Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Zusammenfassung

Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Zusammenfassung

Die Faltung und Assemblierung von Proteinen ist essentiell für die Proteinfunktion, die langfristige Gesundheit der Zelle und die Langlebigkeit des Organismus. Historisch gesehen wurde die Funktion und Regulation der Proteinfaltung in vitro, in isolierten Gewebekulturzellen und in einzelligen Organismen untersucht. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Proteinhomöostase (Proteostase), Stoffwechsel, Entwicklung, Alterung und Temperaturwahrnehmung aufgedeckt. Diese Erkenntnisse führten zur Entwicklung neuer Werkzeuge zur Überwachung der Proteinfaltung im Modellmetazoen-Organismus Caenorhabditis elegans. In unserem Labor kombinieren wir Verhaltensassays, bildgebende Verfahren und biochemische Ansätze mit temperaturempfindlichen oder natürlich vorkommenden metastabilen Proteinen als Sensoren der Faltungsumgebung, um die Fehlfaltung von Proteinen zu überwachen. Verhaltensassays, die mit der Fehlfaltung eines bestimmten Proteins in Verbindung gebracht werden, liefern eine einfache und aussagekräftige Auslesung für die Proteinfaltung und ermöglichen ein schnelles Screening von Genen und Bedingungen, die die Faltung modulieren. Ebenso kann eine solche Fehlfaltung mit einer Fehllokalisierung von Proteinen in der Zelle verbunden sein. Die Überwachung der Proteinlokalisierung kann daher Veränderungen der zellulären Faltungskapazität aufzeigen, die in verschiedenen Geweben, in verschiedenen Entwicklungsstadien und angesichts sich ändernder Bedingungen auftreten. Schließlich können wir mit biochemischen Werkzeugen ex vivo die Stabilität und Konformation von Proteinen direkt überwachen. Durch die Kombination von Verhaltensassays, Bildgebung und biochemischen Techniken sind wir in der Lage, die Fehlfaltung von Proteinen mit der Auflösung des Organismus, der Zelle bzw. des Proteins zu überwachen.

Einleitung

Das Zusammenspiel der verschiedenen Schritte der Proteinbiosynthese, wie z.B. mRNA-Transkription, -Verarbeitung und -Translation, sowie Proteinfaltung, Translokation und Assemblierung/Demontage, bestimmt die Belastung metastabiler Proteine, die für ihre Funktion von den zellulären Proteinqualitätskontrollmechanismen abhängen¹. Das Fehlen oder die Fehlfunktion von Maschinerien zur Proteinqualitätskontrolle kann daher zum funktionellen Verfall verschiedener Arten von zellulären Maschinerien und zum Auftreten von Krankheiten der Proteinfehlfaltung führen^2-7. Wenn die Kapazität der Proteinfaltungs- und Clearance-Maschinerie mit der Belastung metastab....

Protokoll

Verwendung von Verhaltensassays zur Überwachung der Proteinfaltung in einem lebenden Organismus

1. Synchronisieren von Tieren für Verhaltenstests

1. Befolgen Sie die Standardmethoden für die Pflege von C. elegans³⁶, einschließlich der Vorbereitung von Medien und Platten, der Futterzubereitung und der Wachstumsbedingungen der Tiere. Kontrollieren Sie die Anbaubedingungen sorgfältig, einschließlich der Temperatur (15-25 °C), der Populationsgröße und der Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln. Entsorgen Sie alle Platten, die bakteriell oder pilzlich kontaminiert sind.
2. Entnehmen Sie 15-30 Embryonen, übert....

Ergebnisse

Eine beeinträchtigte Faltungsumgebung kann zu Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen führen. Eine Fehlfaltung von Proteinen ist mit einer veränderten Konformation verbunden und führt zu einem Verlust der Proteinfunktion. Wir verwenden komplementäre Ansätze, um die Proteinfaltung und -funktion in intakten Tieren, spezifischen Zellen und Proteinextrakten zu überwachen. Eine intelligente Wahl des Faltungssensors, die auf starken Verhaltens- und zellulären Phänotypen basiert, die mit einer bekannten destabilisierenden Mut.......

Diskussion

Sonden der zellulären Proteostasekapazität müssen hochempfindlich auf Veränderungen in der Faltungsumgebung reagieren und leicht zu überwachen sein, um eine Echtzeitbewertung der Qualitätskontrolle der Proteinfaltung zu ermöglichen. Mit metastabilen Proteinen als Sonden für die Proteostasekapazität überwachten wir Veränderungen des Phänotyps, der subzellulären Proteinlokalisation und der Proteinkonformation. Die hier vorgestellten Protokolle konzentrieren sich auf Muskelprotein-assoziierte Phänotypen, einschließlich Moti.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikörper-Staning und Fiaxtion	Paraformaldehyd	Merc	8187151000
Tween-20	Bio-Rad	1706531
Collagenase		Sigma C5138-100MG
DABCO	Merc	8034560100
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
β -ME	Sigma	8057400250
BSA	Di Cam	000-40-100
Partielle Zusammenfassung	Chymotrypsin	Sigma	C4129-250MG
Thermobeständig	SYTOX Orange	Invitrogen	S11368
Cholesterin	Amaresco	0433-250G
AUSRÜSTUNG
M165 FC Fluoreszenzstereoskop	Leica		TXR Filter
EXi Blaue Fluoreszenzmikroskopie Kamera	QImaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META Konfokalmikroskop	Zeiss
Pellet-Stößel	Sigma	Z359947-100EA
Pellet-Stößel Akku-Motor	Kontes	K749540-0000
MicroCL 17 Mikrozentrifuge Serie	Thermo	75002455	gekühlt, 230 V 50/60 Hz, inklusive 24x 1,5/2,0 ml Rotor mit ClickSeal Biocontainment-Deckel