger	Fisher	12-550-15
4-Well-Schale	Fisher	12-566-301
Deckglas	Fisher	12-544-G
Druckluft-Inkubator	Revolutionäre Wissenschaft	RS-IF-203