Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Summary

Wir beschreiben hier, wie Sie eine Einzelzellmikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen einige nützliche Tipps zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen und liefern. Wir gehen davon aus, dass dieses Papier allen helfen wird, den Grad der zellulären Kopplung aufgrund funktioneller gap junctions zu bewerten. Alles, was hier beschrieben könnte im Prinzip angepasst anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton.

Abstract

Gap Junctions sind interzelluläre Kanäle, die die Kommunikation benachbarter Zellen ermöglichen. Diese Kommunikation hängt vom Beitrag eines Hemikanals durch jede benachbarte Zelle zur Bildung der Gap Junction ab. In Säugetierzellen besteht der Hemikanal aus sechs Connexinen, Monomeren mit vier Transmembrandomänen und einem C- und N-Terminal innerhalb des Zytoplasmas. Gap Junctions ermöglichen den Austausch von Ionen, Botenstoffen und kleinen Metaboliten. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle in vielen Formen der zellulären Kommunikation innerhalb physiologischer Prozesse wie synaptischer Übertragung, Herzkontraktion, Zellwachstum und Differenzierung. Wir beschreiben, wie eine einzellige Mikroinjektion von Lucifer Yellow durchgeführt wird, um die zelluläre Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen zu visualisieren. Es wird erwartet, dass der Farbstoff in funktionellen Gap Junctions von der beladenen Zelle zu den verbundenen Zellen diffundiert. Es ist eine sehr nützliche Technik, um Gap Junctions zu untersuchen, da Sie die Diffusion der Fluoreszenz in Echtzeit bewerten können. Wir besprechen, wie die Zellen und die Mikropipette vorbereitet werden, wie man einen Mikromanipulator verwendet und einen niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoff in eine Epithelzelllinie injiziert.

Introduction

Gap Junctions sind interzelluläre Kanäle, die die gegenseitige Verbindung zwischen benachbarten Zellen ¹ zu ermöglichen. Diese Kommunikation verbindet zwei oder mehr benachbarten Zellen, wo jeder trägt mit einem Connexin oder hemichannel den interzellulären Kanal zu bilden. In Säugerzellen wird das Connexon sechs Connexine, Monomere mit vier transmembranen Domänen und einer C- und N - terminalen im Zytoplasma ² gebildet. Gap Junctions erlauben nicht nur den Fluss von Ionen, sekundäre Botenstoffe und kleine Stoffwechselprodukte , sondern auch für viele Formen der zellulären Kommunikation in vielen physiologischen Prozess....

Protocol

1. Herstellung von Zellen

1. Pflegen einer Kultur eines Thymus - Epithel - Zelllinie (IT76M1) oder einer Zelle in einem Inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ getestet werden.
2. Waschen Sie die Zellen mit PBS 1x (wiederholen Sie diesen Artikel 3x).
3. Hinzufügen Trypsin zu den Zellen für 5 min.
4. Hinzufügen Medium (zweimal des Volumens von Trypsin hinzugefügt in Punkt 1.3) mit 10% FBS (fötales Rinderserum) auf die Zellen mit Trypsin und zentrifugiert (800 × g für 5 min).
5. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer.
6. Stellen Sie die Dichte der Zellen entsprechend dem Zelltyp, wie die Zellen in engem Kontakt mit....

Results

Thymic epithelialen Zelllinie IT-76MI wurden verwendet Farbstoff Kopplung von gap junctions zu bewerten , da diese Zellen funktionelle Gap Junctions von 43 ²¹ Connexin gebildet auszudrücken beschrieben wurden. Abbildung 1 zeigt die Injektion von Lucifer Yellow, wenn in der einen Zelle unterhalb der Spitze der Pipette aufgetragen. Nach einigen Minuten werden verbundenen Zellen fluoreszierend (Sternchen), die Diffusion des Fluoreszenzfarbstoffs durch die gap junctio.......

Discussion

Um die Anwesenheit von funktionellen interzellularen gap junction, die Verwendung von Tracern , um zu überprüfen, die Membran undurchlässig sind, obwohl durchlässig durch interzelluläre Kanäle ¹⁶ erforderlich sind. Fluorescein, der erste Fluoreszenzfarbstoff von Zelle zu Zelle Kupplung ^22, durchlässig ist ³ zwischen nicht junctional Membranen zu beobachten und ist daher durch Lucifer Yellow Farbstoff ¹⁵ ersetzt wurde. Derzeit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luzifer gelb	Sigma	L0259
Lithium Chlorid	Sigma	L4408
PBS Tabletten	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Rinder-Fötalserum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
vibrationsisolierter Tisch	Newport	VH3036W-OPT	Ein vibrationsisolierter Tisch wird benötigt, um die Experimente vor Vibrationen zu schützen und Zellschäden zu vermeiden
Mikromanipulator	Narishige	MMO-203	Dieses Gerät ermöglicht die präzise Einstellung der Mikropipette, die für die Mikroinjektion von Zellen benötigt wird.
Stromgenerator	Digitimer	DS2	Um den Farbstofffluss durch die Mikropipette zu erzeugen, wurde ein Strom unter einem Nanoampere unter Verwendung eines Stromgenerators mit einer Elektrode in der Mikropipette oder eines Verstärkers gegeben, der über eine Kapazitätskompensationsschaltung (altes Elektrometer) oder Strominjektionsfunktionen neuer Patch-Clamp-Verstärker verfügt, wobei der Erdungsdraht in die Plattenschale eingetaucht ist. Alternativ kann der Farbstoff mit einem pneumatischen Mikroinjektor injiziert werden, wobei die Werksempfehlungen befolgt werden.