Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Zusammenfassung

Hier werden wir ausführlich eine Methode, um Kultur Zahnkeime im Unterkiefer Scheiben mit einem Gewebe-Chopper. Diese Methode ermöglicht einen einzigartigen Zugang zu den Zahn während der Entwicklung und bietet eine ausgezeichnete Gelegenheit für die Manipulation und Abstammung Verfolgung, nicht verfügbar mit traditionellen Kulturverfahren.

Zusammenfassung

Explantatkultur ermöglicht die Manipulation der Entwicklung von Organen zu bestimmten Zeitpunkten und ist damit eine wichtige Methode für die Entwicklungsbiologe. Für viele Organe ist es schwierig, die Entwicklung Gewebe zugreifen Überwachung während der Ex-vivo-Kultur zu ermöglichen. Die Scheibe Kulturverfahren ermöglicht den Zugang zu Gewebe, so daß morphogenetische Bewegungen folgen und spezifischen Zellpopulationen zur Manipulation oder Linienverfolgung richtet sein.

In diesem Beitrag beschreiben wir eine Methode der Schnittkultur, die sehr erfolgreich für Kultur der Zahnkeime in einer Reihe von Arten war. Das Verfahren stellt eine hervorragende Anbindung an die Zahnkeime, die mit einer ähnlichen Rate wie in vivo zu beobachten, durch die andere Backe Gewebe umgeben zu entwickeln. Dies ermöglicht Gewebe Wechselwirkungen zwischen dem Zahn und dem umgebenden Gewebe zu überwachen. Obwohl dieses Papier konzentriert sich auf die Zahnkeime, kann das gleiche Protokoll verwendet werden, um die Entwicklung einer Reihe folgenvon anderen Organen, wie Speicheldrüsen, Meckel-Knorpel, Nasendrüsen, Zunge und Ohr.

Einleitung

Für eine Anzahl von Versuchen ist es wichtig, in der Lage, Gewebekultur ex vivo, um die Entwicklung zu verfolgen. Kultur entwickeln Gewebe Zugang zu bestimmten Perioden der Entwicklung und ermöglicht die Manipulation von Genen, die durch die Zugabe von Faktoren, zu dem Kulturmedium, oder beladenen Kügelchen und durch die Verwendung von ^{1-Transfektion} und Elektroporation. Für viele Experimente ist es wichtig, in der Lage, um das Gewebe zu visualisieren, wie es wächst, zum Beispiel, um das Schicksal der Linie markierten Zellen folgen, wie das Gewebe erfährt Morphogenese sein. Dies kann besonders problematisch für Gewebe, die tief innerhalb des Embryos entwickeln, die nicht offensichtlich sind, wenn ein Block von Gewebe aus dem Embryo kultiviert werden. Die Zähne sind gute Beispiele dafür, wie sie in den Unterkiefer, Oberkiefer-und Stirnnasen Prozess zu entwickeln. Wenn die ganze Unterkiefer ist kultiviert die oberflächlichen Strukturen des Zahnes können angezeigt, aber Veränderungen in der Morphologie kann nur analysiert werden, nachdem Schneiden von fixiertem Gewebe 2. Wir haben eine Live-Scheibe Kulturtechnik ermöglicht es uns, Zahnkeim Entwicklung zu folgen und den Zugang zu den verschiedenen Teilen des Zahnes während der Entwicklung angepasst. Die Technik Kulturen die Zahnkeimscheiben an der Gas-flüssig-Grenzfläche, mit einem modifizierten Verfahren Trowell ^3. Diese Scheibe Kulturen wurden direkt nach der Morphogenese des Zahns und damit Linie Verfolgung unterschiedliche Komponenten, wie beispielsweise die Schmelz Knoten und Zahnpapille und Follikel ^1,4-7 sehr nützlich. Die Technik ist nicht auf Maus-Embryonen beschränkt und hat erfolgreich die Kultur Live-Scheiben von Schwein und Schlange Zahngewebe ^8,9 verwendet. Zusätzlich zu dem Vorteil, dass die Zahnentwicklung sichtbar, weist die Scheibe Verfahren auch den Vorteil, dass die dünnen Scheiben von Gewebe haben Zugang zu Nährstoffen aus dem Medium und Luft aus dem Inkubator erhöht. Dies führt zu einem verbesserten Wachstum der Zahnkeime, die Entwicklung in vivo übereinstimmen, und zeigen INVASIonen von Endothelzellen in die Papille ^7. Im Gegensatz Zahnkeime ganz Kiefer Kulturen entwickeln langsamer als die in vivo und die Mitte der Kultur häufig nekrotische in Langzeitkulturen. In Schnittkultur entwickelt der Zahn innerhalb einer Scheibe des Kiefers, und seine Wechselwirkung mit dem umgebenden Knochen zu entwickeln und in anderen Geweben beobachtet werden. In unserem Verfahren wird das Gewebe unmittelbar nach Präparation ohne die Notwendigkeit, in einem Trägermedium ^10,11 einzubetten und keine Notwendigkeit für jedes System, das Gewebe an den Hackblock befestigen zerhackt. Das Verfahren ist daher nicht-invasive und schnell, so dass viele Unterkiefer in einer Sitzung geschnitten werden.

Protokoll

1. Aufbauen

1. Schärfen Sie die Dissektionsinstrumente (mit einem Schleifstein mit Mineralöl geschmiert) und zu sterilisieren, bevor für Organkultur verwenden mit einem 70% igem Ethanol Spray-und Trockenhitzesterilisation. Schärfen Sie die Dissektion Nadeln mittels Elektrolyse in 2 M Natriumhydroxid mit einem 12-V-Versorgung.
2. Vorbereitung der für die Präparation und Kultur von embryonalen Organen verwendete Kulturmedium, bestehend aus Erweiterte Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) mit Glutamax 1% und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt.

2. Embryo Dissection

1. Cull eine zeitgesteuerte gepaart schwangere Frau, die einen Zeitplan ein Verfahren durch das Innenministerium oder anderen leitenden Gremium genehmigt. Präparieren Sie sich die Haut um die Unterbauch, und schnitt den Bauch mit einer Schere. Suchen Sie die beiden Uterushörner, die zusammen an der unteren Mittellinie zu verbinden.
2. Präparieren Sie sich die Gebärmutter und in ein Rohr mit Medium auf Eis gefüllt. When auf Eis, kann das Gewebe für mehrere Stunden stehen gelassen werden.
3. Entfernen der Gebärmutter und in einer Petrischale in Medium unter dem Mikroskop. Wo möglich Embryo Dissektionen sollten in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt, um eine Kontamination zu minimieren.
4. Präparieren Sie sich die Embryonen aus der Gebärmutter und befreien sie von ihrer extra Gewebe.
5. Enthaupten die Embryonen mit einem Wolfram-Nadel und übertragen Sie die Köpfe in ein frisches Gericht Medium.
6. Isolieren Sie die Unterkiefer von den Köpfen, indem eine Nadel in die Mundhöhle durchtrennt und in Richtung der Rückseite des Kopfes (1A und 1B). Isolierte Unterkiefer können vorübergehend in Medium auf Eis während der Wartezeit für das Hacken gespeichert werden.
7. Für ganze Unterkiefer Scheiben inszeniert E11.5-E15.5 sind ideal für Zahnkeim Kultur. Nach E15.5 die Entwicklungs Knochen im Unterkiefer ist zu hart für das Hacken. Zahnscheiben können immer noch gemacht werden, aber die Knochen (Dentale und Bildung Alveolarknochen) zuerst entfernt werden, indemDissektion vor ⁹ hacken. Entfernen Sie vorsichtig mit Knochen Wolfram Nadeln und Pinzette.

3. Embryo Slicing

1. Bereiten Sie die Unterkiefer von Gewebeschnitten mit einem Standard-Tabelle Gewebe Chopper (Abbildung 1C). Verwenden Sie eine frische Klinge nach etwa 200 Unterkiefer, und stellen Sie sicher, dass es bündig mit der Befestigungsscheibe, wenn er fällt.
2. Reinigen Sie die Befestigungsscheibe und die Klinge mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch. Vorsicht ist bei der Verwendung der Maschine genommen werden, da die Klinge ist sehr scharf.
3. Gesetzt den Chopper bei einer Schnittdistanz von 200-400 &mgr; m nach dem Alter der Probe, und je nachdem, ob die gesamte Zahnkeim erforderlich. Stellen Sie die Klinge Kraft auf Maximum.
4. Die Übertragung eines Unterkiefers mit dem Kunststoffbefestigungsscheibe mit einer Pipette oder Pinzette. Ordnen Sie den Unterkiefer auf der Disc machen, dass die Orientierung ist immer noch klar. Die Entwicklungs Zunge kann als nützliche Orientierungspunkt für die Bestimmung Orientierung verwendet werden. Für Backenzähne Verwendung afRontal / Querorientierung (siehe Ebene der Hacken in Abbildung 1B), während für Schneidezähne verwenden einen sagittalen Schnitt durch den Unterkiefer, die unterschiedliche Ausrichtung dieser Zähne zu reflektieren, wie sie wachsen (siehe Ebene der Hacken in Abbildung 2A).
5. Entfernen Sie das überschüssige Medium aus der ganzen Verwendung von Filterpapier, um den Unterkiefer auf der Montagescheibe leicht trocknen das Gewebe.
6. Unmittelbar nach dem Trocknen, legen Sie die Disc auf der kreisförmigen Edelstahl-Tabelle der Chopper. Schalten Sie das Gerät ein und drücken Sie Start. Die Tabelle läuft automatisch von links nach rechts, während gleichzeitig die Schneide tragenden Arm der Klinge angehoben und fallen bis zu 200 Hübe / min.
7. Schalten Sie das Gerät, wenn das Gewebe vollständig geschnitten worden. Achten Sie darauf, die Klinge Arm in der erhöhten Position und entfernen Sie die CD. Stellen Sie keine Finger unter der Klinge Arm oder verlassen die Maschine unbeaufsichtigt hacken.
8. Nehmen Sie die Montagescheibe und sofort Medium to die Scheiben auf der Disc, um eine übermäßige Austrocknen zu verhindern. Sorgfältig verdrängen die geschnittenen Gewebes von der Unterseite der Scheibe unter Verwendung eines Wolfram-Nadel und dann Pipette in eine kleine Petrischale Medium (2A).
9. Trennen Sie die Scheiben mit einer Nadel und Gewebeschnitten, die das Gewebe von Interesse unter einem Stereomikroskop (1D, 1E, und 2B) und wählen Sie dann. Zeigen ausgewählten Scheiben in frische Kulturschalen mit Medium.

4. Slice-Kultur-

1. Vorbereitung zentralen Vertiefungen Organkulturschalen bereit Kultur durch Zugabe von etwa 2 ml autoklaviertem Wasser zu der äußeren Wanne, um Austrocknung zu vermeiden, und durch Positionieren eines Metallgitters in der Mitte der Schale (3A und 3B).
2. Bereiten Metallgitter von Schneidleisten ca. 4 cm x 1,5 cm aus Platten aus Edelstahlgewebe. Verwenden Sie einen Locher, um ein Loch in der Mitte machen und beugendie Seiten, um eine gestaffelte Ende zu schaffen. Das Gitter sollte auch über den zentralen Flach passen, parallel zum Boden der Schale (3A und 3B) liegen. Autoklavieren die Gitter vor dem Einsatz zu sterilisieren.
3. Schneiden Sie ein Stück transparenten Polyethylenterephthalat (PET)-Membran (Porengröße 0,4 um) groß genug, um das Loch im Gitter abzudecken. Setzen Sie den Schnitt Membran in die Schale mit dem ausgewählten Scheibe.
4. Legen Sie die Scheibe auf der Membran und dann heben Sie die Membran aus dem Medium, mit Scheibe in der Mitte abgeflacht.
5. Platzieren des Filters auf dem Gitter über dem kreisförmigen Loch in der Mitte, und fügen etwa 1 ml Kulturmedium zu dem Brunnen bis zur Ebene der Membran.
6. Manipulationen hinzuzufügen Proteine ​​oder niedermolekulare Inhibitoren zu dem Medium (zum Beispiel ^8).
7. Fotografieren Sie das Stück für einen Datensatz der Morphologie am Tag 0 der Kultur.
8. Die Schalen werden in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO _{2 bei 37 ° C in einem Inkubator.}
9. Fotografieren Sie die Kulturen in regelmäßigen Abständen auf durchschnittlich 7 Tage. Ändern Sie das Kulturmedium alle 48-72 Std. Für die Fotografie sehen Sie die Scheiben mit einer Lichtquelle von unten (2C-E).

5. Lineage Tracing

Wenn Linie Verfolgung erforderlich ist, können lipophile Farbstoffe wie Dil oder DiO in die Zahnkeim vor Schritt 4, Scheibe Kultur eingespritzt werden.

1. Ziehen Glaskapillare Nadeln mit einer Nadel Magnet.
2. Brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette und legen Spitze nach unten in die Farbstofflösung. Lassen Sie für ein paar Minuten, während der Farbstoff füllt die Spitze durch Kapillarwirkung.
3. Legen Sie die gefüllte Nadel in eine Halterung und befestigen Sie über Schläuche mit einem Injektor oder Mund Sauger.
4. Positionieren Sie die Spitze der Nadel in dem Kulturmedium berühren den Bereich der Scheibe durch gekennzeichnet werden. Druckluft beaufschlagen, um eine kleine Menge des Farbstoffs aus der Nadel ein verdrängenauf das Gewebe d.
5. Entfernen Sie die Nadel und überprüfen Sie für die Kennzeichnung unter Fluoreszenz.
6. Erfolgreich markierten Scheiben können auf Filter übertragen und kultiviert werden, wie in Schritt 4 beschrieben.

Ergebnisse

Um die Bewegung des ersten Backenzahnsäckchen zu verfolgen, wurden 250 &mgr; m Frontalschnitten durch einen Unterkiefer unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Zahnfollikel ist die Schicht des Bindegewebes, die die äußere Schmelzepithels (OEE) der Entwicklungs Zahn umgibt, und war zuvor gezeigt worden, um an der Bildung von Gewebe des Zahn ⁶ zu nehmen. Mandibles wurden bei E14.5, die Kappe Stadium der Zahnentwicklung seziert. In der Scheibe war der Umriss des Zahn Epithel klar,...

Diskussion

Diese Methode der Zahn Kultur hat den Vorteil, dass an der Zahnkeime zuzugreifen ist ausgezeichnet, was eine genaue Linienverfolgung und die Platzierung der Perlen im Epithel oder Mesenchym. Definierte Bereiche der Entwicklungszahnkeim kann deshalb gezielt angegangen werden. Während der Kultur der Veränderung der Morphologie der Zahnkeim verfolgt werden kann, und die Wirkung von Manipulationen schnell beurteilt.

Das Verfahren ist jedoch nur für kleine Zahnkeime, bevor eine wesentliche Bildun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ethanol	VWR	101077Y	100% Ethanol wurde in destilliertem H2O auf 70% verdünnt.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molekulare Sonden)	Vybrant	V-22885	Zellmarkierungslösung
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( Molekulare Sonden)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas Nr. 3885A20	Sterilisation bei trockener Hitze
McIlwain Gewebezerkleinerer	Ted Pella, Inc.	10180	Standardtisch
Organkulturschale (Center-Well-Organkulturschale)	Falcon	353037
Membranen (Zellkultureinsätze, 0,4 μ m Porengröße)	BD Falcon	353090	PET-Schienenätzmembran, 6-Well-Format
Metallgitter (Edelstahl - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Inkubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Einkanal-Picospritzer III
Glaskapillare mit Filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Wolframdraht 0,1 mm	Goodfellow	W005138
Wolframdraht 0,38 mm	Goodfellow	W005155
Aspiratorröhrchen	Sigma	A5177	Wird für Mundaspirations-Lineage-Tracer verwendet