Methodenartikel

Etablierung der minimalen bakteriziden Konzentration eines antimikrobiellen Mittels für planktonische Zellen (MBC-P) und Biofilmzellen (MBC-B)

DOI:

10.3791/50854

⸱

2. Januar 2014

1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der mit einer 96-Well-Mikrotiterplatte einen Biofilm in vitro bilden kann. Planktonische oder Biofilmbakterien sind seriellen Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit wird durch das Wachstum auf Agarplatten geprüft.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen planktonischer und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der in vitroeinen Biofilm bilden kann. Bakterien werden in die Brunnen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geimpft. Beim planktonischen Assay werden den bakteriellen Suspensionen serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl zugesetzt. Im Biofilm-Assay, einmal geimpft, werden die Bakterien über einen bestimmten Zeitraum zu einem Biofilm zurückgelassen. Nicht angeschlossene Zellen werden aus den Brunnen entfernt, das Medium aufgefüllt und serielle Verdünnungen des antimikrobiellen Mittels der Wahl hinzugefügt. Nach der Exposition gegenüber dem antimikrobiellen Mittel werden die planktonischen Zellen auf Wachstum untersucht. Für den Biofilm-Assay werden die Medien mit frischen Medien ohne antimikrobielle Mittel aufgefrischt und die Biofilmzellen müssen sich erholen. Die Lebensfähigkeit von Biofilmzellen wird nach der Erholungsphase geprüft. Das MBC-P für das antimikrobielle Mittel ist definiert als die niedrigste Konzentration von Medikament, das die Zellen in der planktonischen Kultur abtötet.  Im Gegensatz dazu wird das MBC-B für einen Stamm bestimmt, indem vorgeformte Biofilme für 24 Stunden erhöhten Konzentrationen antimikrobiellen Mittels aussetzen. Das MBC-B ist definiert als die niedrigste Konzentration an antimikrobiellen Mitteln, die die Zellen im Biofilm abtötet.

Einleitung

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Antibiotikaresistenz-Assays wurden ursprünglich entwickelt, um die Resistenz von planktonischen (freischwimmenden) Bakterienkulturen zu assayen. Da es sich bei vielen bakteriellen Infektionen um Biofilme (oberflächengebundene Zellen) handelt, waren wir an der Entwicklung einer Methode zum Assay biofilmspezifischer Antibiotikaresistenz interessiert. Die meisten Antibiotikaresistenztests sind jedoch schlecht geeignet, um die Resistenz von Biofilmen zu messen. Beispielsweise ist die Bestimmung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) der Goldstandard für die Bestimmung der Antibiotikaresistenz von planktonischen Bakterienkulturen 1. Dieser Test beinhaltet das Mischen einer verdünnten planktonischen Kultur mit einer Verdünnungsserie von Antibiotika.  Die Konzentration von Antibiotika, die das sichtbare Wachstum der planktonischen Zellen hemmt, ist das MIC. Da dieser Test auf wachstumshemmungshzuhemmen ist, kann er per definitionem nicht mit Biofilmkulturen arbeiten, was die Untersuchung der antibiotika-Empfindlichkeit von Zellen in einem vorgewachsenen Biofilm erfordert. Anstatt die Wachstumshemmung zu messen, bestimmt der hier beschriebene MBC-B-Assay die Konzentration von Antibiotika, die bereits in einem Biofilm vorhandene Zellen abtötet. So zielt dieser Test darauf ab, antibiotika-Behandlungen etablierter Biofilminfektionen nachzuahmen und einen relevanteren Überblick über die bakterielle Antibiotikaresistenz in vivozu geben.

Da Biofilme im Allgemeinen antibiotikaresistenter sind als planktonische Kulturen 2-4 , war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die die Antibiotikaresistenz eines Biofilms direkt mit der einer planktonischen Kultur in Beziehung steht. Ein weiteres Ziel dieser Methode ist es, den Grad der Antibiotikaresistenz zwischen planktonischen und Biofilmzellen direkt vergleichen zu können. Die hier beschriebenen MBC-P- und MBC-B-Assays machen dies möglich, da Zellen unter ähnlichen Bedingungen kultiviert werden. Wir haben diese Methode verwendet, um mehrere Gene zu untersuchen, die für die biofilmspezifische Antibiotikaresistenz 5-8 wichtig sind.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MBC-B

  1. Anbau eines Biofilms (angepasst an O'Toole9).
    1. Wachsen Sie eine Kultur der wilden Art Stamm von Interesse und mutierte Sorte für 16 Stunden in einem reichen Medium bei 37 °C.
    2. Verdünnen Sie die gesättigten Nachtkulturen 1:100 in ein frisches Medium für Antibiotikaresistenztests. Ein Standardmedium für P. aeruginosa ist M63 minimal medium ergänzt mit Magnesiumsulfat und Arginin (siehe Tabelle 1). Dieses Medium stimuliert die Bildung eines robusteren Biofilms.
    3. Fügen Sie 100 l der Verdünnung pro Brunnen in eine 96-Well-Mikrotiterschale ein (siehe Tabelle 1). Da diese Assays in der Regel in Dreifacharbeit für jede Sorte durchgeführt werden, sollte es 24 Brunnen jeder Sorte geben.
    4. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
  2. Den vorgeformten Biofilm einem Konzentrationsgradienten von Antibiotika aussetzen
    1. Bereiten Sie eine 10x Verdünnungsserie von Antibiotika für 7 Brunnen vor. Beispiel: Für das Antibiotikum Tobramycin sind die Endkonzentrationen in den Brunnen 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 und 0,006 mg/ml 5-8 . Aus einem Vorrat von 25 mg/ml 10x Verdünnungen von 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 und 0,06 mg/ml zubereiten. Lassen Sie auf Eis.
    2. Entfernen Sie den verbrauchten Überstand (enthält planktonische Zellen) mit einer Mehrkanalpipette (siehe Tabelle 1).
    3. Fügen Sie allen Brunnen 90 l M63 (Mg/Arg) hinzu.
    4. Fügen Sie 10 l jeder 10-fachen Antibiotikakonzentration hinzu, um die gewünschten Endkonzentrationen zu erreichen. Fügen Sie dem endkundierten Brunnen für jede Replikation und jeden Stamm 10 l Wasser (keine Antibiotikakontrolle) hinzu.
    5. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
  3. Erfrischen der Medien und Ermöglichen der Ablösung von lebenden Zellen.
    1. Entfernen Sie den verbrauchten Überstand (enthält planktonische Zellen) mit einer Mehrkanalpipette.
    2. Fügen Sie 115 'l M63 (Mg/Arg) zu allen Brunnen hinzu.
    3. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
  4. Assay für lebende Zellen.
    1. Beschriften Sie zwei LB Agarplatten pro 96-Well-Mikrotiterplatte.
    2. Sterilisieren Sie das Multiprong-Gerät (siehe Tabelle 1), indem Sie die Zinken in 100% Ethanol tauchen und die Zinken über die offene Flamme eines Bunsenbrenners leiten. Wiederholen. Lassen Sie die Zinken leicht abkühlen. Übertragen Sie mit dem Multiprong-Gerät 3 l (Menge, die typischerweise an den Spitzen der Zinken beibehalten wird) der planktonischen Kultur von jedem Brunnen der Mikrotiterplatte auf die Oberfläche einer LB-Agarplatte.
    3. Die LB-Agarplatten für 16 Stunden bei 37 °C inkubieren.
    4. Bestimmen Sie die minimale bakterizide Konzentration des Antibiotikums, indem Sie per Auge den Cut-off für das bakterienwachstum identifizieren (Abbildung 1).

2. MBC-P

  1. Vorbereitung von Bakterienstämmen
    1. Wachsen Sie eine Kultur der wilden Art Stamm von Interesse und mutierte Sorte für 16 Stunden in einem reichen Medium bei 37 °C.
    2. Verdünnen Sie die gesättigten Nachtkulturen 1:100 in ein frisches Medium für Antibiotikaresistenztests. Ein Standardmedium für P. aeruginosa ist M63 minimal medium ergänzt mit Magnesiumsulfat und Arginin (siehe Tabelle 1).
    3. Fügen Sie 90 l der Verdünnung pro Brunnen in eine 96-Well-Mikrotiterschale ein (siehe Tabelle 1). Da diese Assays in der Regel in Dreifacharbeit für jede Sorte durchgeführt werden, sollte es 24 Brunnen jeder Sorte geben.
  2. Planktonzellen einem Konzentrationsgradienten von Antibiotika aussetzen
    1. Bereiten Sie 10x Verdünnungsserie von Antibiotika für 7 Brunnen. Beispiel: Für das Antibiotikum Tobramycin betragen die Endkonzentrationen in den Brunnen 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 und 0,0005 mg/ml. Aus einem Vorrat von 25 mg/ml Verdünnungen von 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 und 0,005 mg/ml zubereiten. Lassen Sie auf Eis.
    2. Fügen Sie 10 l jeder 10-fachen Antibiotikakonzentration hinzu, um die gewünschten Endkonzentrationen zu erreichen. Fügen Sie dem endkundierten Brunnen für jede Replikation und jeden Stamm 10 l Wasser (keine Antibiotikakontrolle) hinzu.
    3. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte für 24 Stunden bei 37 °C.
  3. Assay für lebende Zellen.
    1. Beschriften Sie zwei LB Agarplatten pro 96-Well-Mikrotiterplatte.
    2. Sterilisieren Sie das Multiprong-Gerät (siehe Tabelle 1), indem Sie die Zinken in 100% Ethanol tauchen und die Zinken über die offene Flamme eines Bunsenbrenners leiten. Wiederholen. Lassen Sie die Zinken leicht abkühlen. Übertragen Sie mit dem Multiprong-Gerät 3 l (Menge, die typischerweise an den Spitzen der Zinken beibehalten wird) der planktonischen Kultur von jedem Brunnen der Mikrotiterplatte auf die Oberfläche einer LB-Agarplatte.
    3. Die LB-Agarplatten für 16 Stunden bei 37 °C inkubieren.
    4. Bestimmen Sie die minimale bakterizide Konzentration des Antibiotikums, indem Sie per Auge den Schnitt für das Bakterienwachstum identifizieren (Abbildung 2).

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Ergebnisse

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MBC-P- und MBC-B-Assays wurden durchgeführt, um die Empfindlichkeit des PA14-Wildtyps mit PA14 ∆ndvBzu vergleichen. Tobramycin wurde als Antibiotikum verwendet. Die Ergebnisse, die Schritt 1.4.4 (Abbildung 1) und Schritt 2.3.4 (Abbildung 2) entsprechen, werden dargestellt. PA14 und ∆ndvB wurden in die MBC-P- und MBC-B-Assays in dreifacher Ausfertigung geimpft. Nach Abschluss der Schritte 1.0-1.4 des MBC-B-Protokolls und der Schritte 2.0-2.3 des MBC-P-Protokolls wurden d...

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Diskussion

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Antibiotikaresistenz in planktonischen Zellen ist definiert als eine Erhöhung der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) eines Antibiotikums aufgrund einer permanenten Veränderung der Zellen(z. B. eine Mutation). Die bisher identifizierten Mechanismen der biofilmspezifischen Resistenz oder Toleranz sind das Ergebnis der Expression wildartiger Gene in Biofilmen. Daher gilt die klassische Definition von Resistenz nicht für Biofilme. Es wurde jedoch eine weitere Reihe von Definitionen vorgelegt: Resistenzmechanism...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autorin erklärt, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Danksagungen

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Der Autor dankt Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz und Clayton Hall für die redaktionelle Hilfe bei diesem Manuskript. Dieser Test wurde ursprünglich im Labor von George O'Toole, Geisel School of Medicine in Dartmouth, entwickelt. Die Forschung in Dr. Mahs Labor wird durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und Cystic Fibrosis Canada unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare

1x  M63

Vorbereiten als 5x  M63-Stamm durch Auflösen von 15 g KH2PO4, 35 g K2HPO4 und 10 g (NH4)2SO4 in 1 l Wasser. Dieser Schaft muss nicht autoklaviert werden und kann bei Raumtemperatur gelagert werden. 5x verdünnen; Lager 1:5, autoklavieren, abkühlen lassen, dann die gewünschten Komponenten hinzufügen.

>

KH2PO4

Fisher

P285-500

>

K2HPO4

Fischer

P288-500

(NH4)2SO4

Sigma

A5132

Magnesiumsulfat

Fisher

M63-500

Zu 1 mM Endkonzentration hinzufügen.  Als 1 M Vorrat in Wasser zubereiten und autoklavieren.

Tobramycin

Sigma

Vorbereiten 50 mg/m  Lager. Aliquotieren und speichern bei -20°C.

Arginin

Sigma

A5131

Zu 0,4% Endkonzentration hinzufügen.  Als 20% Vorrat in Wasser zubereiten und filtrieren, sterilisieren.  Diese alternative Kohlenstoff-/Energiequelle kann Glukose- und Casaminosäuren ersetzen

96-Well-Mikrotiterplatten

Corning

3595

Steril, flacher Boden, geringe Verdampfung

Tranferpette (Mehrkanalpipette)

BrandTech

2703610

8-Kanal, 20-200 μ l

Mehrpolige Vorrichtung

Dan-Kar

MC48

48 Zinken passen in ½ einer 96-Well-Mikrotiterplatte

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
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  13. Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).

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Schlagwörter

Serielle Verd nnung96 Well MikrotiterplatteLB AgarplattenMehrzinkensondeTobramycin Assaybakterielle Viabilit t

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