Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Zusammenfassung

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Zusammenfassung

Adenovirus (Ad) abgeleitete Vektoren wurden häufig für kurz- oder langfristigen Gentransfer verwendet, sowohl für Gentherapie- als auch für Impfstoffanwendungen. Aufgrund der häufigen vorbestehenden Immunität gegen das klassisch verwendete humane Adenovirus Typ 5 wurde das canine Adenovirus Typ 2 (CAV2) als alternativer Vektor für den humanen Gentransfer vorgeschlagen. Die gut charakterisierte Biologie von CAV2 bietet zusammen mit seiner einfachen genetischen Manipulation große Vorteile, insbesondere für den Gentransfer in das zentrale Nervensystem oder für die Induktion einer breiten Palette von schützenden Immunreaktionen, von der humoralen bis zur zellulären Immunität. Heutzutage stellt CAV2 eines der attraktivsten nichtmenschlichen Adenoviren für den Einsatz als Impfstoffvektor dar. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Konstruktion, Herstellung und Titer rekombinanter CAV2-Vektoren. Nach der Klonierung der Expressionskassette des interessierenden Gens in ein Shuttle-Plasmid wird das rekombinante genomische Plasmid durch homologe Rekombination im Bakterienstamm E. coli BJ5183 erhalten. Das resultierende genomische Plasmid wird dann in Nierenzellen des Hundes transfiziert, die die komplementären CAV2-E1-Gene (DK-E1) exprimieren. Eine virale Amplifikation ermöglicht die Herstellung eines großen Virusbestandes, der durch Ultrazentrifugation durch Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt und durch Dialyse entsalzt wird. Die resultierende Virussuspension hat routinemäßig einen Titer von über 10^{bis 10} infektiösen Partikeln pro ml und kann direkt in vivo verabreicht werden.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten haben von Adenoviren (Ads) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit in der Gentherapie und Impfung sowie in der onkolytischen Virotherapie bewiesen ¹. Ads sind unbehüllte ikosaedrische Viren aus der Familie der Adenoviridae, die aus Säugetieren, Vögeln, Reptilien, Amphibien und Fischen isoliert wurden. Seit ihrer Entdeckung im Jahr 1953 wurden Anzeigen als Modelle zur Untersuchung von Virus-Zell-Interaktionen und in jüngerer Zeit als vektorbasierte Genverabreichungssysteme intensiv untersucht ². In der Tat bieten ads-basierte Vektoren viele Vorteile, wie z. B. ihr breites Wirtsspektrum und ihre gut charakterisierte Biologie, zusammen mit der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert und für die Produktion in großem Maßstab amplifiziert werden können.

Um klinische Schwierigkeiten im Zusammenhang mit bereits bestehender Immunität in menschlichen Populationen gegenüber Vektoren, die von menschlichem Ads ³ abgeleitet wurden, zu überwinden, haben wir und andere begonnen, Vektoren aus nicht-menschlichem Ads ⁴ abzuleiten. Darüber hinaus scheinen nicht-humane adenovirale Vektoren für Massenimpfungen in der Veterinärmedizin besser geeignet zu sein als das klassisch verwendete Adenovirus Typ 5 (Ad5), da sie bei der Risikobewertung durch die nationalen Zulassungsbehörden besser den Sicherheitsanforderungen entsprechen sollten. In den späten 1990er Jahren beschrieben wir das erste rekombinante CAV2 als nicht-humane Alternative zu Vektoren, die von Ad5 ⁵ abgeleitet wurden. Seitdem haben zahlreiche Studien das Potenzial von CAV2-Vektoren für den therapeutischen oder antigenen Gentransfer bestätigt (für Übersichtsarbeiten ^6,7). Wie andere Ads-Produkte sind CAV2-abgeleitete Vektoren stabil und können bei hohen Titern hergestellt werden, was ihre Verwendung in vivo erleichtert. Sie sind auch sicher, da sie nicht integrativ sind, obwohl sie eine lang anhaltende Transgenexpression in vivo (>1 Jahr) ermöglichen ⁸. Bemerkenswerterweise und besser als humane Ads-Serotypen haben sich CAV2-Vektoren als hochgradig neurotrop erwiesen, mit einem sehr effizienten retrograden Transport in den Axonen ^9,10. Diese intrinsische Eigenschaft brachte die Idee auf die Idee, rekombinante CAV2-Vektoren zu verwenden, um Neuronen bestimmter Hirnareale zu transduzieren, die für lentivirale Vektoren kaum zugänglich sind, die bisher häufig für den Gentransfer in das zentrale Nervensystem verwendet werden ¹¹.

Hier beschreiben wir ein einfaches und klassisches Protokoll zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von nicht-replikativen CAV2-Vektoren, die vom Manhattan-Stamm abgeleitet sind. Rekombinante CAV2-Genome werden durch Klonierung des gewünschten Gens von Interesse (GOI) in einer Kassette stromabwärts des frühen Promotors des Cytomegalievirus (CMV) konstruiert, der eine ubiquitäre Expression bietet. CAV2-Vektoren haben eine Klonierungskapazität von ~4,2 kbp, was die Expression großer cDNA ermöglicht. In einem zweiten Schritt wird diese Expressionskassette durch homologe Rekombination anstelle der E1-Region des CAV2-Genoms eingefügt, was zu einem nicht-replikativen Virus (dlE1) führt, wie es ursprünglich von Chartier et al. beschrieben wurde. ¹² Schließlich werden virale Partikel nach Transfektion des genomischen Plasmids in eine CAV2-E1-exprimierende canine Nierenzelllinie (DK-E1) produziert und vor der Konzentration und Reinigung der Virusstämme seriell amplifiziert. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine zweistufige Ultrazentrifugation in Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten, die eine Anreicherung von infektiösen Partikeln mit einem hohen Endtiter (in der Regel über 10¹⁰ infektiöse Partikel pro ml) ermöglicht. Die Virussuspension wird dann durch Chromatographie durch Einweg-Sephadex G-25-Säulen entsalzt, so dass sie letztendlich rein genug ist, um direkt in vivo verwendet zu werden.

Protokoll

1. Konstruktion eines nicht-replikativen CAV2-Genomplasmids

Hinweis: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Plasmide wurden bereits⁷ beschrieben und sind auf Anfrage erhältlich.

1. Klonieren Sie den GOI unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme in das pShuttle-Plasmid, um pShuttle-GOI zu erzeugen (Abbildung 1A).
2. 2 μg pShuttle-GOI durch AscI/PacI verdauen. Durch den Aufschluss wird das Shuttle-GOI-Fragment (~2,9 kbp + GOI-ORF-Sequenz) aus dem Plasmidrückgrat (2,8 kbp) freigesetzt.
3. Reinigen Sie das Shuttle-GOI-Fragment nach der Agarose-Gelelektrophorese mit NucleoSpin Gel und PCR-Clean-up-Kit.
4. Verdauen Sie parallel dazu 1 μg pCAV2-Genomplasmid durch SwaI. Das pCAV2-Plasmid enthält eine einzigartige SwaI-Stelle, die sich in der E1-Region befindet (Abbildung 1B). Inaktivieren Sie dieses Restriktionsenzym bei 65 °C für 20 min.
5. Transformieren Sie kompetente E. coli BJ5183-Bakterien mit 500 ng gereinigtem Shuttle-GOI-Fragment und 100 ng linearisiertem pCAV2-Plasmid für die homologe Rekombination (Figure 1B). Auf LB-Amp Platten verteilen. Die Platten mindestens 20 Stunden lang bei 37 °C inkubieren.
6. Durchführung der PCR-Analyse direkt an Bakterienkolonien unter Verwendung von EmeraldAmp Mastermix mit Vorwärts- (5'-CACGAGGCCCTCTCGTCGTCTTCAA-3') und Rückwärtsprimern (5'-GCGGGGTAGTTTATCAGTTAAATTGC-3') unter den folgenden Zyklusbedingungen: 10 min bei 95 °C (für einen Zyklus), 95 °C für 1 min; 58 °C für 1 min; 72 °C für 1 min/kbp (für 39 Zyklen), und schließlich 5 min bei 72 °C. Ein Produkt mit einer ORF-Sequenz von 1 kbp + GOI wird aus pCAV-GOI-positiven Klonen amplifiziert, während mit negativen Klonen kein PCR-Produkt nachgewiesen werden kann.
7. Mindestens zwei positive Kolonien über Nacht in je 5 ml LB-amp Medium bei 37 °C in einem Shaker (220 U/min) impfen.
8. Extrahieren Sie Plasmid-DNAs mit dem Nucleospin-Plasmidkit. Transformieren Sie kompetente E. coli DH5α-Bakterien mit einem Aliquot jeder DNA-Präparation. Bakteriensuspension auf LB-Amp Platten verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
9. Zwei Kolonien jedes positiven Klons werden über Nacht in 3 ml LB-amp Medium bei 37 °C in einem Shaker (220 U/min) beimpft. Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit dem Nucleospin-Plasmid-Kit.
10. Verdauen Sie die resultierende DNA und das elterliche pCAV2-Plasmid (als Kontrolle) mit NdeI. Das Einschränkungsmuster des elterlichen pCAV2 beträgt 14,8 kbit/, 9 kbit/, 7,9 kbit/s und 1,6 kbit/s. Die Expressionskassette der indischen Regierung wird in das 7,9-kbit/-Fragment eingefügt und enthält mindestens eine NdeI-Stelle, d. h. eine in der Kassette und die potenziellen Stellen in der indischen Regierung.
11. Wählen Sie positive Konstruktionen aus und fahren Sie mit Schritt 2 mit mindestens 2 unabhängigen Klonen fort.

2. Transfektion von rekombinantem CAV2-Genomplasmid in DK-E1-Zellen

Hinweis: CAV2-abgeleitete nicht-replikative Vektoren sind gentechnisch veränderte Organismen, die als Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) eingestuft sind, während ihre Verwendung in Tiermodellen als BSL-1 eingestuft ist. Bitte verwenden Sie geeignete Maßnahmen zur Eindämmung und Abfallbehandlung, einschließlich persönlicher Schutzausrüstung, und arbeiten Sie unter BSL-2-Laminar-Flow-Hauben.

1. Einen Tag vor der Transfektion säen Sie DK-E1-Zellen auf einer 6-Well-Platte. Züchten Sie Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, das 7 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), 1 mM Natriumpyruvat und 100 U/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin enthält. Die Zellen sollten für die Transfektion zu 70-80 % konfluent sein.
2. 2 μg pCAV-GOI-Plasmid werden mit AscI verdaut, um die nichtvirale Sequenz des Plasmids freizusetzen. Überprüfen Sie das resultierende Restriktionsmuster durch 0,8% Agarose-Gelelektrophorese. Der Aufschluss sollte ein ~31 kbp großes Fragment ergeben, das das rekombinante Genom enthält, und ein 2 kbp großes Fragment, das dem Plasmidrückgrat entspricht.
3. Mischen Sie die verdaute DNA mit 200 μl Jet Prime Puffer, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Fügen Sie 4 μl Jet Prime hinzu und mischen Sie es, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Schleudern Sie es kurz, um die Tröpfchen zu entfernen, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Geben Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Zellen. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie bei 37 °C.

3. Ausbreitung von rekombinantem CAV2

1. Eine Woche nach der Transfektion werden Zellen und Kulturmedium in einem 15-ml-Röhrchen aus Polypropylen gesammelt. Die Zellen werden durch drei Gefrier-Tau-Zyklen (-80 °C/37 °C) aufgebrochen und das Lysat durch Zentrifugation für 10 min bei 1.800 x g geklärt
.
2. Überstand auffangen und bei -20 °C für die spätere Virusvermehrung lagern.
3. Infizieren Sie eine 80-90 % konfluente Monoschicht von DK-E1-Zellen, die in einer Vertiefung oder 6-Well-Platte gezüchtet wurde, mit 0,5 ml des virushaltigen Überstands. 1 Stunde lang bei 37 °C unter leichtem Rühren inkubieren. Entfernen Sie das Inokulum und ersetzen Sie es durch 1,5 ml vollständiges DMEM, das 5 % hitzeinaktiviertes FCS enthält.
4. Inkubieren Sie die Zellen 3-4 Tage lang bei 37 °C. Die Zellen sollten täglich auf das Auftreten einer zytopathischen Wirkung überwacht werden (CPE, Abbildungen 2A-B). Wenn kein eindeutiges CPE sichtbar ist, entnehmen Sie die Zellen nach 4 Tagen Kultur und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4.
5. Wenn ein klares CPE die Mehrheit der Zellen betrifft, in der Regel nach 2-4 viralen Amplifikationsrunden, sammeln Sie die Zellen mit Kulturmedium und frieren und auftauen Sie 3x wie oben beschrieben. Infizieren Sie 80-90 % konfluente DK-E1-Zellen, die in drei Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm gezüchtet wurden, wobei jeweils 0,5 ml virushaltiger Überstand verwendet werden.
6. Nach 3-4 Tagen (wenn CPE abgeschlossen ist) entnehmen Sie Zellen aus diesen 10-cm-Schalen, unterbrechen Sie sie erneut durch drei Gefrier-Tau-Zyklen, reinigen Sie das Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 1.800 x g, sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei -20 °C für eine großflächige CAV2-Amplifikation.

4. Großflächige CAV2-Reinigung

1. Infizieren Sie 80-90 % konfluente Monoschichten von DK-E1-Zellen, die in Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm gezüchtet wurden. Für jede Schale werden 0,1 ml virushaltiger Überstand verwendet, verdünnt in 1 ml vollständigem DMEM ohne FCS. Die Zellen werden bei 37 °C für 3 bis 4 Stunden unter leichtem Rühren inkubiert. Fügen Sie 5 ml vollständiges DMEM hinzu, das mit 5 % FCS ergänzt wird.
2. 3 Tage inkubieren. Ernten Sie infizierte Zellen aus den vierzig 10 cm großen Schalen in 50 ml Polypropylen-Röhrchen. Pelletzellen bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C und resuspendieren Sie diese in 15 ml DMEM-Medium.
3. Brechen Sie die Zellen durch drei Gefrier-Tau-Zyklen (-80 °C/37 °C) auf. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie 10 Minuten lang bei 1.800 x g zentrifugieren und den Überstand vor der Reinigung der Viruspartikel bei -20 °C lagern.
4. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten in einem 14-ml-Ultra-Clear-Röhrchen vor. Gießen Sie zunächst 2 ml CsCl-Lösung (1,40 g/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) auf den Boden des Röhrchens. Geben Sie dann langsam 2 ml CsCl-Lösung (1,25 g/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) auf die erste Lösung.
5. Laden Sie den Virusüberstand vorsichtig auf den CsCl-Gradienten. Füllen Sie das Rohr bis zu 2-3 mm von oben mit Mineralöl. Zentrifugieren Sie 1,5 Stunden bei 130.000 x g und 18 °C in einem schwingenden SW40-Rotor.
6. Nach der Zentrifugation sind zwei weiße Banden an der Grenzfläche zwischen den 2 CsCl-Lösungsschichten deutlich sichtbar (Abbildung 2C). Mit einer 21-G-Nadel und einer Spritze wird das untere Band, das reife CAV2-Partikel enthält, durch seitliche Punktion aufgefangen. Versuchen Sie so weit wie möglich, das obere Band, das leeren Viruspartikeln entspricht, zu vermeiden.
7. Bereiten Sie einen kontinuierlichen CsCl-Gradienten in einem transparenten 14-ml-Röhrchen vor, indem Sie die gesammelten Viruspartikel mit einer CsCl-Lösung (1,34 g/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) mischen. Füllen Sie das Rohr bis zu 2-3 mm von oben mit Mineralöl. Zentrifugieren Sie 18 Stunden bei 130.000 x g und 18 °C in einem schwingenden SW40-Rotor.
8. Nach der Zentrifugation wird das weiße CAV2-haltige Band durch Seitenpunktion mit einer Spritze wie oben beschrieben entnommen. Versuchen Sie auch hier zu vermeiden, das verbleibende obere Band zu sammeln. Dies sollte in diesem kontinuierlichen Gradienten, der die beiden Bänder besser trennt, einfacher sein. Das Gesamtvolumen der aufgefangenen Suspension sollte 2 ml nicht überschreiten.
9. Eine Sephadex G-25 PD-10-Säule wird mit 30 ml PBS äquilibriert.
10. Laden Sie die Virussuspension und verwerfen Sie den Durchfluss.
11. Eluieren Sie mit Fraktionen von 500 μl PBS. Sammeln Sie die Fraktionen 5-7, die normalerweise die entsalzten CAV2-Partikel enthalten. Die virushaltigen Fraktionen sind leicht zu identifizieren, da sie opaleszierend sind. 150 μl Glycerin zu den 1,5 ml CAV2-Suspension geben und in Aliquoten bei -80 °C lagern.

5. Titration von CAV2 durch Endpunktverdünnung

1. Tauen Sie ein Aliquot des gereinigten Virus auf Eis auf und führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen (im Bereich von 10-2-10-12) in serumfreiem DMEM durch.
2. Geben Sie 50 μl jeder Virusverdünnung in 5 Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie 1,5 x 10⁴ DK-E1-Zellen in jede Vertiefung. Die Platte wird 5 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.
3. Am Tag 5 nach der Infektion ist das Auftreten von CPE durch mikroskopische Beobachtung zu überwachen (Abbildungen 2A-B). Die infektiösen Titer werden als mediane infektiöse Dosen von Gewebekulturen (TCID₅₀) unter Verwendung der statistischen Methode von Reed und Muench^{bestimmt 13}.

Ergebnisse

Die Herstellung rekombinanter CAV2-Vektoren beruht auf grundlegenden, aber wichtigen Methoden der Molekularbiologie. Vor der Produktion viraler Vektoren ist es in der Tat notwendig, ein rekombinantes CAV2-Genom zu konstruieren, das eine Expressionskassette für das Transgen trägt. Diese Konstruktion umfasst zwei Schritte: Zunächst wird das Gen von Interesse (GOI) als Expressionskassette (d.h. mit Promotor und Polyadenylierungssignal) in ein Shuttle-Plasmid kloniert. Dieses funktionelle Element ist von zwei g...

Diskussion

Das hier beschriebene einfache Verfahren, adaptiert von der gut dokumentierten Ad5-Technologie, ermöglicht die effiziente Herstellung von nicht-replikativen CAV2-Vektoren mit einer typischen Klonierungskapazität von ~4,2 kbp. Aus Zeitgründen wird ein rekombinantes CAV2-Genom in der Regel in zwei Wochen erzeugt, während es weitere 5 Wochen dauert, um virale Suspensionen zu amplifizieren, zu reinigen und zu titern.

Obwohl die Herstellung der ersten Charge von CAV2-abgeleiteten Vektoren zeitaufwä...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Restriktionsenzyme	New England Biolabs	Various
Jet Prime Transfektionskit	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli BJ5183 Bakterien	Agilent	200154
PD-10 Entsalzungssäule	GE Healthcare	17-0851-01
EmeraldAmp Polymerase	Takara	RR320A
Nucleospin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Gel und PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
14 ml Röhrchen, Ultra Clear	Beckman	344060