Method Article

Systematische Analyse von In-vitro- Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie verwendet eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, deutlichen Erhöhung des Durchzellroll Studien unter physiologisch relevanten Scherströmung. Angesichts der Bedeutung der Zellvoll in der Mehrschrittzellen Homing Kaskade und die Bedeutung der Referenzzelle nach systemischer Abgabe exogener Populationen von Zellen in Patienten, bietet dieses System als Screening-Plattform zellbasierte Therapie verbessern Potential.

Abstract

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Eine große Herausforderung für zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, systemisch Ziel, eine große Menge von lebensfähigen Zellen mit hoher Effizienz zu Geweben von Interesse nach intravenöser oder intraarterieller Infusion. Folglich erhöht Zelle Homing wird derzeit als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern sucht. Zell Rollen auf dem vaskulären Endothel ist ein wichtiger Schritt im Prozess der Zell Homing und kann in-vitro unter Verwendung eines Parallelplattenlaufkammer (PPFC) untersucht werden. Dies ist jedoch ein extrem mühsam, niedrige Durchsatz-Assay, mit schlecht eingestellten Strömungsbedingungen. Stattdessen haben wir eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, das Studium der Zellrolleigenschaften unter genau kontrollierten, physiologisch relevanten Scherströmung 1,2 ermöglicht einen höheren Durchsatz. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie die Rolleigenschaften von HL-60 (menschliche Promyelozytenleukämie-Zellen) auf P-und E-Selectin beschichteten Oberflächen sowie auf Zellmonoschicht-beschichteten Oberflächen werden readily sucht. Um besser zu simulieren entzündlichen Bedingungen wurde die mikrofluidische Kanaloberfläche mit Endothelzellen (ECs), die dann mit Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) aktiviert wurden, signifikant erhöht Wechselwirkungen mit HL-60-Zellen unter dynamischen Bedingungen beschichtet. Die verbesserte Durchsatz und integrierter Multi-Parameter-Analyse-Software-Plattform, die eine schnelle Analyse von Parametern wie Walzgeschwindigkeiten und Rollbahn ermöglicht, sind wichtige Vorteile für die Beurteilung der Zellrollverhalten in-vitro. Die eine schnelle und genaue Analyse von technischen Konzepten, die auf Zell Walz-und Referenz auswirken, kann diese Plattform Voraus exogene zellbasierte Therapie helfen.

Introduction

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Eine der großen Herausforderungen bei der erfolgreichen klinischen Übersetzung von Zell-basierten Therapie ist die ineffiziente Lieferung oder Targeting von systemisch infundiert Zellen an gewünschten Stellen 3,4. Folglich gibt es eine ständige Suche nach Ansätzen zur Zelle Homing zu verbessern, und zwar Zelle Rollen, als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern. Zellroll auf die Blutgefäße ist ein wichtiger Schritt in der Zelle Homing Kaskade, klassisch für Leukozyten, die zu Krankheit Stellen 5 rekrutiert werden, definiert. Dieser Schritt wird durch spezifische Interaktionen zwischen Endothelzellen Selektine geregelt, dh P-un....

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Protocol

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1. Zellkultur

  1. Menschlichen Promyelozytenleukämie (HL-60-Zellen)
    1. Kultur HL-60-Zellen in 75 cm 2-Kolben mit 15 ml Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 20% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS), 1% (v / v) L-Glutamin und 1 ergänzt % (v / v) Penicillin-Streptomycin.
    2. Ändern Medien alle 3 Tage durch Absaugen Hälfte der Zellsuspension Volumen und mit komplettem IMDM Medien zu ersetzen.
    3. Für Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) Färbung Zentrifuge HL-60-Zellsuspension (400 × g, 5 min), Resuspendieren in einer 1 &mgr; M CFSE-Lösung (in vorgewärmtem PBS) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. Dann Zentrifug....

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Results

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HL-60-Zellen rollen auf P-und E-Selektin-Oberflächen, aber nicht auf Fibronektin

HL-60-Zellen gelten als Goldstandard "Rollen", wie sie eine Vielzahl von Homing-Liganden, einschließlich der rollenden Liganden P-Glykoprotein-sel-Liganden-1 (PSGL-1) und Sialyl-Lewis-X (SLeX) 5,14 (Abbildung 1A ausdrücken ). Die Oberflächenprotein PSGL-1 wirkt als ein Gerüst für das Tetrasaccharid SLeX, Vermittlung spezifische Wechselwirkung mit P-und E-sel, der auf dem Endothel während.......

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Discussion

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Eine der großen Herausforderungen in der erfolgreichen Übersetzung von exogenen zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, effizient liefern Zellen zu Websites von Verletzungen und Entzündungen, die mit hoher Effizienz engraftment 3. Zellroll stellt einen entscheidenden Schritt in den Prozess der Zell Homing, die Erleichterung der Verzögerung der Zellen an den Wänden der Blutgefäße, was schließlich zu ihrem festen Adhäsion und Trans durch das Endothel in das Gewebe 5 führt. Besseres Verständnis des.......

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Disclosures

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Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

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CHO-P-Zellen waren eine Art Geschenk von Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health HL095722 Zuschuss unterstützt, um JMK Diese Arbeit wurde zum Teil auch von einem Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award zu JMK unterstützt

....

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Materials

ZellkulturreagenzienAntikörperEquipment

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Menschliche Lunge Mikrovaskuläre EndothelzellenLonzaCC-2527
P-Selektin-exprimierende Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-P)Art Geschenk von Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 ZellenATCCCCL-240<
Endotheliales BasalmediumLonzaCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Endotheliales Basalmedium SupplementsLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1xGibco12440
F-12 (1x) Nährstoffmischung (Schinken)Gibco11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)Gibco15140
L-Glutamin (L/G) 200 mMGibco25030
Fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
PetrischalenBD FalconBD-353003
100 mm Zellkulturschale, Gewebekulturbehandeltes Polystyrol
Zentrifugenröhrchen (15 ml konische Polypropylen-Röhrchen)MedSupply PartnersTC1500
T75 KolbenBD Falcon353136
Gelatinelösung (2%)SigmaG1393
dPBS (ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid)SigmaD8537
Trypsin-EDTA-Lösung (10x)SigmaT4174<
Anti-hE-Selectin/CD62ER& D SystemsBBA21
FITC Konjugierte Maus IgG1R& D SystemsBBA21
Anti-hP-Selektion F& T D SystemsBBA34
FITC Konjugierte Maus IgG1R& D SystemsBBA34
FITC Maus IgG­ 1 κ IsotypkontrolleBD Bioscience555748
Anti-SLeX /CD15s AB, Klon: 5F18Santa CruzSC70545
FITC konjugierteSanta CruzSC70545
normale Maus IgM-FITC IsotypkontrolleSanta CruzSC2859
PE Maus Anti-Human CD162, Klon: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Maus IgG1 k Isotyp-KontrolleBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Klon P2H3MilliporeMAB2150
Maus IgG1 Isotyp-KontrolleSanta CruzSC3877
Andere Reagenzien
Rekombinantes humanes TNF-alphaPeproTech300-01A
Cell Trace CFSE Zellproliferationskit - für die DurchflusszytometrieInvitrogenC34554
Humanes P-Selektin-FC rekombinantes ProteinR& D Systems137-PS-050
Rekombinantes E-Selektin-FC-ProteinF& D Systems724-ES-100
Fibronektin Mensch, PlasmaInvitrogen33016-015<
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage war die Software, die zur Durchführung der Experimente und zur Analyse der Daten
BioFlux 48-Well-PlattenFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Das ZytometerBD BioscienceCFlow Plus war die Software, die verwendet wurde, um die Experimente durchzuführen und die Daten
: Nikon Eclipse Ti-S,Nikon
CoolSnap HQ2 CCD-Kamera, Photometrie
td colspan="4">td colspan="4">td colspan="4">verwendet wurde. zu analysieren

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C.

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Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

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