Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Summary

Wir beschreiben hier, wie Sie eine Einzelzellmikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen einige nützliche Tipps zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen und liefern. Wir gehen davon aus, dass dieses Papier allen helfen wird, den Grad der zellulären Kopplung aufgrund funktioneller gap junctions zu bewerten. Alles, was hier beschrieben könnte im Prinzip angepasst anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton.

Abstract

Gap Junctions sind interzelluläre Kanäle, die die Kommunikation benachbarter Zellen ermöglichen. Diese Kommunikation hängt vom Beitrag eines Hemikanals durch jede benachbarte Zelle zur Bildung der Gap Junction ab. In Säugetierzellen besteht der Hemikanal aus sechs Connexinen, Monomeren mit vier Transmembrandomänen und einem C- und N-Terminal innerhalb des Zytoplasmas. Gap Junctions ermöglichen den Austausch von Ionen, Botenstoffen und kleinen Metaboliten. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle in vielen Formen der zellulären Kommunikation innerhalb physiologischer Prozesse wie synaptischer Übertragung, Herzkontraktion, Zellwachstum und Differenzierung. Wir beschreiben, wie eine einzellige Mikroinjektion von Lucifer Yellow durchgeführt wird, um die zelluläre Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen zu visualisieren. Es wird erwartet, dass der Farbstoff in funktionellen Gap Junctions von der beladenen Zelle zu den verbundenen Zellen diffundiert. Es ist eine sehr nützliche Technik, um Gap Junctions zu untersuchen, da Sie die Diffusion der Fluoreszenz in Echtzeit bewerten können. Wir besprechen, wie die Zellen und die Mikropipette vorbereitet werden, wie man einen Mikromanipulator verwendet und einen niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoff in eine Epithelzelllinie injiziert.

Introduction

Gap Junctions sind interzelluläre Kanäle, die die gegenseitige Verbindung zwischen benachbarten Zellen ¹ zu ermöglichen. Diese Kommunikation verbindet zwei oder mehr benachbarten Zellen, wo jeder trägt mit einem Connexin oder hemichannel den interzellulären Kanal zu bilden. In Säugerzellen wird das Connexon sechs Connexine, Monomere mit vier transmembranen Domänen und einer C- und N - terminalen im Zytoplasma ² gebildet. Gap Junctions erlauben nicht nur den Fluss von Ionen, sekundäre Botenstoffe und kleine Stoffwechselprodukte , sondern auch für viele Formen der zellulären Kommunikation in vielen physiologischen Prozessen, wie der synaptischen Übertragung, Herzkontraktion, Zellwachstum beitragen und Differenzierung ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Zusätzlich Gap Junctions wurden mit den zugehörigenviele Krankheiten , darunter Krebs ^{9, 10,} Muskelatrophie ^11, einige genetische Krankheiten und demyelinisierenden Erkrankungen ^12.

Diese Art von interzellularen Übersprechens kann durch mehrere Methoden , ^{13, 14, 15, 16} ausgewertet werden. zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen in diesem Beitrag zeigen wir, wie ein Single-Cell-Mikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen. Wir diskutieren, wie die Zellen vorzubereiten und die Mikropipette, die Verwendung des Mikromanipulators und die Injektion von Lucifer Yellow-Farbstoff in einer Thymus-Epithel-Zelllinie. Normalerweise ist diese experimentelle Verfahren konnte durch den Durchschnitt der verbundenen Zellen zu der Zelle mit Farbstoff beladen analysiert werden. Darüber hinaus könnte dieses Verfahren mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unterhalb des Spaltes verwendet werdenKreuzungen Cut-off, die etwa 1000 Dalton ist.

Protocol

1. Herstellung von Zellen

1. Pflegen einer Kultur eines Thymus - Epithel - Zelllinie (IT76M1) oder einer Zelle in einem Inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ getestet werden.
2. Waschen Sie die Zellen mit PBS 1x (wiederholen Sie diesen Artikel 3x).
3. Hinzufügen Trypsin zu den Zellen für 5 min.
4. Hinzufügen Medium (zweimal des Volumens von Trypsin hinzugefügt in Punkt 1.3) mit 10% FBS (fötales Rinderserum) auf die Zellen mit Trypsin und zentrifugiert (800 × g für 5 min).
5. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer.
6. Stellen Sie die Dichte der Zellen entsprechend dem Zelltyp, wie die Zellen in engem Kontakt miteinander sein müssen Kopplung zu ermöglichen. Hinweis: In unserem Fall haben wir 3 x 10 ⁵ Zellen pro 35 mm Petrischale.

2. Vorbereitung Mikropipette

1. Ziehen Sie den Mikropipette als aus einer Glaskapillare Mikro spezifiziert (1,5 mm Durchmesser) auf einen endgültigen Durchmesser von 0,2 & mgr; m, um eine endgültige Widerstand von etwa 30 M & Omega; zu erreichenf "> ^{17, 18.}
   HINWEIS: Alternativ-Spritzen Pipetten erworben werden kann. Der Widerstand hängt von der Zellgröße, beispielsweise eine höhere Resistenz Mikroelektrode würde Azinuszellen des Pankreas erforderlich sein, beispielsweise (100-150 M & OHgr;) ^19. Ein häufiges Problem ist die Fällung von Lucifer Yellow Lösung kommen könnte, die dann die Mikro behindern können und kann vor der Filtration oder Zentrifugation erfordern. Vor der Injektion sollte die Mikropipette unter dem Mikroskop untersucht werden , um festzustellen , ob es ein Hindernis ist , oder jede Art von Störungen ^13. Die Mikropipette kann durch die Injektion von LY mit der Mikropipettenspitze in einer Salzlösung getestet werden.

3. Prüfung der Mikropipette

1. Bereiten Sie die Lucifer Yellow-Lösung (5%) in 150 mmol / L LiCl und laden Sie die Mikropipette mit einer Spritze oder durch Verfüllung (put in sie LY Solution).
2. Legen Sie die Micropipette über die 35 mm-Petrischale mit den IT76M1 Zellen auf dem Mikroinjektions Workstation und tauchen die Spitze des Glas-Mikropipette in das Zellmedium. Konzentrieren Sie sich auf der Mikropipette und führen Sie einen Farbstoff fließt Test durch das Aufbringen eines Impulses.

4. Single-Zelle Lucifer Yellow Mikroinjektions

1. Konzentrieren Sie das Mikroskop direkt über der Zellschicht eine hohe Magni fi kation (40X) verwenden, dann senken Sie langsam die Pipette auf die Zellen, die die Mikromanipulator mit.
2. Stechen Sie die Zielzelle, wenn die Spitze nahe genug ist, um die Zellmembran zu berühren, und geben Sie eine kleine hyperpolarisierender Impuls die LY in die Zelle einzuführen. Die angelegte Spannung wird auf die Nettoladung des Farbstoffs abhängen injiziert werden. Alternativ könnten einige andere Farbstoffe mit dieser Technik verwendet werden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
   Hinweis: Im Prinzip jedes hydrophile Farbstoff mit MW von weniger als 1 kDa verwendet werden könnten. Jedoch könnte die Übertragungsrate ändern sich je nach dem Gewicht und der Hydrophilie. Zusätzlich unspecific Übertragung des Farbstoffs verwendet wird, muss untersucht werden.
3. Erfassen Zellbildern 3 Minuten nach Farbstoffinjektion oder machen einen kleinen Film mit Zeitraffer-Mikroskopie (30 fps).
   HINWEIS: Ein ähnlicher Ansatz in Hitomi et al (2015) ²⁰ zu sehen. Um die Kommunikation durch Interzellularbrücken (incomplete Mitose), eine Co-Injektion von Rhodamin - Dextran (2 bis 10 KDa) zu vermeiden, die nicht durch gap junctions hindurchgeht , sondern durchläuft Interzellularbrücken und bestimmte Arten von Nanoröhrchen empfohlen wird , wie in Figur 2 gezeigt .

Results

Thymic epithelialen Zelllinie IT-76MI wurden verwendet Farbstoff Kopplung von gap junctions zu bewerten , da diese Zellen funktionelle Gap Junctions von 43 ²¹ Connexin gebildet auszudrücken beschrieben wurden. Abbildung 1 zeigt die Injektion von Lucifer Yellow, wenn in der einen Zelle unterhalb der Spitze der Pipette aufgetragen. Nach einigen Minuten werden verbundenen Zellen fluoreszierend (Sternchen), die Diffusion des Fluoreszenzfarbstoffs durch die gap junctio...

Discussion

Um die Anwesenheit von funktionellen interzellularen gap junction, die Verwendung von Tracern , um zu überprüfen, die Membran undurchlässig sind, obwohl durchlässig durch interzelluläre Kanäle ¹⁶ erforderlich sind. Fluorescein, der erste Fluoreszenzfarbstoff von Zelle zu Zelle Kupplung ^22, durchlässig ist ³ zwischen nicht junctional Membranen zu beobachten und ist daher durch Lucifer Yellow Farbstoff ¹⁵ ersetzt wurde. Derzeit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luzifer gelb	Sigma	L0259
Lithium Chlorid	Sigma	L4408
PBS Tabletten	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Rinder-Fötalserum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
vibrationsisolierter Tisch	Newport	VH3036W-OPT	Ein vibrationsisolierter Tisch wird benötigt, um die Experimente vor Vibrationen zu schützen und Zellschäden zu vermeiden
Mikromanipulator	Narishige	MMO-203	Dieses Gerät ermöglicht die präzise Einstellung der Mikropipette, die für die Mikroinjektion von Zellen benötigt wird.
Stromgenerator	Digitimer	DS2	Um den Farbstofffluss durch die Mikropipette zu erzeugen, wurde ein Strom unter einem Nanoampere unter Verwendung eines Stromgenerators mit einer Elektrode in der Mikropipette oder eines Verstärkers gegeben, der über eine Kapazitätskompensationsschaltung (altes Elektrometer) oder Strominjektionsfunktionen neuer Patch-Clamp-Verstärker verfügt, wobei der Erdungsdraht in die Plattenschale eingetaucht ist. Alternativ kann der Farbstoff mit einem pneumatischen Mikroinjektor injiziert werden, wobei die Werksempfehlungen befolgt werden.