Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Zusammenfassung

Ansätze zum Testen der Wirkung von Neuroleptika (APD) in Caenorhabditis elegans gezeigt werden. Die Tests werden für die Prüfung Arzneimittelwirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit und Rachenpumprate beschrieben. Diese Methoden sind auch für pharmakogenetische Versuche mit anderen als APDs Medikamentenklassen.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist eine einfache genetische Organismus zugänglich Groß Vorwärts-und Rückwärts genetischen Screens und chemisch-genetischen Bildschirme. Die C. elegans Genom umfasst mögliche Antipsychotikum (APD) Ziele im Menschen konserviert, einschließlich der Gene, die Proteine ​​für die Neurotransmitter-Synthese und für die synaptische Struktur und Funktion erforderlich kodiert. APD Exposition produziert Entwicklungsverzögerung und / oder Letalität bei Nematoden in einer konzentrationsabhängigen Weise. Diese Phänotypen verursacht, teilweise durch die APD-induzierte Hemmung der Rachenpump ^1,2. Somit hat die Entwicklungs Phänotyp eine neuromuskuläre Basis, so dass es nützlich pharmakogenetische Studien von Neuroleptika. Hier zeigen wir detaillierte Verfahren für die Prüfung APD Auswirkungen auf die Nematodenentwicklung und Rachen Pumpen. Für die Entwicklungs-Assay werden synchronisiert Embryonen auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten, die APD, und die Stadien der Entwicklung ani platziertmals werden dann täglich erzielt. Für die Rachenpumprate-Test, inszenierte junge Tiere werden auf NGM-Platten mit APDs getestet. Die Anzahl der Pharynx Pumpen pro Zeiteinheit aufgezeichnet werden, und die Pumpgeschwindigkeit wird berechnet. Diese Assays können zur Untersuchung von vielen anderen Arten von kleinen Molekülen oder sogar großen Molekülen verwendet werden.

Einleitung

Caenorhabditis elegans ist eine einfache genetische Organismus zugänglich Groß Vorwärts-und Rückwärts genetischen Screens und chemisch-genetischen Bildschirme. C elegans ist gegenüber einem breiten Spektrum von biologisch aktiven Verbindungen und ist daher nicht erfolgreich verwendet worden, um die Mechanismen der Wirkung von einer Vielzahl von solchen Verbindungen zu definieren. Zum Beispiel mit Schnecken Pharmakogenetik gehören Acetylcholin-Rezeptor-Agonisten (zB Levamisol, Nikotin, Morantel und Pyrantel), Anästhetika (zB Halothan), Koffein, Cholinesterase-Inhibitoren (z. B. Aldicarb, Lannate und Trichlorfon), Fluorid, GABA-verwandten studierte bioaktiven Verbindungen Verbindungen (z. B. GABA und Muscimol), Ivermectin, Paraquat, Phorbolester und Serotonin-bezogene Medikamente (z. B. Serotonin und imiprimine) ^3. Außerdem C. elegans hat für große Bildschirme kleines Molekül verwendet worden, so dass Entdeckung von neuen bioaktiven Verbindungs und Identifizierung neuer genetischer Ziele ^4.

Die C. elegans Genom umfasst mögliche Antipsychotikum (APD) Ziele im Menschen konserviert, einschließlich der Gene, die Proteine ​​für die Neurotransmitter-Synthese und für die synaptische Struktur und Funktion ⁵ erforderlich kodiert. So, C. elegans Neurogenetik und Neurobiologie bieten Methoden für die Entdeckung neuer molekularer Wirkmechanismen von APDs. In Nematoden, APD Exposition früh in der Entwicklung produziert Entwicklungsverzögerung, und bei höheren Konzentrationen, Letalität ^2,6. APD Exposition im Erwachsenenalter produziert Verhaltens Phänotypen. Zum Beispiel hemmt Clozapin Exposition Fortbewegung und Rachenpump und verbessert Eiablage ^1,2,7.

APD-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität sind starke Phänotypen für Groß chemisch-genetischen Bildschirme. Diese Phänotypen sind komplex, soweit sie wahrscheinlich mehr als einen zellulären und genetischen basis. Daher werden solche genetischen Bildschirme erwartet, dass eine Vielzahl von indirekten Wirkstoffziele ergeben. Allerdings hat unser Labor Kandidaten-Gen-Bildschirme und eine genomweite RNAi-Bildschirm für die Unterdrücker der APD-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität durchgeführt und erfolgreich wiederhergestellt Gene, die wahrscheinlich zu kodieren direkte Ziele, einschließlich Dopamin, Insulin und Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren ^2,8. Genetische Screens auf der Grundlage APD-induzierte Verhalten beim Erwachsenen haben auch die Identifizierung neuer APD Ziele führte, und wir jetzt Validierung von Targets sowohl Entwicklungs-und Verhaltens Bildschirme in Säugetieren ^7. So scheint, ein wirbel chemisch-genetischen Ansatz für neuartige molekulare Wirkmechanismen von APDs entdecken machbar ^5,8 sein.

Die C. elegans Rachen ist ein Organ, 20 Neuronen, Muskelzellen, 20, 20 und akzessorischen Zellen durch eine Basalmembran gewickelt enthält. Ähnlich wie bei der Säugetier-Herz, ist der Rachen eine autonomend Pumpen ständig Essen in von der äußeren Umgebung ^9. Die Hemmung der Rachenpumprate beeinträchtigt Nahrungsaufnahme und damit Mutationen oder Medikamente, die Rachenpump Ursache Entwicklungsverzögerung hemmen oder zu verhaften ^9. APDs hemmen die Rachenpumprate Anteil zum Teil auf ihre Auswirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit ^1,2. Hier verwenden wir die atypische APD Clozapin als Beispiel für Drogentests zur Nematodenentwicklung und Rachenpump demonstrieren.

Protokoll

1. Entwicklungsverzögerung / Letalität Assay: Die Wildtyp-(N2) und Zwei Mutant (Mut1 und Mut2) Die Stämme werden in drei Clozapin Konzentrationen in einer 12-Well-Platte getestet

1. (Jeweils auch mit einem 2 cm Durchmesser) Am Tag 1 pour 2 ml NGM Medium ¹⁰ in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen auf der Bank bei Raumtemperatur (RT) über Nacht aushärten. Am selben Tag, wählen Sie eine Kolonie von Escherichia coli OP50 Bakterien infizieren, eine Flasche von 50 ml LB-Lösung und Kultur, die sie in einem 37 ° C-Schüttler bei 220 rpm Dreh Übernachtung.
2. Am Tag 2 Transfer 20 ul OP50 Bakterienkultur auf die Mitte jeder NGM auch. Die Inkubation in einem 37 ° C-Inkubator oder lassen Sie sie über Nacht bei RT, damit der Bakterienrasen dicker zu wachsen.
3. Machen Sie eine 80 mM Stammlösung Clozapin durch Auflösen von Clozapin in DMSO (Dimethylsulfoxid) Lösungsmittel. Dann machen Sie eine 80-ul-Arbeitslösung mit der Stammlösung in 1,7 mM Essigsäure verdünnt bin Tabelle 1 ased.
   Hinweis: Die Arbeitslösung für ein bestimmtes Medikament von Interesse sind, indem Sie eine Reihe von vorläufigen Konzentrationstests, um die am besten geeignete Konzentration für die Unterscheidung der Wildtyp von den Mutanten zu finden bestimmt werden.
4. Über 80 ul Clozapin Arbeitslösung auf die Platte ausgesät NGM gut und wirbeln die Platte, damit die Lösung gleichmäßig auf der Oberfläche verteilen. Warten Sie, bis die Platte zu trocknen. Verwenden Sie die Platte für den Test am gleichen Tag oder legen Sie sie in einem 20 ° C-Inkubator, am nächsten Tag verwendet werden.
   Hinweis: Die Arbeitslösung ist eine Wirkstoffsuspension aufgrund der geringen Löslichkeit von Clozapin, insbesondere bei höheren Konzentration. Daher vortexen Rohr vor der Lösung in der Medikamentenplatte, um zu gewährleisten, dass die Wirkstoffkonzentration genau ist.
5. Waschen Würmer aus einem 3,5 cm-Platte mit vielen schwangeren Erwachsenen mit M9-Puffer und dann drehen sie in einem 15-ml-Tubebei 2000 Upm für 1 min.
6. Saugen Sie den Überstand. 5 ml Bleichlösung (NaOH: Hypochlorit: ddH ₂ O bei 4.01.05) und stören die Nematoden durch vorsichtiges Umdrehen der Rohre.
7. Beachten Sie die Tiere, bis die Hälfte von ihnen sind mit rund 5 min gelöst. Spin down die Eier bei 2.000 rpm für 1 min.
8. Saugen Sie den Überstand und fügen Sie 14 ml M9-Puffer schnell.
9. Spin down die Eier bei 2.000 rpm für 1 min und saugen Sie den Überstand, so dass etwa 100 ul Lösung. Vortex, um die Eier zu suspendieren.
10. Transfer 2 ul Eier in M9 aufgehängt auf einer regulären NGM Platte zu testen, wie viele Eier übertragen werden. Stellen Sie die Lautstärke der suspendierten Eier, um sicherzustellen, dass es etwa 30 bis 35 Eier in jeder Übertragung. Übertragen 30-35 Eier in jede Vertiefung der Testplatte, und dann in einem 20 ° C-Inkubator inkubiert für 24 Stunden.
11. Am ersten Tag des Tests, Note die Anzahl der Eier geschlüpft. Stellen Sie die Gesamtzahl der Tiere, die von schraffierten Picki 25/wellng von den zusätzlichen Würmer, wenn nötig.
12. An den folgenden Tagen, die Tiere zu beobachten und Gäste sie alle 24 Stunden. Entwicklungsstufe wird basierend auf der Größe des Tieres und der Form der Vulva ¹¹ erzielt. Der Versuch dauert 5-6 Tage mit den robusten Effekt in der Regel am dritten oder vierten Tag gesehen.
13. Eingabe der Daten in eine Excel-Datei und berechnen Sie den Prozentsatz der Tiere in jeder Entwicklungsstufe für jeden Tag des Experiments. Erzeugung von Diagrammen mit der Funktion '100% Gestapelte Säule "in der Spalte '2-D"-Menü.

2. Rachen-Pumping Assay: Junger Erwachsener Tiere für den Wildtyp-und Mutanten-Stämme sind auf Clozapin Assay-Platten Partitur

1. Die Testplatte wird nach dem gleichen Protokoll für die Entwicklungsverzögerung / Letalität Assay verwendet werden.
2. Wählen L4 50 Tieren für jeden Stamm auf NGM-Platten ausgesät 24 Stunden vor dem Test und bebrüten die Würmer bei 20 ° C
3. Wählen Sie 10 Tiere zu einem assay Well-Platte. Dann wählen Sie 10 Tiere auf den nächsten gut, alle 15-20 min.
4. Nachdem die Tiere in der ersten und haben den Drogen für 30 Minuten ausgesetzt wurde, starten Sie den Test durch Beobachtung Rachenpump unter einem Dissektionsmikroskop und Gäste die Pumpen für 20 sec ^9. Sobald Rachenpump erzielt wird, wählen Sie den Wurm von der Platte.

Ergebnisse

1. Entwicklungsverzögerung / Letalität Testergebnis

Ein typisches Ergebnis für die Entwicklungsverzögerung / Letalität Test wird in den 1a 1b gezeigt und. Bei Wildtyp-Tiere in der Kontrollgruppe wurden dem schwangeren Erwachsenen-Stadium (Abbildung 1a) gewachsen ist, sind Wildtyp-Tiere auf Clozapin ausgesetzt noch in den jungen Larvenstadien oder tot sind (Abbildung 1b). 1c zeigt ein repräsentatives Ergebnis zu vergleichen ein Suppressor-Mutant...

Diskussion

Hier Verfahren zum Testen der Wirkung von APDs auf die Entwicklung und das Verhalten von C beschreiben wir elegans. DMSO oder Ethanol eingesetzt wird Clozapin lösen, da der Wirkstoff in Wasser relativ unlöslich ist. Da Lösungsmittel wurde berichtet, daß C. beeinflussen elegans Biologie ^12, DMSO-alone-oder Ethanol-alone-Kontrollgruppen sind unerlässlich. Die höchste Konzentration an DMSO in unseren Tests verwendet wird bis zu 3%, was eine offensichtliche Wirkung auf C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Clozapin	Sigma	C6305
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D8418
Essigsäure (HAC)	Fisher	BP2401
Natriumhydroxid (NaOH)	EMD	SX0590-13
Hypochlorit	Sigma-Aldrich	425044
Zentrifuge 5810	Eppendorf	5810 000.017
Inkubatorschüttler	New Brunswick Scientific	M1246-0006
Niedertemperatur-Inkubator 815	Precision Scientific	J1790-1B
Stereomikroskop	Olympus	SZX12
Petrischale 35 x 10	mm Fisher Scientific	NC9434271
12-Well-Gewebekulturplatte	BD Falcon	REF 353043