Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Marion Szelechowski; Corinne Bergeron; Daniel Gonzalez-Dunia; Bernard Klonjkowski

doi:10.3791/50833

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Methodenartikel

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

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DOI:

10.3791/50833

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3. Dezember 2013

Marion Szelechowski¹ , Corinne Bergeron² , Daniel Gonzalez-Dunia¹ , Bernard Klonjkowski²

¹INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, ²UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Zusammenfassung

Adenovirus (Ad) abgeleitete Vektoren wurden häufig für kurz- oder langfristigen Gentransfer verwendet, sowohl für Gentherapie- als auch für Impfstoffanwendungen. Aufgrund der häufigen vorbestehenden Immunität gegen das klassisch verwendete humane Adenovirus Typ 5 wurde das canine Adenovirus Typ 2 (CAV2) als alternativer Vektor für den humanen Gentransfer vorgeschlagen. Die gut charakterisierte Biologie von CAV2 bietet zusammen mit seiner einfachen genetischen Manipulation große Vorteile, insbesondere für den Gentransfer in das zentrale Nervensystem oder für die Induktion einer breiten Palette von schützenden Immunreaktionen, von der humoralen bis zur zellulären Immunität. Heutzutage stellt CAV2 eines der attraktivsten nichtmenschlichen Adenoviren für den Einsatz als Impfstoffvektor dar. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Konstruktion, Herstellung und Titer rekombinanter CAV2-Vektoren. Nach der Klonierung der Expressionskassette des interessierenden Gens in ein Shuttle-Plasmid wird das rekombinante genomische Plasmid durch homologe Rekombination im Bakterienstamm E. coli BJ5183 erhalten. Das resultierende genomische Plasmid wird dann in Nierenzellen des Hundes transfiziert, die die komplementären CAV2-E1-Gene (DK-E1) exprimieren. Eine virale Amplifikation ermöglicht die Herstellung eines großen Virusbestandes, der durch Ultrazentrifugation durch Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt und durch Dialyse entsalzt wird. Die resultierende Virussuspension hat routinemäßig einen Titer von über 10^{bis 10} infektiösen Partikeln pro ml und kann direkt in vivo verabreicht werden.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten haben von Adenoviren (Ads) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit in der Gentherapie und Impfung sowie in der onkolytischen Virotherapie bewiesen ¹. Ads sind unbehüllte ikosaedrische Viren aus der Familie der Adenoviridae, die aus Säugetieren, Vögeln, Reptilien, Amphibien und Fischen isoliert wurden. Seit ihrer Entdeckung im Jahr 1953 wurden Anzeigen als Modelle zur Untersuchung von Virus-Zell-Interaktionen und in jüngerer Zeit als vektorbasierte Genverabreichungssysteme intensiv untersucht ². In der Tat bieten ads-basierte Vektoren viele Vorteile, wie z. B. ihr breites Wirtsspektrum und ihre gut charakterisiert....