Methodenartikel

im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren

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DOI:

10.3791/50837

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17. Dezember 2013

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1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo in Richtung Pluripotenz ohne die Erzeugung von Teratomen. Wir verwendeten eine hydrodynamische Schwanzveneninjektion von Plasmid-DNA, die für die Yamanka-Faktoren kodiert, um die in vivo Reprogrammierung von adulten Hepatozyten in Zellen mit erhöhter Pluripotenz zu induzieren.

Zusammenfassung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die aus der Reprogrammierung somatischer Zellen in einen pluripotenten Zustand durch erzwungene Expression definierter Faktoren resultieren, bieten neue Möglichkeiten für die regenerative Medizin. Solche klinischen Anwendungen von iPS-Zellen waren bisher begrenzt, hauptsächlich aufgrund der geringen Effizienz der bestehenden Reprogrammierungsmethoden und des Risikos, dass die erzeugten iPS-Zellen bei der Implantation Tumore bilden.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo durch Gentransfer von Reprogrammierungsfaktoren erreicht werden könnte. Um Zellen in vivo effizient reprogrammieren zu können, müssen hohe Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren von Yamanaka (OKSM) im Zielgewebe exprimiert werden. Dies kann durch die Verwendung unterschiedlicher viraler oder nicht-viraler Genvektoren je nach Zielgewebe erreicht werden. In dieser speziellen Studie wurde die hydrodynamische Schwanzvenen-Injektion (HTV) von Plasmid-DNA verwendet, um die OKSM-Faktoren an die Hepatozyten der Maus zu verabreichen. Dies lieferte den Beweis für die in vivo Reprogrammierung adulter, somatischer Zellen in einen pluripotenten Zustand mit hoher Effizienz und schneller Kinetik. Darüber hinaus wurde in situ keine Tumor- oder Teratombildung beobachtet.

Es kann gefolgert werden, dass die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo einen potenziellen Ansatz zur schnellen, effizienten und sicheren Induktion einer erhöhten Pluripotenz im Vergleich zu in vitro durchgeführten Protokollen bieten könnte und in Zukunft auf verschiedene Gewebetypen angewendet werden kann.

Einleitung

Ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung embryonaler Stammzellen waren eine der Einschränkungen bei der Entwicklung der Stammzellenforschung. Die Entdeckung von Yamanaka und Kollegen, dass die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren (nämlich: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) zu einer In-vitro-Reprogrammierung von somatischen Zellen in pluripotente Zellen führen könnte, die als induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) bezeichnet werden, hat jedoch neue Möglichkeiten eröffnet. Der virale1-5- und der nichtvirale6-10-Gentransfer, die zytoplasmatische Proteintranslokation11,12 und die miRNA13-16-Transfektion gehören zu den verschiedenen Methoden, die heute zur Erzeugung von iPS-Zellen verwendet werden. Solche Reprogrammierungsmethoden leiden jedoch unter verschiedenen Problemen, die ihre Umsetzung in die Klinik einschränken, wie zum Beispiel: a) starke Einschränkungen in der Effizienz der Zellreprogrammierung; b) die überwiegende Verwendung viraler Vektoren; c) lange und mehrstufige Protokolle der Kultivierungsbedingungen; und d) das Risiko einer Tumorigenität durch Implantation der in vitro erzeugteniPS-Zellen 17-20.

Der Gentransfer von definierten Transkriptionsfaktoren3-5 durch Retroviren ist die am häufigsten verwendete Methode, um somatische Zellen umzuprogrammieren. Es enthält jedoch die Risiken, die sich aus der Möglichkeit einer Insertionsmutagenese, einer stabilen Transduktion und einer langfristigen Proto-Onkogen-Expression ergeben21,22. Nichtvirale Gentransfervektoren wie Plasmid-DNA6,7,23 oder RNA 10-Verabreichung mittels Liposomen oder Elektroporation wurden ebenfalls untersucht. Diese Vektoren sind zwar sicherer im Vergleich zu Viren, bieten aber eine deutlich eingeschränkte Transduktions- und Reprogrammierungseffizienz24,25 .

Eines der zentralen Dogmen dieses aufstrebenden Gebietes ist, dass die in vivo Implantation von iPS-Zellen zu deren unkontrollierter Differenzierung und zur Bildung einer tumorähnlichen Masse (Teratom) führt, die aus verschiedenen Geweben der drei verschiedenen Keimblätter besteht. Daher konzentrierte sich das Konzept der Reprogrammierung zur Pluripotenz in erster Linie auf die In-vitro-Manipulation von primär extrahierten somatischen Zellen (am häufigsten Fibroblasten). Wie oben beschrieben, leidet dieses Prinzip jedoch unter langen und komplexen Zellkulturprotokollen, einschließlich mehrerer Behandlungsrunden (Gentransfer, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Antioxidantien), die ihrerseits das Risiko für die Bildung von Teratomen oder andere Formen der Tumorgenese bei der Implantation der Zellen erhöhenkönnen 24-28.

Wir schlagen vor, dass die Reprogrammierung adulter somatischer Zellen in vivo durch die vorübergehende Überexpression der OKSM-Transkriptionsfaktoren nicht zur nachfolgenden Bildung von Teratomenführt 29. Die Methode, um dies zu erreichen, hängt davon ab, ein hohes Maß an Transkriptionsfaktorexpression im Zielgewebe auf möglichst sichere Weise zu erreichen. In dieser Studie haben wir eine etablierte virusfreie Gentransfertechnologie ausgewählt, die nachweislich effizient auf die Leber abzielt, um Zellen in vivo auf Pluripotenz umzuprogrammieren. Diese Technologie beinhaltet die großvolumige, schnelle hydrodynamische Schwanzveneninjektion (HTV) von Plasmid-DNA30,31. Mit dieser nichtviralen Gentransfermethode können hohe Expressionsniveaus von transfizierten Genen in adulten Hepatozyten erreicht werden. Darüber hinaus minimiert diese Technologie die potenziellen Risiken durch die Verwendung viraler Vektoren (z. B. dauerhafte genomische Insertion, Insertionsmutagenese).

Protokoll

1. In vivo Reprogrammierung von Lebergewebe durch HTV-Verabreichung von pDNA

  1. Lassen Sie weibliche Balb/C-Mäuse, die 6 Wochen alt sind, eine Woche lang an die Tiereinrichtung gewöhnen, bevor ein Eingriff durchgeführt wird.
  2. 0,9 % Kochsalzlösung in destilliertem Wasser zubereiten und durch einen 0,22 μm Mikrofilter filtrieren.
  3. Bereiten Sie eine Lösung mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc-Plasmid-DNA in 1,5 ml 0,9 % Kochsalzlösung pro Maus vor. Anmerkung: Das Gesamtinjektionsvolumen muss zwischen 8-10% des Gesamtkörpergewichts liegen.
    Hinweis: Halten Sie die Mäuse vor der Injektion in einer Heizkammer bei 37 °C, bis die Schwanzvenen leicht sichtbar sind und erweitert erscheinen.
  4. Induzieren Sie eine Anästhesie mit Isofluran vor (in der Heizkammer) und während der Injektion (mit einer Anästhesiemaske).
  5. Verabreichen Sie die pDNA-Lösung oder die Kochsalzlösung mit einer 27-G-Spritze durch HTV-Injektion. Hinweis: Damit die Transfektion erfolgreich ist, sollte das Gesamtvolumen in nicht mehr als 5-7 Sekunden injiziert werden.
  6. Überwachen, ob sich die Tiere ordnungsgemäß von der Injektion erholen.

2. Leberperfusion und Isolierung von primären Hepaktozyten für qRT-PCR-Studien

  1. Zu verschiedenen Zeitpunkten, einschließlich 2, 4, 8, 12 und 24 Tage nach der HTV-Injektion, eine Tiefenanästhesie mit Isofluran einleiten.
  2. Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf den Bauch des Tieres, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt durch die Haut an der ventralen Mittellinie und präparieren Sie die Bauchmuskelschicht, um die Eingeweide freizulegen.
  3. Schneiden Sie mit einer Schere das Zwerchfell ab, um die Brusthöhle freizulegen, und klemmen Sie die Vena cava mit einer Verriegelungszange fest.
  4. Verschieben Sie die Eingeweide nach rechts und die Leberlappen so, dass sowohl die untere Cava als auch die Pfortader leicht zugänglich sind.
  5. Kanülieren Sie die Vena cava inferior mit einem 22 G Katheter und schneiden Sie die Pfortader, um einen Überdruck zu vermeiden.
  6. Beginnen Sie die Perfusion mit 10 ml HBSS-Puffer (Ca2+ und Mg2+ frei, mit Bicarbonat), vorgewärmt auf 37 °C. Perfundieren Sie den Puffer langsam mit einer 10 ml Spritze, bis die Leber weiß wird (3 min).
  7. Die Perfusion mit Liver Digest Medium, vorgewärmt auf 37 °C, bei einer Flussrate von 0,6 ml/min (für 15 min) fortsetzen, bis die Leber anschwillt und sich lockert. Anmerkung: Übermäßige Verdauung und Durchblutung können Hepatozyten oder reprogrammierte Zellen schädigen.
  8. Der Versuch wird bei 4 °C fortgesetzt.
  9. Entfernen Sie die Leber mit einer Pinzette, nachdem Sie die falciformen und koronaren Bänder durchtrennt haben, und waschen Sie sie mit Hepatozytenwaschmedium, während Sie sie durch ein 100 μm Zellsieb führen, um eine Zellsuspension zu erhalten.
  10. Sammeln Sie die Zellsuspension in 50-ml-Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit Hepatozytenwaschmedium auf 15 ml ein.
  11. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 g für 4 min. Halten Sie die Temperatur bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand (der Kupffer- und Epithelzellen enthält) und resuspendieren Sie das Zellpellet (mit den Hepatozyten) in 10 ml Hepatozytenwaschmedium. Anmerkung: Das Zellpellet sollte sehr vorsichtig resuspendiert werden, Hepatozyten sind sehr zerbrechliche Zellen.
  12. Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang insgesamt dreimal und resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 10 ml Hepatozytenwaschmedium.
  13. Schätzen Sie die Zellzahl mit einem optischen Mikroskop und einem Hämozytometer.
  14. Aliquots von 2 x 106 Zellen vorbereiten, bei 300 x g zentrifugieren, um alle Zellen zu gewinnen, und den Überstand verwerfen.
  15. Zu diesem Zeitpunkt kann das Zellpellet eingefroren und bis zur Weiterverarbeitung bei -20 °C aufbewahrt oder direkt für die RNA-Extraktion verwendet werden.

3. Genexpressionsstudie von isolierten Hepatozyten zur Hochregulierung von pluripotenten Genen

  1. Extrahieren Sie RNA aus 2 x 106 Zellen mit einem Spin-Säulen-Kit gemäß den Anweisungen des Lieferanten.
  2. Verwenden Sie 1 μg der extrahierten RNA, um eine zweistufige qRT-PCR gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchzuführen.
  3. Verwenden Sie die Hepatozyten der in Kochsalzlösung injizierten Tiere als Kontrolle, um die relative Genexpression von Reprogrammierungs-, Pluripotenz- und Hepatozytenmarkern zu korrigieren.

4. Durchflusszytometrische Analyse der erhöhten Pluripotenz auf Proteinebene

  1. Führen Sie an den Tagen 1 und 4 nach der Injektion eine Leberperfusion durch und isolieren Sie die primären Hepatozyten wie oben angegeben.
  2. Die Zelldichte auf 1 x 107 Zellen/ml einstellen und 100 μl Aliquots vorbereiten.
  3. Fixieren Sie die Zellen mit BD Cytofix Fixationspuffer und permeabilisieren Sie sie mit 1x BD Perm/Wash Puffer.
  4. Inkubieren Sie die Zellen entweder mit Anti-Maus OCT4-PerCP-Cy5.5 oder Anti-Maus Nanog-PE für 30 Minuten.
  5. Enthalten sind Negativ- und Isotyp-Steuerelemente.
  6. Analysieren Sie die gefärbten Zellen mit dem CyAn ADP Hochleistungs-Durchflusszytometer.

5. Immunfärbung von Leberschnitten auf Marker der Pluripotenz

  1. Vier Tage nach der Injektion perfundieren Sie die Leber wie oben angegeben, jedoch nur mit HBSS-Puffer, um das Blut aus dem Lebergewebe zu entfernen.
  2. Schneiden Sie ein Stück Lebergewebe ab und tauchen Sie es in 2-Methylbutan (vorgekühlt in flüssigem Stickstoff), um mit der Kryosektion fortzufahren.
  3. Gefrorenes Gewebe kann bei -80 °C aufbewahrt oder direkt mit einem Kryostaten in 14 μm dicke Schnitte geschnitten werden.
  4. Trocknen Sie die Gewebeschnitte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur an der Luft und anschließend mit Methanol, vorgekühlt bei -20 °C für 10 min. Trocknen Sie sie 15 Minuten lang an der Luft und waschen Sie die Schnitte dann zweimal mit PBS (jeweils 5 min).
  5. Inkubieren Sie die Schnitte in Blockierungspuffer (5 % Ziegenserum - 0,1 % Triton in PBS pH 7,3) bei Raumtemperatur für 1 Stunde, gefolgt von zwei Waschschritten mit Waschpuffer (1 % BSA - 0,1 % Triton in PBS, pH 7,3).
  6. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte über Nacht bei 4 °C mit Anti-OCT4-, Anti-SOX2- und Anti-Nanog-Primärantikörpern.
  7. Am nächsten Tag waschen Sie die Schnitte 3x (je 5 min) mit Waschpuffer und inkubieren Sie sie für 1,5 h bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper.
  8. Leberschnitte mit PBS waschen (3x, je 5 min) und in DAPI und Antifade-haltiges Medium einbetten.
  9. Visualisieren Sie die Objektträger unter einem Epifluoreszenzmikroskop.

6. Färbung von Lebergewebeschnitten durch alkalische Phosphatase (ALP)

  1. Entnehmen Sie Lebergewebeschnitte wie oben beschrieben.
  2. Erwärmen Sie die Gewebeschnitte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Färbung durchführen.
  3. Fixieren Sie mit 4% Paraformaldehyd für 2 Minuten. Hinweis: Eine übermäßige Fixierzeit kann die ALP-Aktivität verringern.
  4. Trocknen Sie die Schnitte 30 Minuten lang an der Luft und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang mit flüssigem BCIP/NBT-Substrat bei 37 °C.
  5. Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser und montieren Sie sie mit wässrigen Eindeckmedien.
  6. Nehmen Sie zufällige Bilder durch Lichtmikroskopie auf.

7. Quantifizierung von Albumin- und Leberenzymspiegeln im Serum zur Beurteilung der Lebertoxizität

  1. Entnehmen Sie an den Tagen 4, 8, 12 und 120 nach der Transfektion 300 μl Blut direkt aus dem Herzventrikel.
  2. Halten Sie das Blut auf Eis, während die verschiedenen Proben entnommen werden, um eine Gerinnung zu vermeiden.
  3. Sobald alle Proben fertig sind, 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis das Blut gerinnt.
  4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 x g für 5 min.
  5. Das Serum (im Überstand) vorsichtig in ein neues Eppendorf-Röhrchen pipettieren und bis zur Verarbeitung der Proben bei -80 °C einfrieren.
  6. Analysieren Sie die Serumspiegel auf Albumin, ALT, AST, ALP und GLDH.

8. Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und periodische Säure-Schiff (PAS)-Färbung von Leberschnitten zur Beurteilung der Lebertoxizität

  1. Zu verschiedenen Zeitpunkten, einschließlich 2, 4, 8, 12, 24, 50 und 120 Tage nach der HTV-Injektion, führen Sie die Leberperfusion mit HBSS-Puffer nur wie zuvor beschrieben durch.
  2. Schneiden Sie ein Stück Lebergewebe ab und fixieren Sie es mit 4% Paraformaldehyd.
  3. Lebergewebe in Paraffinblöcke einbetten, schneiden und färben Sie entweder mit H&E- oder PAS-Färbung.
  4. Nehmen Sie zufällige Bilder durch Lichtmikroskopie auf.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über das Verfahren, das die Genübertragung von OKSM-kodierenden Plasmiden in die Leber von Mäusen und die verschiedenen Techniken zur Beobachtung der in vivo-Zellreprogrammierung umfasst. Nach der HTV-Injektion der Plasmide wurde am zweiten Tag nach der Injektion ein signifikanter Anstieg der Genexpression der transfizierten Reprogrammierungsfaktoren (Oct3/4, Sox2, Klf4 und cMyc) auf mRNA-Ebene beobachtet. Die Expression dieser Faktoren nimmt im Verlauf der Zeit nach der Injektion ab, wie in Abbildung 2a dargestellt. Hinsichtlich der Expression endogener Pluripotenzmarker (Nanog, Ecat1 und Rex1) waren ihre Spiegel im Vergleich zu Hepatozyten von mit Kochsalzlösung behandelten Tieren am zweiten und vierten Tag nach der Injektion signifikant erhöht und kehrten ab dem achten Tag wieder auf Ausgangswerte zurück (Abbildung 2b). Gleichzeitig wurde die Dedifferenzierung der Hepatozytenpopulation durch die Herabregulation hepatocyten-spezifischer Gene (Alb, Aat und Trf) bestätigt, was am vierten Tag statistisch signifikant war und ab dem achten Tag wieder Ausgangswerte erreichte (Abbildung 2d).

Die Expression von Oct3/4 und Nanog auf Proteinebene wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie in Abbildung 2c gezeigt, wird nur Oct3/4 am Tag 1 nach HTV-Injektion exprimiert, während für die Expression des endogenen Pluripotenzmarkers Nanog bis zum Tag 4 gewartet werden musste.

Das Vorkommen einer in vivo-Zellreprogrammierung wurde weiterhin durch immunhistochemische Analyse von Lebergeweben mit Anti-OCT4-, Anti-SOX2- und Anti-Nanog-Antikörpern sowie durch spezifische Färbung der ALP-Aktivität bestätigt. Positive Zellen für alle Marker und die enzymatische Aktivität werden reproduzierbar in den Lebergeweben von OKSM-injizierten Tieren, jedoch nicht in den Kontrollen mit Salzlösungsinjektion gefunden (Abbildung 3).

Die möglichen toxischen Nebenwirkungen und die Teratombildung durch eine in vivo-Zellreprogrammierung mittels HTV-Injektion von pDNA wurden durch die Quantifizierung der Leberenzymwerte im Serum sowie durch H&E- und PAS-Färbung von Lebergewebeschnitten über einen Zeitraum von 120 Tagen untersucht. Vorübergehende und nicht schwere Anzeichen von Gewebeschäden wurden bis zum Tag 2 beobachtet, danach jedoch nicht mehr. Während des gesamten Untersuchungszeitraums wurden keine Teratombildung oder Hinweise auf Dysplasie oder morphologische Veränderungen festgestellt (Abbildung 4). Es traten keine hepatischen strukturellen oder funktionellen Auffälligkeiten bei einem der Tiere während der Studie auf, was durch Albumin- und Leberenzymwerte sowie die Glykogenfärbung der Gewebeschnitte bestätigt wurde (Abbildungen 4b und c).

Injektion von Faktoren zur In-vivo-Umprogrammierung, Mäusediagramm, Plasmid, Gewebeanalyse, PCR, Zytometrie.
Abbildung 1. Übersichtsschema des in-vivo-Umprogrammierungsverfahrens und dessen Analyse. Das Protokoll umfasst zwei Hauptphasen: (i) die Applikation von Umprogrammierungsfaktoren in vivo und (ii) die Gewebeentnahme sowie die Probenanalyse. Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Analyse der Genexpression; Balkendiagramme mit relativen Expressionsergebnissen über Tage; Abbildungen a-d; wissenschaftliche Ergebnisse.
Abbildung 2. In-vivo-Überexpression der Yamanaka-Transkriptionsfaktoren in der Leber erwachsener Mäuse. Balb/C-Mäuse erhielten eine HTV-Injektion mit 0,9 %iger Kochsalzlösung allein oder mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc in 0,9 %iger Kochsalzlösung. An den Tagen 2, 4, 8, 12 und 24 wurde eine RT-qPCR-Analyse von Hepatozyten durchgeführt, um die relative Genexpression von: (a) transfizierten Transkriptionsfaktoren (OKSM) und (b) endogenen Pluripotenzmarkern zu bestimmen; (c) Durchflusszytometrie-Analyse von OCT3/4-positiven und Nanog-positiven Zellen; (d) relative Genexpression von Hepatozytenmarkern, wie mittels RT-qPCR ermittelt. Alle Genexpressionswerte wurden auf die Gruppe mit Kochsalzlösung-HTV-Injektion normalisiert. (* p<0,05 zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung HTV-injizierten Gruppen an, ermittelt durch Varianzanalyse und Tukey’s paarweisen Vergleich). Abbildung modifiziert nach Yilmazer et al.29 Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Vergleich der Immunfluoreszenzmikroskopie von OCT4, SOX2, NANOG in Saline- versus OKSM-behandelten Zellen.
Abbildung 3. In-vivo-Zellreprogrammierung an erwachsenem Mauslebergewebe mittels Immunhistochemie. Balb/C-Mäuse wurden mittels HTV mit alleiniger 0,9%iger Saline oder mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc in 0,9%iger Saline injiziert. Am Tag 4 wurden die Lebern entnommen, und gefrorene Gewebeschnitte wurden mit Anti-OCT4-, Anti-SOX2- oder Anti-Nanog-Antikörpern zur Beurteilung der Immunreaktivität oder mit BCIP/NBT zur Bestimmung der ALP-Aktivität im Gewebe (40X) gefärbt. Maßstabsbalken entsprechen 100 μm. Abbildung modifiziert nach Yilmazer et al.29 Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Leberhistologie, Enzymspiegel und Albumin bei Behandlung mit Kochsalzlösung im Vergleich zu OKSM, Versuchsergebnisse.
Abbildung 4. Die Wirkung einer in vivo-Zellreprogrammierung auf die Leberfunktion und Histopathologie. Balb/C-Mäuse wurden mittels HTV entweder mit 75 μg pCX-OKS-2A und 75 μg pCX-cMyc in 0,9%iger Kochsalzlösung oder allein mit 0,9%iger Kochsalzlösung injiziert. An den Tagen 2, 4, 8, 12, 50 und 120 wurden Lebergewebe und Serum isoliert und analysiert hinsichtlich: (a) H&E-Färbung; (b) Spiegel der Leberenzyme; (c) Spiegel von Albumin; (d) PAS-Färbung. Repräsentative Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie (10X) aufgenommen. Maßstabsbalken entsprechen 100 μm. Abbildung modifiziert nach Yilmazer et al.29 Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen.

Diskussion

Diese Studie liefert einen prinzipiellen Beweis für die in vivo Zellreprogrammierung in Richtung Pluripotenz nach dem effizienten Transfer und der Überexpression der OKSM-Faktoren auf die adulte Mausleber. Mit Hilfe verschiedener Techniken wie qRT-PCR, Durchflusszytometrie, IHC oder Serumanalyse wurde das Zielgewebe untersucht, um in vivo die Zellreprogrammierung zu beobachten. Sehr schnell nach der Induktion der OKSM-Faktor-Überexpression im Gewebe wurden die Pluripotenzmarker auf mRNA- und Proteinebene (innerhalb von 48 Stunden) hochreguliert. Während dieser Experimente wurde gezeigt, dass zwischen 5 und 15 % der aus dem Gewebe extrahierten Zellen Nanog- und Oct3/4-positiv waren. Darüber hinaus wurden während der gesamten 120 Tage keine strukturellen oder funktionellen Anomalien in der Leber beobachtet. Die Expression von Transgenen durch HTV-Injektion von Plasmid-DNA in anderen Geweben als der Leber (Lunge, Milz, Niere und Herz) wurde bereits früher berichtet, jedoch waren die Genexpressionsniveaus mindestens 3 Größenordnungen niedriger als die in Hepatozyten30. Die Daten in dieser Studie deuten darauf hin, dass die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo in einen pluripotenten Zustand sicher, schnell und effizient ist. In Anbetracht der Mehrzahl der bestehenden in vitro Zellreprogrammierungsmethoden, die in der Regel eine pluripotente (iPS) Zellgenerierung innerhalb von 3 Wochen mit weniger als 1 % der Effizienz erreichen32, kann die in vivo Reprogrammierung auf Pluripotenz sehr interessante Alternativen bieten. Wir stellen die Hypothese auf, dass das Konzept der in vivo Reprogrammierung zur Pluripotenz auf verschiedene Arten von somatischen Zellen mit hoher Effizienz angewendet werden könnte (abhängig vom verwendeten Vektor), jedoch muss das Niveau der funktionellen Pluripotenz, das in den in vivo reprogrammierten Zellen erreicht wird, bestimmt werden. Darüber hinaus könnten mit der Entwicklung verbesserter Protokolle und Technologien in vivo reprogrammierte Zellen potenziell extrahiert und für Zwecke der regenerativen Medizin verwendet werden.

Es gibt einige kritische Schritte, die zu befolgen sind, um adulte, somatische Zellen in vivo mit hoher Effizienz umzuprogrammieren. Das Erreichen einer hohen Genexpression im Zielgewebe ist Voraussetzung. In dieser Studie wurde dies anhand des effizienten Transfers und der Expression von Plasmid-DNA zu Hepatozyten mittels HTV-Injektion veranschaulicht. Die wichtigsten Faktoren für die HTV-Injektion sind das Volumen, das zwischen 8-10% des Gesamtkörpergewichts des Tieres liegen sollte, und die Geschwindigkeit der Injektion, die innerhalb von 5-7 Sekunden durchgeführt werden muss. Mäuse, die jünger als 6 Wochen sind, sollten nicht verwendet werden, da die HTV-Injektion mehr Gewebeschäden in der Leber verursachen kann, was die Effizienz der zellulären Reprogrammierung beeinträchtigen kann. Der genetische Hintergrund der Tiere hatte keinen Einfluss auf die Wirksamkeit der in vivo-Reprogrammierung, da wir zuvor über ähnliche Reprogrammierungsniveaus sowohl bei Balb/C- als auch bei TNG-A-Mäusen berichtet haben, wobei es sich bei letzterem um einen transgenen Stamm handelt, der den eGFP-Reporter trägt, der in den Nanog-Locus eingefügt ist und auf dem Sv129-Hintergrund gezüchtet wurde29.

Wir spekulieren, dass die in vivo Zellreprogrammierung in einen pluripotenten Zustand (der bestimmt werden muss) auf andere Gewebetypen angewendet werden kann, vorausgesetzt, die OKSM-Faktoren werden effizient an die Zielzellen abgegeben, was ein hohes Maß an Genexpression ermöglicht. In präklinischen und klinischen Studien wurde eine Vielzahl von nichtviralen und viralen Genverabreichungsvektoren untersucht, um auf verschiedene Zell- und Gewebetypen abzuzielen33. Zum Beispiel waren Adeno-assoziierte Viren für neuronales oder okuläres Gewebe die bevorzugte Vektorwahl für einen effizienten in vivo Gentransfer34-37, während in Muskelgewebe gezeigt wurde, dass nackte Plasmid-DNA-Injektionen zu einer relativ hohen Genexpression führen38,39. Daher sollte die Methode des Gentransfervektors in Abhängigkeit vom Gewebetyp sorgfältig ausgewählt werden, um eine effiziente und schnelle in vivo Zellreprogrammierung in einen pluripotenten Zustand zu erreichen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise vom Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Swindon, Vereinigtes Königreich) und den FP-7-Programmen der Europäischen Kommission NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) und ANTICARB (HEALTH-2008-20157) unterstützt. AY wurde durch ein Vollzeit-Promotionsstipendium des Bildungsministeriums (Türkei) unterstützt, und IL bedankt sich für eine teilweise Unterstützung durch den British Council und die CAIXA Foundation (Spanien). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pCX-OKS-2A pDNAAddgen19771Gewonnen aus Addgene als bakterieller Stab, Plasmidproduktion in der Plasmidfabrik (Deutschland)
pCX-cMycAddgene19772Gewonnen aus Addgene als bakterieller Stab, Plasmidproduktion in der Plasmidfabrik (Deutschland)
0,22 μ m FilterMillioporeSLGP033RS
IsofluranAbbottB505
HBSS PufferSigma-AldrichH6648Ca2+ und Mg2+ frei, mit Bicarbonat
LeberverdaumediumGibco17703-034
HepatozytenwaschmediumGibco17704-024
100 & My; m cell strainerBD Biosciences352360
Nucleospin RNA II kitMacherey-Nagel740955.25Kit für die RNA-Isolierung aus Zellen und Geweben
iScript cDNA-SynthesekitBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 Forward PrimerSigma Sequenzin Kommentaren angegebenTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Okt3/4 Reverse-PrimerSigma-Sequenzin KommentarenCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC
Sox2-VorwärtsprimerSigma-Sequenzin KommentarenGGTTACCTCTCCCCCCCCCAG
Sox2-Reverse-PrimerSigma-Sequenzin Kommentaren TCACATGTGTGCGACAGGCAG
C-myc-VorwärtsprimerSigma-Sequenzin KommentarenCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc-Reverse-PrimerSigma-Sequenzin KommentarenTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog-VorwärtsprimerSigma-Sequenzin KommentarenCAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog-Reverse-Primer-Sigma-Sequenzin KommentarenGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1-VorwärtsprimerSigma-Sequenz in Kommentaren angegebenTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 Reverse-PrimerSigma-Sequenzin Kommentaren angegebenATGGGCCGCCATACGACGACGACGCTCAACT
Rex1 VorwärtsprimerSigma-Sequenzin Kommentarengegeben ACGAGTGGCAGTTTTTCTTCTTGGGA
Rex1 Reverse-PrimerSigma-Sequenzin Kommentarenangegeben TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb VorwärtsprimerSigmain den Kommentaren angegebene SequenzGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb umgekehrter PrimerSigma-Sequenzin den KommentarenCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat VorwärtsprimerSigma-Sequenzin den KommentarenCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat umgekehrter PrimerSigma-Sequenzin den KommentarenATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf vorwärts PrimerSigmain den Kommentaren angegebene SequenzACCATGTTGTGGTGTCTCACGA
Trf reversePrimer Sigma-Sequenzin den KommentarenACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B Aktin-VorwärtsprimerSigma-Sequenzin den KommentarenGACCTCTATGCCAACACAGT
B Aktin-reverser PrimerSigma-Sequenzin den Kommentaren angegebenAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix-FixierungspufferBD Biosciences
1x BD Perm/Wash PufferBD Biosciences560585
Anti-Maus OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
Anti-Maus Nanog-PEBD Biosciences560585
2-MethylbutanSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
ZiegenserumSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
Kaninchen pAb anti-OCT4Abcamab19857Anwendung in einer Konzentration von 3 μm; g/ml
Kaninchen pAb anti-SOX2Abcamab97959In einer Konzentration von 1 μm verwenden g/ml
Kaninchen pAb anti-NanogAbcamab80892Anwendung in einer Konzentration von 1 μm; g/ml
Maus mAb anti-SSEA1Abcamab16285Anwendung in einer Konzentration von 20 μm; g/ml
Ziegen-pAb Anti-Kaninchen-IgG, markiert mit Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRAnwendung in einer Konzentration von 1/250
Ziegen-pAb-Anti-Maus-IgG, markiert mit Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-165-003-JIRVerwendung in einer Konzentration von 1/250
VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT flüssiges SubstratsystemSigmaB1911
Wässriges EindeckmediumSigma
16% ParaformaldehydFisherAA433689MStammlösung beträgt 16%, verwenden Sie es bei 4
Hämatoxylin und EosinSigmaGH53/HT110216 PAS-Färbung
Sigma395B
, 560585, %

Referenzen

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