Eine standardisierte Maus-Modell der Subarachnoidalblutung durch intraluminale Kreis von Willis Perforation beschrieben. Schiff Perforation und Subarachnoidalblutung durch intrakranielle Drucküberwachung überwacht. Neben verschiedenen Vitalparameter erfasst und gesteuert werden, um physiologische Bedingungen aufrecht zu erhalten.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In diesem Video-Veröffentlichung eine standardisierte Maus-Modell der Subarachnoidalblutung (SAB) wird vorgestellt. Blutung wird durch endovaskuläre Kreis von Willis Perforation (CWP) induziert und durch Hirndruck (ICP) Überwachung bewährt. Dadurch wird eine homogene Verteilung im Blut Liquorräume um den arteriellen Kreislauf-und Kleinhirnrisse erreicht. Körpertemperatur, den systemischen Blutdruck, Herzfrequenz, und Hämoglobinsättigung: Tierphysiologie wird durch Intubation, Beatmung und kontinuierliche Online-Überwachung von verschiedenen physiologischen und Herz-Kreislauf-Parameter gepflegt. Dadurch wird die Hirndurchblutung Druck kann genau überwacht werden, was zu einem weniger variablen Volumen von ausgetretenen Blutes. Dies ermöglicht eine bessere Standardisierung der endovaskulären Filament Perforation in Mäusen und macht das ganze Modell sehr gut reproduzierbar. So ist es für pharmakologische und pathophysiologische Studien in Wildtyp-und genetisch leicht verfügbarly veränderten Mäusen.
Einleitung
SAH ist die Schlaganfall-Subtyp mit der geringsten positiven Auswirkungen für den Patienten: 40% der Patienten sterben innerhalb eines Monats nach der Blutung ein und Überlebende haben nur selten eine klinisch positiven Ergebnis.
Die große Mehrheit der spontanen sahs (80%) werden durch Ruptur der intrakraniellen Aneurysmen, die meist entlang der vorderen und hinteren Kommunikation Arterie, die A. basilaris und A. cerebri media (MCA) 2 befinden verursacht.
Solche Aneurysmen sind schwierig in Tieren zu modellieren und damit Tiermodellen von SAH werden entweder durch Injektion von Blut in den Subarachnoidalraum / Hirnkammern oder durch endovaskuläre Perforation einer subarachnoidalen Gefäß durchgeführt.
Eigenblutinjektion in die Cisterna magna ist einfach durchzuführen und reproduzierbarer als das Blutvolumen kann direkt gesteuert werden 3. Leider sind einige Aspekte der Pathophysiologie SAH, z. B. dieGefäßverletzung, können mit diesem Verfahren nicht modelliert werden. Ein anderer technischer Ansatz für die Induktion von SAH ist die Eröffnung einer Vene intracisternal 4.
, Die intraluminale CWP an der MCA Zweig scheint jedoch das Verfahren, dass die Modelle die Pathophysiologie des Menschen am engsten 5 sein. Die Methode wurde von Bederson und Kollegen und gleichzeitig durch Veelken 6,7 und Kollegen entwickelt und zuerst in Ratten beschrieben. Später wurde die intraluminale Perforation Modell mit Mäusen 8,9 angepasst. Ein Faden wird in der A. carotis externa (ECA) eingeführt und zur Schädelbasis über die Arteria carotis interna (ICA). An der Verzweigungsstelle des MCA perforiert das Filament das Schiff und induziert eine Blutung in den Subarachnoidalraum an der Schädelbasis. Das Blut verteilt dann in den verbleibenden Subarachnoidalraum entlang Spalten und Blutgefäße. Blutungen durch Gerinnselbildung an der Stelle der Perforation aufgehört, aber rebleedings, whICH sind häufig bei Patienten 10, auftreten kann schädlich. Entsprechend wurde die endovaskuläre Filament Modell ein weit verbreitetes Modell SAH in den letzten Jahren. Der am häufigsten genannte Nachteil des Filaments Perforation Modell ist, dass Blutungen Volumen kann nicht direkt gesteuert werden, und können daher variabel sein. Diese Variabilität kann durch strenge Kontrolle der Tierphysiologie und Post-hämorrhagischen ICP deutlich reduziert werden.
Mäuse haben den großen Vorteil, dass eine große Anzahl von genetisch veränderten Stämme sind verfügbar. Aufgrund ihrer geringen Größe chirurgischen Verfahren neigen jedoch dazu, komplexer zu sein als in größeren Spezies, zB Ratten oder Kaninchen. Deshalb ist die Verkleinerung von Techniken für die Ratten, Mäuse entwickelten oft nicht zu den gewünschten Ergebnissen, zB als Mäuse haben eine sehr begrenzte Körpergewicht und Blutvolumen nicht-invasive Techniken zur Blutdruck-und Blutgasanalyse sowie für die Hämoglobinsättigung und der Herzfrequenz führenmüssen angewendet werden, wann immer möglich. Dementsprechend ist das Ziel der aktuellen Publikation, um den Faden Perforation Modell für SAH in Mäusen beschreiben und zu zeigen, wie dieses Modell in einer standardisierten und hoch reproduzierbare Art und Weise durchgeführt werden.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle chirurgischen Verfahren wurden die ethischen Überprüfung unterzogen und von der Regierung von Oberbayern (Referenznummer: 55.2-1-54-2532.3-13-13 und -2532-136-11) zugelassen. Tiere sind männliche C57BL / 6 Mäuse mit einem Körpergewicht von etwa 25 g auf.
1. Vorbereitung der Tiere
- Induzieren Anästhesie, indem Sie die Maus in eine Kammer. Spülen Sie die Kammer mit 5% Isofluran, bis das Tier das Bewusstsein verliert.
- Injizieren vorgemischten Narkose intraperitoneal: Fentanyl (0,05 mg / kg), Midazolam (5 mg / kg) und Medetomidin (0,5 mg / kg). Überprüfen Reflexe vor und während des Verfahrens regelmäßig. Reinjizierst ein Drittel der ursprünglichen Menge Stunden Anästhesie erhalten.
- Intubieren orotracheal mit einem Rohr aus einem Katheter 20 G 11 vorgenommen. Für Intubation beheben Sie das Tier auf einer schrägen Plattform (30 °), die Zunge zurückziehen mit gebogenen Pinzette, visualisieren die Stimmbänder unter einem Operationsmikroskop und stecken Sie den Schlauch in die Luftröhrewährend der Inspiration.
- Platzieren Sie die Maus in Bauchlage und die korrekte Platzierung der Röhrchen mit einem Stück Baumwolle oder einem microcapnograph.
- Schließen Sie das Intubationstubus an die Atemschutzmaske. Lüften Sie die Maus mit Raumluft mit 25% Sauerstoff, ergänzt mit einer Frequenz von 180 bis 220 Atemzüge / min und einem Schlagvolumen von 200-250 ul.
- Schließen Sie das Intubationstubus auf die microcapnograph. Pflegen Sie die endexspiratorischen pCO 2 bei 30 mmHg durch Anpassung der Beatmungsfrequenz.
- Legen Sie eine rektale Temperatursonde und legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, um die 37 ° C Körperkerntemperatur aufrecht zu erhalten.
- Tragen Sie die Ring Pulsoximeter Sensor an der rechten Hinterpfote.
- Öffnen Sie die Haut über dem Schädel mit einer Schere. Der Schnitt sollte etwa 0,5 cm lang und zwischen Ohr und Auge.
- Präparieren Sie die linke Schläfenmuskel mit einem Skalpell aus dem Schläfenbein.
- Kleben Sie die Laser-Doppler-Durchflussmesser (LDF) Sonde aufder linke Schläfenbein. Halten der Sonde in einer festen Position, bis der Kleber aushärtet.
- Bohren Sie ein Loch von ca. 1,5 mm Durchmesser mit einem Zahnbohrer in den linken Schläfenbein. Kühlen Sie die Knochen mit Kochsalzlösung, um Hitzeschäden zu vermeiden.
- Legen Sie die ICP-Sonde in die Schädelhöhle. Schieben nach vorn dorsal wie möglich zu Hirngewebeschäden und Blutungen zu verhindern.
- Wenn die Sonde an der richtigen Position, zu beheben, und verschließen Sie diese mit Zement. Lassen Sie den Zement trocken für 5 min.
- Drehen Sie die Maus vorsichtig zu einer Rückenlage.
- Für kontinuierliche Blutdrucküberwachung, Katheterisierung der linken Oberschenkelarterie.
- Verbinden Sie den Katheter mit dem Oberschenkelblutdrucküberwachungsgerät.
2. SAH Induktions
- Öffnen Sie die Haut mit einer Schere vom Brustbein bis zum Kinn (2 cm). Präparieren Sie die Bindegewebe unverblümt und drücken Sie die Speicheldrüsen beiseite.
- Setzen Sie die linke A. carotis communis (CCA) und mobilisieren sie. Preserve dieVagusnerv, die in der gleichen Bindegewebe als CCA läuft. Bewegen Schädel und entlarven und zu mobilisieren, die ICA und den Rechnungshof mit der gleichen Technik.
- Ligieren des ECA so weit kranial wie möglich.
- Vereinbaren zwei weitere Ligationen für das Filament auf der ECA.
- Verschließen Sie die CCA und der ICA vorübergehend mit microclips. Positionieren Sie die microclips mit einem Mikroclip Applikator. Stellen Sie sicher, die Clips richtig durch leichtes Ziehen sie wieder angewendet.
- Schneiden Sie ein Loch für das Filament Einsetzen in den ECA mit einem Schiff Schere.
- Legen Sie eine Prolene 5-0 Faden mit 12 mm Länge in den ECA.
- Schließen Sie die Einstichstelle mit einem verabredeten Ligation.
- Entfernen Sie die microclips mit einem Mikroclip-Applikator von der CCA und der ICA.
- Schieben Sie den Faden mit einer Pinzette in die ICA, bis der ICP steigt. Ein plötzlicher Anstieg des ICP zeigt Blutungen Induktion.
- Ziehen Sie den Faden sofort abzubinden und die ECA durch Schließen sowohl prearranged Liga nacheinander. Dies verhindert ein Ausbluten der Insertionsstelle.
- Naht der Hautwunde.
- Überwachen Sie die physiologischen Parameter des Tieres für weitere 20 min.
- ICP entfernen und LDF-Sonden und Naht der Hautwunde.
3. Ende des Experiments
- Perfusion des Tieres transkardial mit 20 ml Kochsalzlösung (Raumtemperatur), gefolgt von 20 ml von 4% PFA in PBS (4 ° C).
- Präparieren Sie das Gehirn aus dem Schädel. Schneiden Sie die Schädel in der Mittellinie und zwischen den Augenhöhlen. Dann ziehen die Knochen aus dem Gehirn.
- Bewerten Sie die Blutverteilung im Subarachnoidalraum.
4. Überlegungen in der Sache des Überlebens Chirurgie (nicht im Video gezeigt)
- Inject Carprofen (4 mg / kg subkutan) für die postoperative Analgesie direkt nach Narkoseeinleitung. Während der postoperativen Beobachtungszeitraum Carprofen (4 mg / kg subkutan) wird alle 24 Std.
- Statt invasive Blutdruckmessung nutzen eine nicht-invasive Blutdrucküberwachungssystem.
- Zur Beendigung der Narkose inject Antagonisierung Mittel subkutan Naloxon (1,2 mg / kg), Flumazenil (0,5 mg / kg) und Atipamezol (2,5 mg / kg).
- Extubiert das Tier.
- Nach Wiedererlangung der Reflexe legte das Tier in einen vorgeheizten Kammer. Halten des Tieres bei etwa 32 ° C für 24 Stunden.
- Tiere werden regelmäßig auf Spontanatmung und deren Allgemeinzustand in den ersten Stunden nach der Operation überprüft. Wenn der Hirnstamm betroffenen Tiere haben Probleme mit der Atmung und sollte eingeschläfert werden.
- Die Tiere werden täglich für ihre Allgemeinzustand und das Körpergewicht als auch für neurologische und sensorische Defizite 15 überprüft.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Sterblichkeit
Sobald die Operationstechnik beherrscht das Verfahren nicht zu entlocken jede intraoperative Mortalität. Auch Blutungen in nahezu allen Tieren erreicht werden. Die postoperative Mortalität ist mit 30-40% die meisten Tiere sterben am Tag 1 nach der Operation (Abbildung 5).
ICP-Werte nach SAB
Die ICP-Blutungen vor etwa 4 mmHg. Blutende Ergebnisse in einem starken Anstieg des ICP bis zu 120 mmHg. ICP-Werte dann s...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Behandlungsmöglichkeiten nach SAB sind knapp und meist unwirksam. Deshalb ist die Pathophysiologie der post hämorrhagischen Hirnschäden muss, um neue therapeutische Ziele zu identifizieren und zu entwickeln neue therapeutische Ansätze weiter zu verstehen. Standardisierte und reproduzierbare Tiermodellen auch in gentechnisch veränderten Tieren, also Mäuse, sind entscheidend für solche Untersuchungen. Der CWP-Modell hat sich ein weit verbreitetes Modell für SAH, wie es ähnelt der Pathophysiologie des Menschen eng...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die aktuelle Forschung wird von der Solorz-Zak-Forschungsstiftung gefördert.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ausrüstung | |||
| Operationsmikroskop | Leica | KL2500 | |
| Isofluran-Verdampfer | Harvard | Instruments Continuous Flow Vaporizer | |
| Beatmungsgerät | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| Mikrokapnograph | Hugo Sachs | Typ 340 | |
| Temperaturregler | FHC | DC Temperaturregler | |
| Dentalbohrer | Paggen | Labset- N | |
| ICP-Monitor | Codman | ICP-Monitor | |
| Blutdruckmessgerät | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| Spritzenpumpe | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| Pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analoger Datenmonitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement für die ICP-Sondenfixierung | Speiko | Carboxylat-Zementkleber | |
| für die LDF-Sondenfixierung | Bob Smith Industries | Cyanacrylat-Kleber (Maxi Cure und Insta Set) | |
| Venenkatheter | Johnson | Johnson Jelco Flügelkatheter i.v.; REF 4076 | modifizierter Intubationsschlauch |
| für Femurkatheter | Smiths Medical | Fine Bore Polyethylene Tubing; Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm; REF 800/100/100 | geschnittenes Filament auf 30 cm Länge |
| für die Gefäßperforation | Ethicon | Prolene 5-0 | geschnitten auf 12 mm Länge |
| chirurgische | Geräte Fine Scientific Instruments | Pinzette medical #5, Gefäßschere 8 cm, Mikroclip 4 mm Kiefer |
Referenzen
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5(2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
