Caenorhabditis ele ist ein nützliches Modell, um die Funktionen der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Entwicklung und Physiologie zu erforschen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zur Ergänzung des C. elegans Ernährung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
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Methodenartikel
Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fettsäuren sind für eine Vielzahl von Zellfunktionen unerlässlich. Sie dienen als effiziente Energiespeichermoleküle bilden den hydrophoben Kern von Membranen, und beteiligen sich an verschiedenen Signalwege. Caenorhabditis elegans synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6-und Omega-3-Fettsäuren zu produzieren. Dies, kombiniert mit der einfachen Anatomie und Umfang der verfügbaren genetischen Werkzeugen, machen es zu einem attraktiven Modell zur Fettsäure-Funktion zu untersuchen. Um die genetischen Ursachen, die die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren vermitteln zu untersuchen, haben wir ein Verfahren, um die C ergänzen entwickelten elegans Diät mit ungesättigten Fettsäuren. Nahrungsergänzung ist ein wirksames Mittel, um die Fettsäurezusammensetzung von Würmern zu ändern und kann auch verwendet werden, um Defekte in Fettsäure-Mutanten zu retten. Unsere Methode verwendet Nematoden Wachstumsmedium-Agar (NGM) mit Fett acidsodium Salze ergänzt. Die Fettsäuren in den Platten ergänzt werden InkorporationTED in den Membranen der Bakterienlebensmittelquelle, die dann von der C aufgenommen elegans ergänzt, die auf den Bakterien ernähren. Wir beschreiben auch ein Gaschromatographie-Protokoll, um die Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung, die ergänzt Würmer auftreten überwachen. Dies ist eine effiziente Möglichkeit, die Diäten von großen und kleinen Populationen von C. ergänzen elegans, so dass für eine Reihe von Anwendungen für diese Methode.
Einleitung
Fettsäuren sind wesentliche strukturelle Bestandteile von Membranen sowie effiziente Energiespeichermolekülen. Zusätzlich können Fettsäuren aus Zellmembranen durch Lipasen gespalten werden und enzymatisch modifiziert, um Signalisierungs Effektoren 1 herzustellen. Natürlich vorkommenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) zwei oder mehr cis-Doppelbindungen. Die Omega-3-Fettsäuren und die Omega-6-Fettsäuren sind voneinander unterscheiden, basierend auf den Positionen der Doppelbindungen in Bezug auf die Methylende der Fettsäure. Gesunde Ernährung benötigen sowohl Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren. Allerdings sind westliche Ernährung besonders rei....
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Protokoll
Mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind empfindlich gegen Hitze, Licht und Sauerstoff. Daher muss darauf bei der Vorbereitung Fettsäure-Supplementierung Platten genommen werden, dass Fettsäuren nicht, um überschüssige Wärme und Licht ausgesetzt ist. NGM-Medium, enthaltend 0,1% Tergitol (NP-40) wird autoklaviert und teilweise abgekühlt, wonach Fettsäure Natriumsalze unter konstantem Rühren zugegeben. Die Platten können in der Dunkelheit trocknen. Aufnahme von Fettsäuren von C elegans kultiviert auf diesen Platten kann dann durch Gaschromatographie verfolgt werden.
1. Herstellung von Fettsäure Ergänzte Medien
- Messen Sie Me....
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Ergebnisse
Ergänzung des C. elegans Diät wird durch die Fähigkeit der bakteriellen Nahrungsquelle in der Bakterienmembran zu integrieren Aufnahme und Fettsäure beschränkt. Um die Fähigkeit von E. bestimmen coli OP50 verschiedenen Fettsäuren in ihre Membranen aufzunehmen, OP50 wurde auf Medien ohne Ergänzung, 0,1 mM und 0,3 mM Konzentrationen von Stearinsäure (18.00), Natriumoleat (18.01 n-9) und Natrium DGLA (20 plattiert : 3n-6). Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 2 Tage im Dunkeln getrocknet und.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Ergänzung von C. elegans mit ungesättigten Fettsäuren. Wie oben erwähnt, muß bei der Herstellung von PUFA ergänzt Platten genommen werden, da die reaktive Natur der Doppelbindungen in PUFAs bewirkt diese Fettsäuren oxidationsempfindlich sein, durch Hitze und Licht 11. Um Oxidation zu vermeiden, ist es wichtig, die PUFA zu dem flüssigen Agar-Medium hinzugefügt, nachdem das Medium auf 55 ° C und speichert Platten in einer dunklen Umgebung gekühlt.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Wir danken Chris Webster für die Durchführung der Vorversuche in Abbildung 3 der repräsentativen Ergebnisse und Jason Watts und Chris Webster gezeigt für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Die Finanzierung für diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Institutes of Health (USA) (R01DK074114), um JLW Verfügung gestellt. Einige Nematodenstämmen in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, die von der NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440) gefördert wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Trypton | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterin | Sigma | C8667-25G | (5 mg/ml in Ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Natriumdihomogamma-Linolenat | NuCHEK | S-1143 | |
| Warmes steriles Millipore-Wasser | |||
| Steriles Wasser zum Sammeln von Würmern | |||
| Nukleasefreies Wasser für DGLA-Stammlösung | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in Wasser (für RNAi-Platten) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in Wasser (für RNAi-Platten) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexan | Fisher Scientific | H302-4 | |
| Diamindinophenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glaskolben | Corning | 4980-2L | |
| Autoklavierbare Glasflaschen mit Rührstäben | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoklavierbarer Messzylinder aus Glas | Fisherbrand | 08-557 | |
| Rührplatte | VWR | 97042-642 | |
| Wasserbad bei 55+ &Grad; C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Schraubverschluss Braunglas Fläschchen | Sun SRI | 200 494 | |
| Argongastank | |||
| Automatisierte Pipettenhilfe | Pipettenhilfe | P-90297 | |
| Sterile serologische Pipetten (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsenbrenner | VWR | 89038-534 | |
| Dissektionsmikroskop | Leica | ||
| Silanisiertes Glasröhrchen | Thermo Scientific | STT-13100-S | für FAMEs Ableitung |
| PTFE Schraubverschlüsse | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Klinische Tischzentrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Fläschchen | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Fläschcheneinsatz | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Fläschchenkappe | SUN SRi | 200 100 | |
| Gaschromatograph | Agilent | 7890A | |
| Massenspektrometrie-Detektor | Agilent | 5975C | |
| Säule für Gaschromatographie | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0,25 mm Quarzglas-Kapillarsäule |
Referenzen
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
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Nachdrucke und Genehmigungen
