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Methodenartikel

Methoden, um die NMR-Resonanzen von Identify

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DOI:

10.3791/50875

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12. Dezember 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es werden zwei Verfahren zur Zuordnung der α- und ε-Dimethylamin-Kernspinresonanzsignale eines reduktiv 13C-methylierten N-terminalen Lysins beschrieben. Eine Methode nutzt die pH-induzierte Selektivität der reduktiven Methylierungsreaktion, und die andere verwendet Aminopeptidase, um das N-terminale Lysin selektiv zu entfernen.

Zusammenfassung

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist eine bewährte Technik für Proteinstruktur- und dynamische Studien. Um Proteine mit NMR zu untersuchen, werden stabile magnetische Isotope typischerweise metabolisch eingebaut, um die Empfindlichkeit zu verbessern und eine sequentielle Resonanzzuordnung zu ermöglichen. Die reduktive 13-C-Methylierung ist eine alternative Markierungsmethode für Proteine, die nicht für eine Überexpression des bakteriellen Wirts geeignet sind, die gebräuchlichste Methode des Isotopeneinbaus. Die reduktive 13-C-Methylierung ist eine chemische Reaktion, die unter milden Bedingungen durchgeführt wird und die primären Aminogruppen eines Proteins (Lysin-ε-Aminogruppen und die N-terminale α-Aminogruppe) in 13C-Dimethylaminogruppen modifiziert. Die Struktur und Funktion der meisten Proteine wird durch die Modifikation nicht verändert, was sie zu einer praktikablen Alternative zur metabolischen Markierung macht. Da die reduktive 13-C-Methylierung spärliche Isotopenmarkierungen hinzufügt, sind traditionelle Methoden zur Zuordnung der NMR-Signale nicht anwendbar. Es wurde eine alternative Zuordnungsmethode entwickelt, die die Massenspektrometrie (MS) verwendet, um die Zuordnung von Protein-13-C-Dimethylamin-NMR-Signalen zu unterstützen. Die Methode beruht auf partiellen und unterschiedlichen Mengen an 13C-Markierung an jeder primären Aminogruppe. Eine Einschränkung der Methode ergibt sich, wenn der N-terminale Rest des Proteins ein Lysin ist, da die α- und ε-Dimethylaminogruppen von Lys1 nicht einzeln mit MS gemessen werden können. Um diese Einschränkung zu umgehen, werden zwei Methoden beschrieben, um die NMR-Resonanz der 13C-Dimethylamine zu identifizieren, die sowohl mit dem N-terminalen α-Amin als auch mit der Seitenkette ε-Amin assoziiert sind. Die NMR-Signale des N-terminalen α-Dimethylamin und der Seitenkette ε-Dimethylamin des Hühnereiweiß-Lysozyms Lysozym, Lys1, sind in 1 H-13C heteronuklearen Einzelquanten-Kohärenzspektren identifiziert.

Einleitung

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist ein wertvolles Werkzeug zur Strukturaufklärung von Proteinen1. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie kann die Lösungsstruktur eines Proteins in seinem nativen Zustand bestimmt werden. Um die geringe natürliche Häufigkeit stabiler magnetischer Isotope zu überwinden, ist es notwendig, 13C und 15N in das interessierende Protein einzubauen. Die gebräuchlichste Methode ist die rekombinante Expression in einem bakteriellen Wirt2-3. Zwei Nachteile der Überexpression des bakteriellen Wirts sind jedoch, dass sie keine posttranslationalen Modifikationen erzeugen kann und nicht für alle Proteine3-4 funktioniert. Wenn die bakterielle Expression kein gangbarer Weg für die Proteinproduktion ist, kann eine Überexpression in nicht-bakteriellen Wirten verwendet werden, aber die Isotopenmarkierung ist schwierig und teuer5. Alternative Expressionsmethoden für den Einbau von 13C- und 15N-Isotopen in Proteine für die NMR-Analyse umfassen spärliche Markierungstechniken unter Verwendung von metabolischen Vorläufern für die Methylmarkierung6 und einzelnen 13C, 15N Aminosäuren7-9. Ein chemischer Ansatz zur spärlichen Markierung, der hierin verwendet wird, ist die gut etablierte reduktive 13-C-Methylierungsreaktion (Abbildung 1), bei der die primären Aminogruppen auf einem Protein - das N-terminale α-Amin und das Lysin, die Seitenkette ε-Amine - methyliert sind. Sobald Monomethylamine gebildet sind, wird das Amin aufgrund des höheren pKa-Wertes leicht wieder methyliert, um Dimethylamine zu bilden.

Die reduktive Methylierung wurde erstmals von Means und Feeney10 als Methode zur chemischen Modifikation von Proteinen eingeführt. Die Vorteile dieser Reaktion sind ihre breite Anwendbarkeit und milde Reaktionsbedingungen bei gepufferten, physiologischen pH-Werten und niedrigen Temperaturen11,12. In Gegenwart von Formaldehyd und einem Reduktionsmittel, wie z. B. dem Dimethylamin-Boran-Komplex (DMAB), werden die Lysin-ε-Aminogruppen und die N-terminale α-Aminogruppe selektiv methyliert, um dimethylierte Amine zu erzeugen. Obwohl bekannt ist, dass Formaldehyd Proteine durch die Bildung von Methylenbrücken vernetzt, wird dieser Prozess durch das Reduktionsmittel13,14 blockiert.

Reduktive Methylierung wurde erfolgreich zur Untersuchung von Proteinen sowohl mit NMR als auch mit Röntgenkristallographie eingesetzt. Die reduktive Methylierung wird verwendet, um die Kristallisation von ansonsten hartnäckigen Proteinenzu erleichtern 15. Das Hühnerei-Eiweiß-Lysozym war das erste Protein, das in seiner dimethylierten Form kristallisierte. Die mittlere quadratische Differenz zwischen den schweren Atomen in der methylierten und der unmethylierten Lysozymstruktur beträgt 0,40 Å16. Dieser Vergleich zeigt, dass die Proteinstruktur nach reduktiver Methylierung aufrechterhalten werden kann, was die Reaktion zu einem brauchbaren Markierungswerkzeug für die Strukturaufklärung macht.

Durch die Verwendung von 13C-markiertem Formaldehyd in der reduktiven Methylierungsreaktion werden 13C-dimethylierte Amine hergestellt. Bei den 13C-Dimethylaminen handelt es sich um NMR-detektierbare Sonden, die häufig zur Untersuchung der Dynamik, Struktur und Funktion von Proteinen verwendet werden. NMR und reduktive 13-C-Methylierungwurden verwendet, um Protein-Liganden- und Protein-Protein-Wechselwirkungen für den β 2-adrenergen Rezeptor17, die Ribonuklease A18, das Lysozym19, das fd-Gen 5 Protein20 und das Cytochrom c21 zu untersuchen. In ähnlicher Weise wurden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von reduktiv 13C-methylierter Ribonuklease A22, Lysozym23, fd-Gen 5 Protein24, Clostridium pasteurianum ferredoxin25, Fc-Fragment von IgG26, Apolipoprotein A-I27 und MIP-1α28 untersucht. Die Dynamik der 13C-Dimethylaminogruppen wurde an Concanavalin A29-30 und Calmodulin31 untersucht.

Obwohl die reduktive 13-C-Methylierung weit verbreitet ist, um Proteine mit NMR zu untersuchen, war die Markierungsmethode immer durch die Schwierigkeiten bei der Zuordnung der NMR-Resonanzenbegrenzt 26. Die meisten Zuordnungsstrategien für reduktiv 13C-methylierte Proteine beruhen auf einer kleinen Anzahl von Stellen,20,28 bekannten strukturellen Eigenschaften11,19,23,26,31,32. oder umfangreiche genetische Veränderungen33. In keiner dieser Studien konnten alle 13C-Dimethylamin-Peaks erfolgreich zugeordnet werden, mit Ausnahme der Calmodulin-Studie, bei der die Peaks durch ortsgerichtete Mutagenese jedes Lysin33 zugeordnet wurden. Bei der Untersuchung der MIP-1α-Dimerbildung wurde erstmals über die Verwendung von Massenspektrometrie (MS) zur Unterstützung der NMR-Zuordnung von reduktiv 13C-methylierten Aminen berichtet28. Matrix-assistierte Laserdesorptionsionisations-Time-of-Flight (MALDI-TOF) MS wurde verwendet, um das Lysin an der Grenzfläche des Dimers zu identifizieren. Die teilweise methylierten Lysine von humanen MIP-1α-tryptischen Peptiden wurden mit MS identifiziert und korrelierten mit dem Auftreten von Mono- und Dimethylaminsignalen des intakten Proteins, die in 2D 1 H-13C HSQC NMR-Spektren28 beobachtet wurden. Unsere Gruppe ging auf die Anwendung von MS ein und stellte eine Zuordnungsmethode vor, die außer der Aminosäuresequenz34 keine Vorkenntnisse über die Struktur oder Eigenschaften des Proteins erfordert. Diese Methode ist auf die meisten Proteine anwendbar. Eine Ausnahme ist, wenn ein Protein ein N-terminales Lysin hat, da das MS-Isotopenprofil des N-terminalen Lysins α- und ε-13C-Dimethylamine nicht unabhängig voneinander gemessen werden kann.

Hier stellen wir zwei Methoden vor, eine chemische und eine enzymatische, um die N-terminale α-Dimethylamin und die Seitenkette ε-Dimethylamin eines N-terminalen Lysinrests zu identifizieren. Die erste Methode wurde von Córdova et al. inspiriert.die den pH-Wert verwendeten, um die Selektivität der Proteinacetylierungzu kontrollieren 35. Die Reaktion begünstigt das N-terminale α-Amin bei niedrigem pH-Wert und die Seitenkette ε-Amine bei hohem pH-Wert, so dass die Protein-α- und ε-Aminogruppen in ihren Studien mit Kapillarelektrophoreseunterschieden werden konnten 35. Wir zeigen, wie ein hoher und niedriger pH-Wert verwendet wird, um die Markierung von Proteinaminogruppen mit Hilfe der reduktiven 13-C-Methylierungsreaktion zu verändern und die Anwendung der MS-gestützten Zuordnungsstrategie zu ermöglichen. Die zweite Methode zur Zuordnung der N-terminalen α- und ε-13C-Dimethylamine nutzt die selektive Entfernung der N-terminalen Rückstände unter Verwendung der rekombinanten Aeromonas proteolytica-Aminopeptidase.

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Protokoll

1. Reduktive Methylierung von Lysozym

  1. Bereiten Sie 500 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers bei einem pH-Wert von 7,5 vor. Bei Raumtemperatur lagern.
  2. Markieren Sie drei 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für vollständig markierte Proben (FLS), teilweise markierte Proben mit niedrigem pH-Wert (LpH) und teilweise markierte Proben mit hohem pH-Wert (HpH).
  3. 10 mg Lysozym abwiegen und in 2 ml Natriumphosphatpuffer auflösen, um eine wässrige Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml zu erhalten. Die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, um das Formaldehyd vor dem Abbau durch Lichteinwirkung zu schützen. Geben Sie 500 μl Lysozymlösung in jedes Röhrchen.
  4. Bereiten Sie frische 1,0-M-Lösungen aus Dimethylamin-Boran-Komplex (DMAB) und 13-C-Formaldehyd vor. Bei 0 °C lagern.
  5. Für die vollständig markierte Probe wird ein molares Verhältnis von 1:10 (reaktives Amin: Formaldehyd) und für die teilweise markierten Proben ein Verhältnis von 1:5 verwendet. Alternativ kann das Verhältnis optimiert werden. Um beispielsweise die Dominanz des α-13C-Dimethylamin-Peaks bei niedrigem pH-Wert zu sehen, war ein Verhältnis von 2:7 erforderlich.
  6. Geben Sie 6,1 μl 1,0 M DMAB zu FLS, fügen Sie 3,2 μl 1,0 M DMAB zu LpH und HpH hinzu und wirbeln Sie vorsichtig vortexen. Anschließend werden 12,3 μl 1,0 M 13C-Formaldehyd zu FLS und 6,1 μl 1,0 M 13C-Formaldehyd zu LpH und HpH zugegeben. Die Reaktionsgemische werden bei 4 ΰC 2 Std. geschüttelt
    7. .
  7. Fügen Sie ein weiteres Aliquot aus 1,0 M DMAB und 13C-Formaldehyd wie im vorherigen Schritt hinzu und schütteln Sie das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4 °C für eine Gesamtreaktionszeit von 18-24 Stunden.
  8. Tauschen Sie den Puffer der Probe gegen Phosphat bei einem pH-Wert von 7,5 aus, um überschüssige Reagenzien und Nebenprodukte mit einem Zentrifugalfilter (Molekulargewichtsgrenze von 3 kDa) zu entfernen.
  9. Für die teilweise markierten Proben wird die Proben bei einem pH-Wert von 7,5 reduktiv mit natürlichem Formaldehyd methyliert, um ein homogen modifiziertes Protein zu erhalten. Bereiten Sie neue 1,0-M-Lösungen aus DMAB und Formaldehyd mit natürlicher Häufigkeit vor.
  10. Decken Sie die Probenröhrchen mit Folie ab, geben Sie 6,1 μl DMAB zu LpH und HpH hinzu und wirbeln Sie vorsichtig vortexen. Fügen Sie dann 12,3 μl Formaldehyd in natürlicher Fülle hinzu. Die Reaktionsgemische werden bei 4 °C 2 Std. geschüttelt
    11. .
  11. Fügen Sie ein weiteres Aliquot aus 1,0 M DMAB und natürlichem Formaldehyd wie im vorherigen Schritt hinzu und schütteln Sie die Reaktionsgemische über Nacht bei 4 °C für eine Gesamtreaktionszeit von 18-24 Stunden. Anschließend den Pufferwechsel in den Schritten 2.5-2.6 durchführen und 50 μg Proben bei -20 °C für MS lagern.

2. Bereiten Sie die Probe für die NMR-Analyse vor

  1. Bereiten Sie eine 2,0 M Natriumborat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,5 in H2O vor.
  2. 375 μl 2,0 M Natriumboratpufferlösung in vier konische 15-ml-Röhrchen geben. Parafilmen Sie die Spitzen und stechen Sie Löcher. Den Kolben in einen Gefrierkolben geben und die Probe einfrieren.
  3. Legen Sie die gefrorene Probe zum Trocknen auf einen Gefriertrockner. Nach dem Trocknen herausnehmen.
  4. Mit einer Pipette 15 ml D2O in jedes Röhrchen geben und mischen.
  5. Beschriften Sie drei 4-ml-Zentrifugalfilter (3 kDa Molekulargewichts-Cutoff) mit FLS, LpH und HpH und geben Sie die entsprechende Probe in die Filterröhrchen (~500 μl). Geben Sie 3,0 ml 50 mM Natriumboratpuffer bei einem pH-Wert von 8,5 in jedes Röhrchen. Für das dritte Röhrchen wird ein Ausgleichsröhrchen hergestellt und die Proben mit einer Zentrifuge mit einem 35°-Festwinkelrotor bei 4 °C und 7.500 rcf auf 500 μl konzentriert.
  6. Leeren Sie die Falle unter jedem Filter. Geben Sie weitere 3,0 ml Puffer zu den Proben und konzentrieren Sie die Proben erneut auf 500 μl. Schritt 2.5 4x wiederholen.
  7. Unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassays36 wird die Konzentration jeder Probe bestimmt. Verdünnen Sie die Lysozymproben mit 50 mM Natriumboratpuffer, um 150 μM Proben herzustellen.
  8. Übertragen Sie 530 μl auf ein 5-mm-NMR-Röhrchen oder 250 μM auf ein 5-mm-Röhrchen mit magnetischer Suszeptibilitätsanpassung.
  9. Bereiten Sie eine 80-mM-Stammlösung von 1,2-Dichlorethan-13 C2 in D2O vor. Lagern Sie diese Stammlösung bei -80 °C. Verdünnen Sie sie auf 24 mM in 80 μl und überführen Sie sie in ein koaxiales Einsatzröhrchen, um es als Referenz für die NMR-Analyse zu verwenden. Analysieren Sie die Proben mit NMR. Hinweis: Lassen Sie einen 1D 1 H-13C HSQC laufen und integrieren Sie die Peakbereiche für jede Resonanz. Die Peakbereiche sollten bei vollständig beschrifteten Proben gleich sein.

3. Aminopeptidase-Abbau von Lysozym

  1. Bereiten Sie eine 5 mg/ml Lösung von Lysozym in Reinstwasser vor.
  2. 250 μl der Lysozymlösung in ein sauberes 1-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
  3. 25 μl einer 0,1 M Tricinlösung mit einem pH-Wert von 8,0 und 6 μl einer Aeromonas proteolytica Aminopeptidase-Lösung mit 2,16 μg/ml zugeben.
  4. 6 Std. bei 37 °C inkubieren.
  5. Geben Sie der Probe weitere 6 μl der Aminopeptidase-Lösung von 2,16 μg/ml zu, um ein molares Verhältnis von Aminopeptidase zu Lysozym von 1:50 zu erhalten. Weitere 20 Stunden bei 37 °C inkubieren.
  6. Entsalzen Sie 30 μl der Probe mit einer C18-Spin-Säule (gemäß dem Protokoll des Herstellers). Für die MALDI MS-Analyse bei -20 °C lagern.
  7. Bereiten Sie die verbleibende Proteinprobe für die NMR vor, wie in Protokoll 2 beschrieben).

4. Proben für die Massenspektrometrie vorbereiten

  1. Unter Verwendung der in Schritt 2.3 reservierten 50 μg Probe wird der Puffer gegen 100 mM Ammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 8,0 ausgetauscht und mit einem 1-ml-Zentrifugalfilter (Molekulargewichts-Cut-off von 3 kDa) auf ca. 50 μl konzentriert. Übertragen Sie die Probe in ein 1-ml-Zentrifugenröhrchen und wickeln Sie sie in Alufolie ein.
  2. Fügen Sie 2,0 μl 500 mM Dithiothreitol hinzu, um die Disulfidbindungen zu reduzieren. Die Lösung 1 Stunde lang bei 60 °C inkubieren.
  3. Fügen Sie 2 μl frisch zubereitetes 500 mM Iodacetamid hinzu, um die Thiolgruppen zu alkylatieren. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Folie und fügen Sie 1,0 μl der 500 mM Dithiothreitollösung hinzu, um die Reaktion zu löschen.
  5. Fügen Sie 2,0 μg Trypsin in Sequenzierqualität hinzu, um das Protein zu verdauen. Die Mischung bei 37 °C 16-24 Stunden inkubieren.
  6. Fügen Sie TFA hinzu, bis der pH-Wert unter 2 liegt, um den Aufschluss zu löschen. (Ameisensäure und Essigsäure können ebenfalls verwendet werden)
  7. Entsalzen Sie die Probe auf einer C18-Spin-Säule und eluieren Sie das Protein in 80 % Acetonitril/0,1 % TFA. Trocknen Sie die Probe mit einem Vakuumkonzentrator.
  8. Rekonstituieren Sie die Probe in 5,0 μl 50 % Acetonitril/0,1 % TFA für die MALDI-MS-Analyse. Mischen Sie gleiche Volumina der rekonstituierten Probe und eine gesättigte Lösung aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Matrixlösung auf der MALDI-Zielplatte. Analysieren Sie die Proben auf einem MALDI MS. Hinweis: Verwenden Sie Tandem-MS, um die Identität der Peptidpeaks zu bestätigen. Glätten Sie die Massenspektren und analysieren Sie. Bestimmen Sie für jedes dimethylaminhaltige Peptid die Peakintensität und die Peakfläche jedes Isotops im Profil. Berechnen Sie den prozentualen Anteil von 13C-Inkorporation wie zuvor beschrieben34.

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Ergebnisse

Reduktive Methylierung und pH

Eine pH-abhängige chemoselektive reduktive 13C-Methylierungsreaktion wurde an Lysozym demonstriert. Bei niedrigem pH bevorzugt die Reaktion das N-terminale α-Amin gegenüber den Seitenketten-ε-Aminen, während bei hohem pH das Gegenteil gilt. In Lösung liegen die Aminogruppen des Proteins im Gleichgewicht zwischen der freien Aminform und der konjugierten Säure vor, wobei dieses Gleichgewicht durch den pH-Wert beeinflusst werden kann. Der optimale pH...

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Diskussion

Die Zuordnung der NMR-Signale von reduktiven 13C-methylierten Proteinen ist notwendig, um diese Isotopenmarkierungsmethode vollständig nutzen zu können. Die Verwendung von MS zur Unterstützung der Zuordnung der NMR-Signale durch Korrelation der partiellen 13-C-Inkorporationsdaten ist eine vielversprechende Technik. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Zuordnungsmethoden besteht darin, dass nur die primäre Aminosäuresequenz benötigt wird. Die MS-gestützte Zuordnungsmethode ist eingeschränkt, ...

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Offenlegungen

Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Auszeichnung Nummer R00RR024105 des National Center For Research Resources, National Institute of Health.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonitrilSigma34851
Amicon Ultra 4 ml Zentrifugalfilter (3k MWCO)Fisher ScientificUFC800308 (8pk)
AminopeptidaseCreative BiomartAminopeptidase-86A
AmmoniumbicarbonatSigmaA6141
AmmoniumsulfatSigmaA5132
Boran-Dimethylamin-KomplexSigma180238Vor Gebrauch eine frische 1 M Lösung herstellen.
BorsäureSigmaB6768
Pankreasinsulin für RinderSigmaI5500
C18 Spin-SäulenThermo Scientific89870
DeuteriumoxidCambridge Isotope LaboratoriesDLM-4-100
1,2-Dichlorethan-13C2Sigma71432180 mM Stammlösung, gelagert bei -80 μC. Verwendung als Referenz in NMR-Spektren bei 24 mM.
Formaldehyd (36,5 Gew.-%)Sigma33220Vor Gebrauch eine frische 1 M Lösung herstellen.
13C-Formaldehyd (99%)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-806-1Vor Gebrauch eine frische 1 M Lösung herstellen.
Lysozym (Hühnereiweiß)SigmaL6376
Natriumphosphat (zweibasisches Heptahydrat)SigmaS9390
Natriumphosphat (einbasisch)SigmaS9638
TricinSigmaT0377
TrifluoressigsäureSigma302031
700 MHz Varian VNMRS mit 5 mm HCN 5922 SondeAgilent Technologien
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker

Referenzen

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

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