Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Implantation von gläsernen Rückenmarksfenstern bei erwachsenen Mäusen mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

7.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/50826

⸱

21. Dezember 2013

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, 2Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Implantation und Aufrechterhaltung von Glasfenstern über dem freiliegenden Rückenmark erwachsener Mäuse zur Untersuchung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis. Diese Fenster bieten einen chronischen optischen Zugang zum Rückenmark zur Überwachung der Zelldynamik auf subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) bei erwachsenen Nagetieren ist das experimentelle Standardmodell zur Untersuchung autonomer demyelinisierender Krankheiten wie Multiple Sklerose. Hier stellen wir ein kostengünstiges und reproduzierbares Glasfenster-Implantationsprotokoll vor, das für die Intravitalmikroskopie und die Untersuchung der Dynamik der Zytoarchitektur des Rückenmarks mit subzellulärer Auflösung bei lebenden adulten Mäusen mit EAE geeignet ist. Kurz gesagt, legen wir die Wirbel T12-L2 operativ frei und konstruieren eine Kammer um die freiliegenden Wirbel mit einer Kombination aus Cyanacrylat und Zahnzement. Eine Laminektomie wird von T13 bis L1 durchgeführt, und eine dünne Schicht aus transparentem Silikonelastomer wird auf die dorsale Oberfläche des freiliegenden Rückenmarks aufgetragen. Über das freiliegende Rückenmark wird ein modifizierter Glasdeckglas implantiert, wobei darauf geachtet wird, dass das Glas nicht direkt mit dem Rückenmark in Berührung kommt. Um die Infiltration von Entzündungszellen zwischen dem Fenster und dem Rückenmark zu reduzieren, wird in den ersten 10 Tagen nach der Implantation alle 2 Tage eine entzündungshemmende Behandlung (wie von der Ethikkommission empfohlen) verabreicht. Die EAE wird nur 2-3 Wochen nach Beendigung der entzündungshemmenden Behandlung induziert.

Mit diesem Ansatz haben wir erfolgreich EAE bei 87% der Tiere mit implantierten Fenstern induziert und mit Hilfe von Thy1-CFP-23-Mäusen (blaue Axone im dorsalen Rückenmark) den axonalen Verlust während der gesamten EAE-Progression quantifiziert. Zusammengenommen kann dieses Protokoll nützlich sein, um die Rekrutierung verschiedener Zellpopulationen sowie deren Interaktionsdynamik mit subzellulärer Auflösung und über längere Zeiträume zu untersuchen. Diese intravitale Bildgebungsmodalität stellt ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Behandlung von autoimmunen demyelinisierenden Erkrankungen wie EAE dar.

Einleitung

Multiple Sklerose ist eine ZNS-Autoimmunerkrankung, die fortschreitende Myelin- und Axonschäden verursacht. Das Standardforschungsmodell für demyelinisierende Autoimmunerkrankungen des ZNS ist EAE bei erwachsenen Nagetieren. Die dynamischen zellulären Ereignisse, die der EAE-Progression zugrunde liegen, sind jedoch noch weitgehend unerforscht. Ein Ansatz besteht darin, mit Hilfe der intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie zelluläre Populationen mit fluoreszierenden Markern im Rückenmark von adulten Mäusen mit EAE über längere Zeiträume sichtbar zu machen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um die zelluläre Physiologie, zelluläre Interaktionen und das dynamische Fortschreiten von Krankheiten bei lebenden Tieren mit subzellulärer Auflösung1 zu untersuchen. Eine große Hürde für den Ansatz besteht jedoch darin, dass er einen optischen Zugang zur interessierenden Region erfordert. So sind beispielsweise Schädelglasfenster eine etablierte Methode, um über mehrere Wochen hinweg immer wieder dieselben Mikrostrukturen im Gehirn abzubilden2,3. Die Adaption dieser Methodik an die Bildgebung des Rückenmarks ist jedoch nicht einfach und erfordert mehrere technische Modifikationen, um das dorsale Rückenmarksgewebe innerhalb der Gelenkwirbel zu immobilisieren.

Früher erforderte der optische Zugang zum Rückenmark eine chirurgische Neufreilegung des Rückenmarks zu Beginn jeder Bildgebungssitzung und das Vernähen der geschlossenen Haut am Ende jeder Sitzung4-12. Diese wiederholten Operationen sind für das Tier traumatisch, begrenzen die Anzahl und Dauer der bildgebenden Verfahren und erhöhen die Wahrscheinlichkeit von chirurgischen Artefakten wie Entzündungen und Schädigungen des Rückenmarks durch mechanische Störungen. Um diese Mängel zu überwinden, haben wir kürzlich ein Protokoll entwickelt, um Glasfenster über dem freiliegenden Rückenmark von adulten fluoreszierenden transgenen Mäusen mit traumatischen Rückenmarksverletzungen für Langzeit-In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie-Experimente ohne wiederholte Operationen zu implantieren13. Im Folgenden stellen wir eine detaillierte Anpassung des Implantationsprotokolls im Kontext seiner Anwendung vor, um die dynamischen zellulären Ereignisse zu untersuchen, die dem Fortschreiten der EAE bei adulten Mäusen zugrunde liegen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Fenster- und Stützstruktur

  1. Vorbereitung des Fensters - Bereiten Sie mehrere Fenster in verschiedenen Größen (Breite = 1,8-2,2 mm; Länge = 4,5-5,2 mm) für die Implantation vor.
    1. Herstellung des modifizierten Bohrfräsers zum Schneiden des Deckglases - mit einer großzügigen Menge Zahnzement einen Bohrfräser an einer Welle befestigen (in unserem Fall alte Bulldog-Klemmen). Achten Sie darauf, dass der Grat ~45° relativ zur Welle beträgt, um die Handhabung zu erleichtern.
      Hinweis: Diamantritzer eignen sich auch gut zum Schneiden von Deckglas.
    2. Dia-A erstellen - kleben Sie mit einem Standard-Objektträger ein kurzes Stück Linealpapier (~2 cm) an den unteren Rand des Objektträgers, so dass Sie das Lineal durch das Glas sehen können. Legen Sie als Nächstes ein Stück Klebeband entlang des Randes der 0-mm-Markierung des Lineals, das im nächsten Schritt als Halterung für das Deckglas dient.
    3. Positionieren Sie mit dem modifizierten Bohrgrat, Objektträger-A, und einem unmodifizierten Objektträger (Objektträger-B) ein Stück Deckglas (Nr. 1,5 Dicke) auf die 0-mm-Markierung auf Objektträger-A. Verwenden Sie Schieber-B, um das Deckglas an Ort und Stelle zu halten und als Vorrichtung für die vorgesehene Schnittlinie. Schneiden Sie das Deckglas in ein langes Rechteck von ca. 5 x 22 mm. Drehen Sie das geschnittene Glas um 90° und schneiden Sie das Rechteck in ein kleineres Rechteck von ~2 x 5 mm.
  2. Modifikationen der Klammern - Es werden zwei modifizierte Klammern implantiert, um die Fensterkammer an den Wirbeln zu stützen und zu fixieren (siehe Abschnitt 2.7-8).
    1. Biegen Sie mit einer kleinen Standardklammer (Krone = 8 mm; Schenkel = 4 mm) die Mitte der Krone um ~90°, so dass sich die Spitzen der Beine fast berühren.
    2. Beugen Sie die Spitzen der Beine in der Mitte ~45° nach außen, so dass die distale Hälfte der Beine parallel ist.
    3. Beugen Sie die distale Hälfte der Beine ~30° relativ zur Ebene der Klammer nach oben. Legen Sie die modifizierten Klammern vor der Operation zur Sterilisation in Ethanol.
      Hinweis: Klammern können auch mit Ethylenoxid sterilisiert oder autoklaviert werden.
  3. Modifikationen an Büroklammern - Bereiten Sie eine modifizierte Büroklammer vor, die als Teil der Kammer implantiert wird (siehe Abschnitte 2.9-10) und als Halteklammer für Chirurgie und Bildgebung dient.
    1. Entfernen Sie mit einer handelsüblichen Büroklammer von 25 mm die kleine Biegung, so dass eine längliche U-Form übrig bleibt.
    2. Reduzieren Sie mit einer Zange oder einem Nadeltreiber den Durchmesser der Biegung auf ~2 mm, während Sie die Spitzen parallel halten.
    3. Biegen Sie die Spitzen ca. 8-10 mm von der Biegung entfernt um ~90° nach außen. Nehmen Sie alle notwendigen Einstellungen vor, damit es flach liegt.

2. Fenster-Implantation

Hinweis: Alle chirurgischen Eingriffe und Tierpflegeverfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften durchgeführt und vom Nationalen Tierversuchsausschuss Frankreichs genehmigt (Genehmigung Nr. 13.300).

  1. Betäuben Sie die Maus (Ket/Xyl; Induktionsdosis: 120 mg/kg, 12 mg/kg; zusätzliche Dosis, 40 mg/kg, 4 mg/kg), tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf.
  2. Rasieren Sie den Rücken ca. ~2 cm breit und ~5 cm lang, zentriert auf dem Brusthöcker, und reinigen Sie die freiliegende Haut mit Jodseife, gefolgt von Jodlösung. Reinigen Sie die Handschuhe, indem Sie sie mit 90% Ethanol besprühen.
  3. Schneiden Sie mit einer Gewebeschere die Rückenhaut in Längsrichtung über die Wirbel T11 bis L1 (~2 cm) ein. Nehmen Sie mit einem Skalpell bilaterale Längsschnitte zwischen dem Dornfortsatz und dem Querfortsatz von T11 bis L1 vor. Hinweis: Wenn Handschuhe oder Instrumente das Fell oder die Haut des Tieres berühren, reinigen Sie die Handschuhe oder das Instrument erneut mit einem Kaltsterilisator wie 90%igem Ethanol oder Germ-X.
  4. Hängen Sie die Maus in die Wirbelsäulengabel stereotaktisch - Klemmen Sie zunächst die obere rechte Wirbelsäulengabel in Position. Greifen Sie T11 mit einer Adson-Pinzette und positionieren Sie den T11-Querfortsatz über der festen Wirbelsäulengabel. Während Sie den Wirbel an Ort und Stelle halten, befestigen Sie die kontralaterale Wirbelsäulengabel unter dem kontralateralen Querfortsatz.
  5. Positionieren Sie L1 auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.4 in der Wirbelsäulengabel.
  6. Mit einem Skalpell (Nr. 23) die Muskeln zwischen den Dorn- und Querfortsätzen von T11 bis L1 vorsichtig abkratzen, so dass die Laminae deutlich sichtbar sind. Für eine bessere Sicht auf die Stiele von T11 schneide man die rostral vorstehende Sehne von der Spitze des Querfortsatzes ab.
  7. Spülen Sie die modifizierten Klammern mit PBS und führen Sie die Spitzen der Klammern seitlich zu den Wirbelstielen von T11 und L1 ein, wobei Sie den Abstand zwischen den Spitzen so einstellen, dass sie die Stiele leicht berühren.
    Hinweis: Verwenden Sie nur PBS, das Dexamethason (0,1 %), Penicillin (1.000 U/ml) und Streptomycin (1 mg/ml) enthält, um postoperative Entzündungen zu reduzieren und die Klarheit des Fensters zu verbessern.
  8. Kleben Sie die Klammern mit einem kleinen Tropfen Cyanacrylat an jeder Einstichstelle fest und entfernen Sie die Maus von den Wirbelsäulengabeln.
  9. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat auf die Schnittkanten der Haut und die freiliegenden Muskeln um die freiliegenden Wirbel auf und achten Sie darauf, die Wirbel nicht zu verkleben. Biegen Sie die Spitzen der modifizierten Büroklammer so, dass sie unter die hervorstehenden Abschnitte der implantierten Klammern eindringen und parallel zur Längsachse der isolierten Wirbelsäule aufliegen und in dieser Position belassen.
  10. Beginnen Sie an der Haut-Muskel-Grenzfläche, tragen Sie mehrere Schichten Zahnzement auf, um die gesamte Öffnung mit Ausnahme der freiliegenden Wirbel zu bedecken, und achten Sie darauf, die Büroklammer sicher in den Zahnzement zu implantieren.
  11. Sobald der Zahnzement ausgehärtet ist (5-15 Minuten), befestigen Sie die Maus an der freiliegenden Stelle der implantierten Büroklammer an der "Cliphalterung". Entfernen Sie mit einer Pinzette den Muskel und anderes Weichgewebe zwischen den Dornfortsätzen und den Lamellen der freiliegenden Wirbel.
    Hinweis: Jedes Gerät, das den freiliegenden Teil der Büroklammer sicher greifen kann, ohne den Clip/die Kammer zu belasten, und das manövriert werden kann, um die Maus während der Operation neu auszurichten, kann als "Clip-Halter" verwendet werden.
  12. Mit dem Knochenentfernungsbohrer die Lamellen von T12 und T13 beidseitig ausdünnen. Um den Rückenknochen zu entfernen, fassen Sie den Dornfortsatz mit einer stumpfen Zange und heben Sie ihn an, wobei Sie darauf achten, dass keine Abwärtskraft auf das Rückenmark ausgeübt wird. Wenn sich der Knochen nicht leicht lösen lässt, dünnen Sie die Laminae weiter aus, bis der Dornfortsatz leicht entfernt werden kann.
  13. Mit dem Knochenentfernungsbohrer die seitlichen Kanten der Wirbel weiter formen, um eine Stützstruktur für das Fenster zu bilden. Entfernen Sie vorsichtig alle kleinen Knochenfragmente, die die Dura mater berühren, mit einer stumpfen Pinzette. Achten Sie darauf, die Feuchtigkeit der Dura Mater mit PBS aufrechtzuerhalten.
  14. Wählen Sie eines der präparierten Fenster, das etwas breiter ist als die Laminektomieöffnung und testen Sie, wie gut es auf dem freiliegenden Knochen aufliegt. Im Idealfall liegt das Fenster beidseitig auf beiden Wirbeln auf, so dass die Mitte des Fensters die Dura mater berührt (Abbildung 1a). Das Fenster sollte das Rückenmark jedoch nicht zusammendrücken, auch wenn das Fenster in Richtung Rückenmark geschoben wird. Wenn das Fenster unausgeglichen ist oder über der Dura aufliegt, wiederholen Sie Schritt 2.13.
  15. Wenn Sie mit der Laminektomie zufrieden sind, legen Sie ein kleines Stück autoklavierte, in PBS getränktes Seidenpapier auf das Rückenmark, um ein Austrocknen der Dura zu verhindern, und legen Sie die Maus beiseite.
  16. Reinigen des Fensters - Legen Sie das Fenster für einige Sekunden in eine Lösung von Fensterreiniger. Wischen Sie das Fenster mit einem Stück Mikroskop-Linsentuch trocken. Überprüfen Sie mit dem Operationsmikroskop, ob das Fenster sauber ist, und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang, wenn dies nicht der Fall ist. Stellen Sie das Fenster an einen sauberen und leicht zugänglichen Ort, um das Fenster in Schritt 2.19 schnell zu entnehmen und zu platzieren.
  17. Holen Sie die Maus heraus und entfernen Sie das Seidenpapier. Entfernen Sie vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette alle Rückstände von der Dura und lassen Sie die Dura trocknen, bis sie leicht klebrig ist.
  18. Füllen Sie schnell das Mischrohr aus Silikon (Kwik-sil) und extrudieren Sie das Silikon auf einen sauberen Objektträger, bis keine Blasen mehr aus der Spitze austreten. Verabreichen Sie sofort eine kleine Silikonperle entlang der Mittellinie des freiliegenden Rückenmarks.
  19. Nehmen Sie die gereinigten Fenster mit einer stumpfen Pinzette heraus und legen Sie sie sofort über das Silikon. Üben Sie mit der stumpfen Pinzette einen kleinen Druck auf das Fenster aus, um das Silikon an den Rändern des Fensters zu verteilen und für ~1 min.
    an Ort und Stelle zu halten Hinweis: Vor dem Mischen muss Silikon unter 27 °C gelagert werden, da sich sonst die Aushärtungszeit erheblich verlängern kann und es nicht am Fenster oder an der Dura mater haftet, was zu einer verminderten optischen Klarheit führt.
  20. Lassen Sie langsam den Druck vom Fenster ab. Wenn sich das Fenster nicht bewegt, fahren Sie sofort mit Schritt 2.21 fort. Wenn sich das Fenster jedoch hebt, wenn der Druck abgelassen wird (d.h. die Wirbel bewegen sich), fahren Sie mit Schritt 2.21 fort, während Sie den Druck auf das Fenster aufrechterhalten, um es an Ort und Stelle zu halten.
  21. Tragen Sie Cyanacrylat rostral und kaudal des Fensters auf. Wenn das Cyanacrylat die rostralen und kaudalen Ränder des Fensters nicht bedeckt, führen Sie mit einem Zahnstocher einen Teil des flüssigen Cyanacrylats über diese Kanten. Führen Sie dann den Kleber entlang der seitlichen Kanten des Fensters (Abbildung 1a), um alle umliegenden Muskeln zu bedecken. Hinweis: Das Cyanacrylat sollte die Oberfläche der Außenkanten des Fensters bedecken. Zu viel Cyanacrylat kann die optische Klarheit beeinträchtigen, zu wenig Cyanacrylat führt zu Luftblasen zwischen Silikon und Fenster.
  22. Um das Cyanacrylat zu schützen und die strukturelle Integrität der Kammer zu erhöhen, tragen Sie Zahnzement auf alle mit Cyanacrylat bedeckten Bereiche auf (Abbildung 1a). Beginnen Sie wie beim Cyanacrylat an den rostralen und kaudalen Rändern und führen Sie den Zahnzement mit einem kleinen Holzstäbchen an den Fensterkanten entlang.

3. Postoperative Versorgung, EAE-Einleitung und Fensterwartung

  1. Injizieren Sie Dexamethason (0,2 mg/kg) und Rimadyl (5 mg/kg) s.q. über die Beckenregionen. Bringen Sie die Maus in einen warmen Käfig (~26 °C) mit Nistmaterial. Die Mäuse sollten voll mobil sein, ihren Käfig erkunden und sich pflegen, nachdem die Wirkung des Anästhetikums vollständig abgeklungen ist (normalerweise 2-3 Stunden). Halten Sie die Tiere individuell und stellen Sie sicher, dass sie in den ersten 1-2 Tagen leichten Zugang zu Futter und Wasser haben. Sobald sich die Maus von der Narkose zu erholen beginnt, injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) s.q. Nach vollständiger Genesung von der Narkose sollte die Maus keine Anzeichen von Schmerzen zeigen. Hinweis: Nach vollständiger Genesung von der Narkose deuten Anzeichen von Schmerzen oder abnormaler motorischer Aktivität darauf hin, dass das Fenster nicht richtig implantiert wurde.
  2. Injizieren Sie Dexamethason (0,2 mg/kg) und Rimadyl (5 mg/kg) alle 2 Tage in den ersten 10 Tagen nach der Operation (Abbildung 1a). Um Mäuse mit Fenstern zu injizieren, sedieren Sie das Tier in einer Induktionskammer leicht mit Isofluran (~1,75% Isofluran an der Luft für 1-2 Minuten). Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und injizieren Sie sofort die Medikamente. Die Maus sollte in <1 min.
    Hinweis: Mäuse mit implantierten Fenstern sollten nicht gescrumpft werden, da dies zu einer Trennung der Haut vom Implantat führen kann. Es ist möglich, Mäuse i.p. ohne Sedierung zu injizieren, indem man ihnen erlaubt, mit den Vorderpfoten einen Käfigdeckel zu greifen und die Hinterbeine sanft anzuheben. In dieser Position zieht sich die Maus jedoch manchmal weg, was zu einer Belastung des implantierten Fensters führt. Dies kann zu Blutungen zwischen Fenster und Rückenmark führen, wodurch die optische Klarheit beeinträchtigt wird.
  3. Die EAE kann 2-3 Wochen nach Beendigung der entzündungshemmenden Behandlung (~3-4 Wochen nach der Operation) induziert werden. Betäuben Sie die Maus leicht, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und halten Sie die Sedierung mit einer Isofluranmaske aufrecht, die über die Nase gelegt wird.
  4. Injizieren Sie MOG35-55 Peptid (75 μg in Freunds Adjuvans mit 800 μg Mycobacterium tuberculosis) an 3 verschiedene s.q. Stellen (bilateral über dem Femur und an der Basis des Schwanzes) und Pertussis Toxin (400 ng) i.p.14,15
    Hinweis: Mäuse mit EAE benötigen im Vergleich zu Mäusen mit nur Fenstern eine zusätzliche Pflege. Wiegen Sie EAE-Mäuse jeden Tag und stellen Sie sicher, dass sie jederzeit leichten Zugang zu Futter und Wasser haben. Ergänzen Sie mit einem 3% Agarose-Gelee, das zur Aufrechterhaltung der Flüssigkeitszufuhr und des Gewichts der Tiere beiträgt. Glukose (1-3%) kann dem Gelee auch für zusätzliche Kalorien zugesetzt werden.
  5. Wiederholen Sie zwei Tage nach der EAE-Induktion das in Schritt 3.2 beschriebene Sedierungsprotokoll und injizieren Sie eine zweite Dosis Pertussis-Toxin (400 ng) i.p.
  6. Um das Rückenmark abzubilden, sedieren Sie das Tier zunächst wie in Schritt 3.2 beschrieben und betäuben Sie es leicht mit Ketamin/Xylazin (100 mg/kg; 10 mg/kg) i.p. Dies ermöglicht ~ 1 Stunde Bildgebung.
  7. Bei Bildgebungssitzungen, die <2 Stunden dauern, kann eine leichte Anästhesie mit zusätzlichen Injektionen von Ketamin/Xylazin (50 mg/kg; 5 mg/kg) alle 45-60 Minuten aufrechterhalten werden. Alternativ können Mäuse für längere Bildgebungssitzungen kontinuierlich mit Isofluran (0,75-1,25 % Isofluran in befeuchteter Luft) sediert werden.
    Hinweis: Fenster können unter einem Operationsmikroskop gereinigt werden, indem Schmutz vorsichtig mit dem Ecken eines Taschentuchs oder einem Wattestäbchen abgewischt wird. Verwenden Sie keinen Alkohol, um das Fenster zu reinigen, da er einige Arten von Zahnzement zersetzen und das Rückenmark kühlen kann.
  8. Nach der leichten Betäubung wird die Maus an der freiliegenden Stelle der implantierten Büroklammer fest an einem Cliphalter befestigt (Abbildung 1b).
  9. Das Rückenmark wird senkrecht zur Objektivlinse ausgerichtet, indem die Positionierung des Clips innerhalb des Halters, die Position des Halters und die Position des Tisches angepasst wird. Die dorsale Oberfläche des Rückenmarks wird schnell abgebildet, und das dorsale Gefäßsystem wird verwendet, um die Ausrichtung des Rückenmarks zu bestimmen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Verwendung chronisch implantierten Glasfenster in Kombination mit intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie und EAE-Modellen könnte ein nützliches Werkzeug sein, um die zellulären Mechanismen zu verstehen, die der Pathologie autoimmuner demyelinisierender Erkrankungen zugrunde liegen. Mithilfe unserer Implantationsmethode stellten wir fest, dass die meisten Fenster zum Zeitpunkt der EAE-Induktion klar waren und während des gesamten EAE-Verlaufs klar blieben (Abbildung 1c). Bei Anwendung dieses Ansatzes z...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Wir haben eine Methode zur Implantation und Aufrechterhaltung von Glasfenstern über dem freiliegenden Rückenmark adulter Mäuse beschrieben, um das dynamische Fortschreiten der EAE im Laufe der Zeit zu untersuchen. Ein ähnlicher Ansatz der Glasfensterimplantation wurde zur Untersuchung von Rückenmarksverletzungsmodellen13 verwendet und kann auch für die Untersuchung anderer Rückenmarkspathologien wie Glioblastome, Meningitis oder der zellulären Physiologie des normalen Rückenmarks nützlich sein. Für unsere Meth...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen und S. Meijia-Gervacio für hilfreiche Diskussionen; M. Hocine und C. Meunier sowie das Personal der Tier- und PicSIL-Bildgebungseinrichtungen des IBDML für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch ein institutionelles Stipendium des Centre National de la Recherche Scientifique und durch Zuschüsse der Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (an G.R. und K.K.F.), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) und Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (an FD) unterstützt. K.K.F. wurde durch ein ARSEP-Stipendium unterstützt. Die Bildgebung wurde auf der PIcSIL-Bildgebungsanlage des IBDML durchgeführt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bohrer zur KnochenentfernungWorld Precision InstrumentsIDEAL MICRO-DRILLAuch von Harvard Apparatus verkauft.
Jeder hochwertige chirurgische Knochenbohrer reicht aus.
Bohrfräser (#1/4 oder 1/2 Hartmetall-Rundfräser)World Precision Instruments501860 (#1/4)
501860 (#1/2)		Auch verkauft von Harvard Apparatus
StaplesLyreco5.002.567Krone = 8 mm
Bein = 4 mm
BüroklammerAlle Standard-Büroklammern 25 mm
NadeltreiberFine Science Tools12003-15
GewebeschereFine Science Tools14028-10
Adson-ZangeFine Science Tools11027-121 x 2 Zähne
Stumpfe PinzetteFine Science Tools11293-00
WirbelsäulengabelnHarvard Apparatus724813
Dental CementGACD12-565 & 12-568
SilikonelastomerWorld Precision InstrumentsKWIK-SILAuch erhältlich über Coherent Scientific und Fisher Scientific
CyanacrylatEleco-EFDCyanolit 201
MikroskopZeiss7MPUnser Mikroskop ist in einer aufrechten Konfiguration und mit 5 NDD-Detektoren ausgestattet.
ObjektivZeissW Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mmArbeitsabstand = 1.8 mm

Referenzen

  1. Kim, J. V., Dustin, M. L. Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier. J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).
  2. Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat. Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
  3. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  4. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
  5. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal. 11 (5), 572-577 (2005).
  6. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr. Biol. 19 (11), 930-936 (2009).
  7. Dibaj, P., Nadrigny, F., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  8. Dibaj, P., Steffens, H., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), (2011).
  9. Johannssen, H. C., Helmchen, F. In vivo Ca2+ imaging of dorsal horn neuronal populations in mouse spinal cord. J. Physiol. 588 (18), 3397-3402 (2010).
  10. Nikić, I., Merkler, D., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis). Nat. Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  11. Di Maio, A., Skuba, A., et al. In vivo imaging of dorsal root regeneration: rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. J. Neurosci. 31 (12), 4569-4582 (2011).
  12. Laffray, S., Pagès, S., Dufour, H., De Koninck, P., De Koninck, Y., Côté, D. Adaptive movement compensation for in vivo imaging of fast cellular dynamics within a moving tissue. PloS One. 6 (5), (2011).
  13. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J. Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  14. Kuerten, S., Angelov, D. N. Comparing the CNS morphology and immunobiology of different EAE models in C57BL/6 mice - a step towards understanding the complexity of multiple sclerosis). Ann. Anat. 190 (1), 1-15 (2008).
  15. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  16. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted. Nat. Methods. , (2012).
  17. Moreno, B., Jukes, J. -P., et al. Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation. Ann. Neurol. 70 (6), 932-942 (2011).
  18. Lassmann, H., van Horssen, J. The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3715-3723 (2011).
  19. Yenari, M. A., Han, H. S. Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 267-278 (2012).
  20. Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. J. Neurophysiol. 108 (11), 3138-3146 (2012).
  21. Pérez-Nievas, B. G., García-Bueno, B., Madrigal, J. L. M., Leza, J. C. Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated. J. Neuroinflammation. 7, 60 (2010).
  22. Bjartmar, C., Kidd, G., Mörk, S., Rudick, R., Trapp, B. D. Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N-acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients. Ann. Neurol. 48 (6), 893-901 (2000).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

RückenmarkfensterIntravitale Zwei-Photonen-MikroskopieImplantation von GlassubstratenAnwendung von SilikonelastomerenCyanoacrylat-Dentalkleber-KammerThy1-CFP-23-MäuseQuantifizierung des axonalen VerlustsLaminektomie des RückenmarksAntiinflammatorisches Behandlungsprotokoll
Implantation von gläsernen Rückenmarksfenstern bei erwachsenen Mäusen mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.