Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Schnelle Generierung von Amyloid aus nativen Proteinen in vitro

6.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

5. Dezember 2013

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Proteine können entweder eine native Struktur annehmen oder sich in unlösliches Amyloid fehlfalten. Bedingungen, die den Fehlfaltungsweg begünstigen, führen zur Bildung verschiedener Arten von Amyloidfibrillen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle Umwandlung von nativen Proteinen in Amyloid in vitro.

Zusammenfassung

Proteine erfüllen entscheidende Aufgaben in Organismen, indem sie Funktionen ausüben, die aus ihren spezifischen dreidimensionalen Falten hervorgerufen werden. Obwohl die nativen Strukturen von Polypeptiden viele Zwecke erfüllen, ist heute anerkannt, dass die meisten Proteine eine alternative Anordnung von Beta-Faltblatt-reichem Amyloid annehmen können. Unlösliche Amyloidfibrillen werden zunächst mit mehreren menschlichen Beschwerden in Verbindung gebracht, aber sie werden zunehmend als funktionelle Akteure gezeigt, die an verschiedenen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt sind. Darüber hinaus enthält Amyloid, das sich im Patientengewebe ablagert, nichtproteinhaltige Bestandteile wie Nukleinsäuren und Glykosaminoglykane (GAGs). Diese Cofaktoren können die Bildung von Amyloid erleichtern, was zur Bildung verschiedener Arten von unlöslichen Niederschlägen führt. Indem wir uns unser Verständnis zunutze machten, wie sich Proteine über ein Zwischenstadium des löslichen Amyloid-Vorläufers fehlfalten, haben wir eine Methode entwickelt, um native Proteine in vitro in Amyloidfibrillen umzuwandeln. Dieser Ansatz ermöglicht es, Amyloid in großen Mengen herzustellen, die Eigenschaften von Amyloid zu untersuchen, das aus bestimmten Proteinen erzeugt wird, und die strukturellen Veränderungen zu bewerten, die mit der Umwandlung einhergehen.

Einleitung

Proteine sind die am häufigsten vorkommenden biologischen Makromoleküle, die in allen Zelltypen vorkommen. Sie kommen in einer Vielzahl von Größen, Strukturen und posttranslationalen Modifikationen vor und erfüllen in ihrer nativen Form eine enorme Bandbreite wichtiger biologischer Funktionen. Mehr als zwei Dutzend aberrante Polypeptide wurden mit zahlreichen pathologischen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht, wie z. B. Alzheimer, Parkinson und Typ-2-Diabetes1-4. Die terminalen fehlgefalteten Proteine akkumulieren als Amyloidfibrillen die unlöslichen stabilen Aggregate, die extrazellulär oder intrazellulär auftreten.

Trotz der Bedeutung spezifischer Proteine bei bestimmten Krankheiten unterstützen immer mehr Beweise die Vorstellung, dass alle Polypeptide intrinsische Eigenschaften haben, die die Amyloid-Umwandlung ermöglichen. Eine genomweite Sequenzuntersuchung identifizierte das "Amylom", bei dem Amyloid-anfällige Fragmente etwa 15 % aller kodierenden Peptidsegmente von E. coli auf den Menschen ausmachen5. Dementsprechend wurde in den letzten Jahren eine zunehmende Anzahl von funktionellen Amyloiden entdeckt, die an verschiedenen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt sind. Zum Beispiel assemblieren Bakterien Amyloide zu Biofilmen und Sporenstrukturen, die für ihr Überleben und ihre Pathogenese entscheidend sind6-9. Peptidhormone bilden Amyloid-Ablagerungen während der Lagerung in sekretorischen Granulaten von Säugetieren, bevor sie freigesetzt werden, was weiter darauf hindeutet, dass die Protein-Amyloid-Form vorteilhafte biologische Funktionen erfüllen kann6,10,11. Darüber hinaus können sich Proteine auch zu Amyloidfibrillen zusammenschließen, um kritische zelluläre Signale weiterzuleiten12,13.

Seit vielen Jahren werden die am meisten untersuchten Amyloide aus einzelnen Peptiden hergestellt, die mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, wie z.B. Amyloid-Beta- oder Prionenpeptid. Diese Peptide haben in der Regel keine gut definierte Struktur und bilden im Laufe der Zeit spontan Amyloid in Lösung, ein Prozess, der durch ein teilweise fehlgefaltetes Zwischenprodukt vermittelt wird, das als Vorläufer von unlöslichem Amyloid dient. Der Vorläufer von Amyloid wird auch als lösliches Proteinoligomer bezeichnet, das selten und instabil ist, wenn es aus natürlichen Peptiden erzeugt wird14,15. Wie jedoch bereits beschrieben, kann fast jedes Protein prinzipiell unter den entsprechenden Bedingungen eine Amyloid-Konformation annehmen. Vor kurzem haben wir eine Methode zur Herstellung stabilisierter löslicher Oligomere nativer Proteine etabliert, die in Gegenwart verschiedener Cofaktoren leicht Amyloid bilden16. Die resultierenden Amyloidfibrillen spiegeln die komplexe Natur der fehlgefalteten Aggregate des terminalen Proteinswider 17,18. Hier verwenden wir den Begriff Nur-Protein-Amyloid, um die Proteinfibrillen ohne Cofaktoren zu bezeichnen, und Hybrid-Amyloid für die Fibrillen, die nicht-proteinhaltige Bestandteile enthalten.

Früher wurden verschiedene Methoden entwickelt, um Amyloid in vitro zu erzeugen, indem Bedingungen angewendet wurden, von denen bekannt ist, dass sie die Fehlfaltung von Proteinen begünstigen, wie z.B. hohe Temperaturen, hydrophobe Umgebung undpH-Schwankungen 19-23. Sie sind jedoch mit verschiedenen Problemen verbunden, wie z. B. geringer Wirkungsgrad, reversibles Falten, große Chargenvariationen oder langsame Kinetik. Der hier beschriebene Ansatz ist reproduzierbar, einfach zu skalieren und ermöglicht es, den Zeitpunkt und den Zustand der Amyloid-Umwandlung genau zu steuern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. MES-Puffer vorbereiten

  1. Verwenden Sie MES-Puffer (0,1 M, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure und 0,9 M NaCl), um sowohl reines Protein-Amyloid als auch stabilisierte lösliche Proteinoligomere herzustellen. Wiegen Sie 1,95 g MES und 5,27 g NaCl. Fügen Sie H2O hinzu und stellen Sie den pH-Wert auf 4,7 ein. Füllen Sie das endgültige Volumen auf 100 ml auf. Bei 4º C bis zu 6 Monate lagern.

2. Nur-Protein-Amyloid direkt aus nativen Proteinen zubereiten

  1. Wiegen Sie das Protein Ihrer Wahl (jedes native Protein oder Peptid) und rekonstituieren Sie es auf 10 mg/ml in MES-Puffer.
  2. Inkubieren Sie bei 65 ºC im Wasserbad für 4 Stunden. Am Ende der Periode ist weißer Niederschlag in Lösung sichtbar.
  3. Neutralisieren Sie die Probe mit 10 % (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
  4. Dialysieren Sie das Protein über Nacht in einer Dialysekassette, um es für die weitere Analyse gegen den gewünschten Puffer auszutauschen.
  5. Eine Kontrollprobe des nativen Proteins kann durch Befolgen der Schritte 2.1, 2.3 und 2.4 ohne Hitzefällung (Schritt 2.2) hergestellt werden.

3. Hybrid-Amyloid aus stabilisierten löslichen Oligomeren nativer Proteine herstellen

  1. Bereiten Sie stabilisierte lösliche Proteinoligomere vor
    1. Wiegen Sie das Protein Ihrer Wahl und rekonstituieren Sie es auf 10 mg/ml in MES-Puffer. 15 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen.
    2. Wiegen Sie 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC) und bereiten Sie eine frische Brühe von 20 mg/ml in MES-Puffer vor.
    3. Mischen Sie Protein- und EDC-Lösungen im Verhältnis 2:5 (v/v), d. h. 2 mg Protein pro 10 mg EDC.
    4. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Neutralisieren Sie die Probe mit 10 % (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
    6. Dialysieren Sie das Protein über Nacht in einer Dialysekassette, um es für die weitere Analyse gegen den gewünschten Puffer auszutauschen.
    7. Lagern Sie das stabilisierte lösliche Proteinoligomer bei 4 ºC bis zu 4 Wochen.
  2. Bereiten Sie Hybrid-Amyloide aus stabilisierten löslichen Proteinoligomeren her.
    1. Um DNA-haltiges Amyloid herzustellen, mischen Sie DNA und stabilisiertes lösliches Proteinoligomer im Verhältnis 1:1 (w/w). Bei 4 °C mindestens 2 Std. ruhen lassen. Während dieses Zeitraums ist unlöslicher Niederschlag in Lösung sichtbar, wenn die anfängliche Proteinkonzentration 0,5 mg/ml oder höher beträgt.
    2. Zur Herstellung von RNA-haltigem Amyloid mischen Sie RNA und stabilisiertes lösliches Proteinoligomer im Verhältnis 1:1 (w/w). Bei 4 °C mindestens 2 Std. ruhen lassen. Während dieses Zeitraums ist unlöslicher Niederschlag in Lösung sichtbar, wenn die anfängliche Proteinkonzentration 0,5 mg/ml oder höher beträgt.
    3. Zur Herstellung von heparinhaltigem Amyloid mischen Sie Heparin und stabilisiertes lösliches Proteinoligomer im Verhältnis 1:1 (w/w). Bei 4 °C mindestens 2 Std. ruhen lassen. Während dieses Zeitraums ist unlöslicher Niederschlag in Lösung sichtbar, wenn die anfängliche Proteinkonzentration 0,5 mg/ml oder höher beträgt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Fähigkeit, native Proteine direkt in Amyloid umzuwandeln, beruht auf der Konformationsänderung, die bei hoher Temperatur im MES-Puffer erfolgt. Eine Präzipitation in der Lösung ist ein guter Hinweis auf Proteinaggregation und möglicherweise auf Amyloidbildung. Um dagegen lösliche Proteinoligomere zu stabilisieren, wird EDC zur Vernetzung der Proteine verwendet, um die im MES-Puffer induzierte oligomere Konformation festzulegen. Dadurch entstehen stabilisierte Proteinoligomere als multimerische Proteine (Abbil...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren bietet eine schnelle und flexible Möglichkeit, Amyloidfibrillen in vitro aus praktisch jedem Protein oder Peptid der Wahl herzustellen. Mehrere verschiedene Arten von Amyloid können zuverlässig hergestellt werden - reine Proteinfibrillen oder Hybridaggregate, die DNA, RNA oder Glykosaminoglykane enthalten. Die damit verbundenen Verfahren sind einfach, unkompliziert und erfordern keine fortgeschrittene technische Schulung. Das nach dieser Methode hergestellte Amyloid ist recht stab...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse an W.C. vom National Institutes of Health Grant AI074809 und dem University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutional Research Grant Program unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC)Thermo/Pierce22980
DNA aus LachsspermaSigmaD1626
RNA aus Torula-HefeSigmaR6625
Heparin aus der Darmschleimhaut des SchweinsSigmaH3149
Tris-BasisFisherBP152-1
Ausrüstung:
WasserbadFisher ScienceIsotemp 210
Slide-A-Lyzer DialysekassetteThermo/Pierce66380

Referenzen

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

AmyloidbildungProteinfehlfaltungMES PufferHitzepr zipitationEDC QuervernetzungNukleins ure AmyloidHeparin Amyloidl sliche Protein OligomereGel Shift AssayZytotoxizit tsanalyse
Schnelle Generierung von Amyloid aus nativen Proteinen in vitro
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.