Methodenartikel

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

DOI:

10.3791/50870

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13. Februar 2014

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1Cell Biology, University of Bielefeld, 2Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen.

Zusammenfassung

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Der Hippocampus spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung und Konsolidierung des episodischen Erinnerungen und der räumlichen Orientierung. Historisch ist der Hippocampus als sehr statisch anatomischen Bereich des Gehirns von Säugetieren angesehen. Allerdings haben die jüngsten Ergebnisse zeigten, dass der Gyrus dentatus des Hippocampus ist ein Bereich von enormer Plastizität bei Erwachsenen, die nicht nur Änderungen der bestehenden neuronalen Schaltkreisen, sondern auch adulte Neurogenese. Diese Plastizität ist von komplexen Transkriptionsnetz reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor NF-&kgr; B spielt eine herausragende Rolle. Um zu untersuchen und zu manipulieren, adulte Neurogenese, ein transgenes Mausmodell für Vorderhirn-spezifische neuronale Hemmung von NF-kappaB-Aktivität verwendet werden.

In dieser Studie werden Verfahren zur Analyse von NF-&kgr; B-abhängigen Neurogenese, einschließlich der strukturellen Aspekte, die neuronale Apoptose und Proliferation Vorläufer und kognitive Bedeutung whic beschriebenh wurde speziell über eine Gyrus dentatus (DG)-abhängigen Verhaltenstest, das räumliche Muster Trennung Barnes-Labyrinth (SPS-BM) bewertet. Die SPS-BM-Protokoll könnte einfach für die Verwendung mit anderen transgenen Tiermodellen, den Einfluss bestimmter Gene auf erwachsene Neurogenese beurteilen angepasst werden. Ferner könnte SPS-BM in anderen experimentellen Einstellungen auf die Untersuchung und Manipulation DG abhängigen Lern, beispielsweise mit pharmakologischen Mitteln gerichtet werden.

Einleitung

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Ontologisch ist der Hippocampus eine der ältesten bekannten anatomischen Hirnstrukturen. Es ist für verschiedene komplexe Aufgaben, wie z. B. Schwenk Funktionen bei der Regulation des Langzeitgedächtnisses, die räumliche Orientierung und die Bildung und Verfestigung des jeweiligen Speicher. Anatomisch, der Hippocampus besteht aus Pyramidenzellschichten (Stratum pyramidale), einschließlich der Ammonshorn (CA1, CA2, CA3 und CA4) Regionen und Gyrus dentatus (Gyrus dentatus), die Körnerzellen und neuronalen Vorläuferzellen ein paar in seinem Subgranularzone enthält . Die Körnerzellen ragen in Richtung der CA3-Region über den so genannten Moosfasern (Axo....

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Protokoll

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Ethik-Erklärung

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften der staatlichen Tierpflege und Verwendung Ausschuss LANUV des Landes Nordrhein-Westfalen, (Düsseldorf, Deutschland) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von LANUV, Düsseldorf unter der Lizenznummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV NRW) zugelassen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Not und die Anzahl der Tiere für die Studie zu minimieren.

1. Tierpflege-und Wohnungswesen

  1. Alle Tiere, die in den hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, sollten unter bestimmten erregerfreien Bedingungen gehalten werden, wie von ....

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Ergebnisse

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Kreuzung der I &kgr; B / - und tTA transgene Mauslinien zu bedingte Inhibition von NF-&kgr; B-Aktivität im Hippocampus.

Um die Expression des I &kgr; B &agr;-AA1-Transgens in der transgenen Mausdoppel (1A) zu untersuchen, wurden Gehirn isoliert, kryogeschnitten und gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP (green fluorescent protein). Die konfokale Laserscanmikroskopie zeigte eine hohe Expression des Transgens in der CA1-und CA3-Regionen und in .......

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Diskussion

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Adulten Neurogenese und die Möglichkeit ihrer Manipulation über die Hemmung von NF-kappaB in Neuronen und ihre spätere Reaktivierung über Doxycyclin, bietet eine faszinierende System für Untersuchungen neugeborenen Nervenzellen im erwachsenen Gehirn, als auch in neuronalen De-und Re-Generation . Der Vorteil bei diesem System ist, dass NF-&kgr; B-Signalwegs in Neuronen, Hemmung führt nicht nur zu Veränderungen in der neuronalen Zelltod Vorläufer Proliferation und Migration und schweren strukturellen und anatomischen .......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Wir danken Angela Kralemann-Köhler für hervorragende technische Unterstützung. Hier beschriebenen experimentellen Arbeiten wurde in unserem Labor durchgeführt und wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), um CK und BK und einem Zuschuss des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) an BK unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Moria MC17 Perforierter LöffelFST10370-18Entfernung des Gehirns
PräpariermikroskopCarl ZeissStemi SV8Entfernung des Gehirns
Chirurgische Schere FST14084-08Entfernung des Gehirns
Chirurgische Schere FST14381-43Entfernung des Gehirns
Dumont #5 PinzetteFST11254-20Entfernung des Gehirns
SuperFrost SlidesCarl Roth1879Slides für Immunhistochemie
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Fixiermittel
TissueTek OCT CompoundSakura Finetek1004200018Einbettung des Gehirns
Normal Goat SerumJackson Immunolabs005-000-001Blockierung in IHC
Normal Rabbit SerumJackson Immunolabs011-000-001Blockierung in IHC
Normal Donkey SerumJackson Immunolabs017-000-001Blockierung in IHC
anti-Neurofilament-M AntikörperEntwicklungsstudien Hybridoma Bank2H3IHC, Verdünnung 1:200
Anti-Doublecortin  Antikörpersc-8066Santa CruzIHC, Verdünnung 1:800
Anti-GFP AntikörperAbcamab290IHC, Verdünnung 1:2.000
Anti-BrdU AntikörperOBT0030GAccurate ChemicalsIHC, Verdünnung 1:2.000 
Fluor-Jade CFJ-CHistoChemBestimmung des neuronalen Zelltods
BetadinMundipharmaD08AG02Desinfektionsmittel
KryomikrotomLeicaCM1900Präparation von Hirnschnitten
Heparin-NatriumsalzSigma-AldrichH3393Perfusion
Kreisförmige Platte aus Hartplastik (Durchmesser 120 cm)im Labor hergestelltkeinePlatte für SPS-BM, Durchmesser 120 cm
Buraton Schnelldesinfektionsmittel Schü lke Mayr113 911Desinfektionsmittel
Video-Tracking-System TSE VideoMot 2 mit Software-Paket VideoMot2TSE Systems302050-SW-KITTracking und Analyse von SPS-BM
Triton X-100 Sigma AldrichT8787Permeabilisierung/IHC
KryotomReichert Jung/LeicaFrigomobil 1206Vorbereitung von 40 & Mikro; m Hirnschnitte
Mowiol 4-88Carl RothArt.-Nr. 0713Einbettung der Objektträger
SYTOX grünInvitrogenS7020Kernfärbung
Lebensmittelpellets (Kellog's Froot Loops)Kellog'sSPS-BM
Prism, Version 3.0Graph Pad Software, San Diego, USAStatistische Auswertung der SPS-BM
Zen 2008 oder Zen 2011 SoftwareCarl ZeissSoftware (Konfokalmikroskop)
D.P.XSigma-Aldrich317616Eindeckmedium für die Fluor-Jade-C-Färbung

Referenzen

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  1. Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
  2. Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brai....

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Schlagwörter

NF kappa Br umliche MusterseparationBarnes Labyrinthkonfokale Mikroskopiehistologische Analysetransgene M useGyrus dentatusVerhaltenstestsImmunfluoreszenzf rbung

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