Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

Zusammenfassung

Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

Zusammenfassung

Bei der Differenzierung der Hokulären Keimzellen ändert sich die Struktur des Kernchromatins dynamisch. Im Folgenden wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die dreidimensionale Chromatinanordnung von Hodenkeimzellen bei Mäusen erhalten werden soll; Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Bei dieser Methode werden Hodentubuli direkt mit einem Permeabilisierungsschritt behandelt, der zytoplasmatisches Material entfernt, gefolgt von einem Fixierungsschritt, der Kernmaterialien fixiert. Tubules werden dann dissoziiert, die Zellsuspension ist zytospun, und Zellen haften an Dias. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und die Kombination dieser Nachweismethoden anwendbar. Als Beispiel für eine mögliche Anwendung der 3D-Diamethode wird gezeigt, dass ein Cot-1-RNA-FISH entstehende RNAs erkennt. Die 3D-Diamethode wird die detaillierte Untersuchung räumlicher Zusammenhänge zwischen Chromatinstruktur, DNA und RNA während der Differenzierung von Hodenkeimzellen erleichtern.

Einleitung

In Hoden unterscheiden sich Keimzellen von diploider Spermatogonie durch Meiose zu reifem, haploiden Spermatozoen. Dabei wird die Kernchromatinstruktur von Keimzellen kontinuierlich und dynamisch umgestaltet. Oberflächenbreiten werden häufig für die zytologische Untersuchung einzelner spermatogener Zellen verwendet. Eine vorherrschende Methode der Oberflächenausbreitung verwendet hypotonische Behandlung, durch die einzelne spermatogene Zellen verteilt und abgeflacht werden¹. Diese Bedingungen sind optimal für die detaillierte Analyse meiotischer Chromosomen. Chromosomale Merkmale wie synaptische Status und Rekombinationsschwerpunkte sind mit dieser Methode ....

Protokoll

1.3D Slide-Vorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:
   1. CSK Puffer: 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl₂. PH auf 6,8 mit 1 M NaOH einstellen. Bewahren Sie den CSK-Puffer bei 4 °C auf.
   2. CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100: Fügen Sie 200 l Triton X-100 bis 40 ml CSK-Puffer hinzu. Mischen Sie die Lösung mit Magnetrührer, bis Triton X-100 vollständig aufgelöst ist. Bewahren Sie den CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100 bei 4 °C auf.
   3. 4% Paraformaldehyd (PFA)-PBS, pH 7,4: 4 g PFA in ca. 70-80 ml Wasser auflösen. Um den Auflöseprozess zu beschleunigen, fügen Sie ca. 20 l 4 N NAOH hinzu und halten Sie die....

Ergebnisse

Abbildung 2zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer 3D-Folie . In diesem Experiment wurde Cot-1 RNA FISH durchgeführt, um eine aufkommende Transkription zusammen mit Derimmunostainierung mit Anti-CBX1- und H2AX-Antikörpern zu erkennen. Um RNA FISH und Immunostaining zu kombinieren, wurde zunächst eine Immunfärbung durchgeführt, gefolgt von RNA FISH, wie in³beschrieben. CBX1 ist ein Heterochromatin-Protein, das pericentromer Heterochromatin und stille Geschlechtschromosomen in der Meiose, einem.......

Diskussion

Bei der 3D-Folienvorbereitung geht der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt voraus. Diese Schritte werden direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt, wodurch die dreidimensionale Chromatinstruktur erhalten bleibt. Eine alternative Möglichkeit zur Erhaltung der Chromatinstruktur für RNA/DNA FISH besteht darin, den Permeabilisationsschritt und den Fixierungsschritt gleichzeitig durchzuführen. Diese alternative Technik wurde in Beuteltierkeimzellen und in Mauspräimplantationsembryonen^7,8durchgeführt. We.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluorfluoreszenz-Markierungskit	Agilent	300380
Heringssperma DNA-Lösung	Invitrogen	15634-017
Ethanol. 200 proof (absolut)	Pharmco-aaper	111000200
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889
Formamid deionisiert	American Bioanalytical	AB00600-00500
Natriumcitrat tribasisches Dihydrat	Sigma-Aldrich	C8532
Rinderserumalbumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextransulfat-Natriumsalz aus Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	76240
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	221465
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Säulen	GE Healthcare	27-5330-01
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5424
Pinzette	VWR	300-050
Mikrozentrifugenröhrchen	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Objektträger	Fisher	12-550-15
4-Well-Schale	Fisher	12-566-301
Deckglas	Fisher	12-544-G
Druckluft-Inkubator	Revolutionäre Wissenschaft	RS-IF-203