Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Zusammenfassung

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Zusammenfassung

Neuere Arbeiten zeigen, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) Regeneration und Tumorgenese beinhaltet Populationen von Stammzellen (SC) mit Wohnsitz im erwachsenen Gehirn. Aber die Mechanismen, diese normalerweise ruhenden Zellen beschäftigen, um die ordnungsgemäße Funktionsweise von neuronalen Netzwerken, sowie ihre Rolle in der Erholung von Verletzungen und Eindämmung von neurodegenerativen Prozessen sicherzustellen wenig verstanden. Diese Zellen befinden sich in Regionen als "Nischen", die eine tragende Umwelt mit modulierenden Signale sowohl von der Gefäß-und Immunsystem bieten bezeichnet. Die Isolierung, die Wartung und die Differenzierung von ZNS VZ unter definierten Kulturbedingungen, die unbekannte Faktoren auszuschließen, zugänglich macht Behandlung durch pharmakologische oder genetische Mittel, um Einblicke in ihre in vivo-Verhalten. Hier bieten wir detaillierte Informationen über die Methoden zur Erzeugung von Kulturen von ZNS-VZ aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns und Ansätze zu ihrer d beurteilenifferentiation Potential in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in vitro. Diese Technik ergibt eine homogene Zellpopulation als eine Monokultur, die sichtbar auf einzelne SCs und ihre Nachkommen zu untersuchen. Darüber hinaus kann es in verschiedenen Tiermodellsystemen und klinischen Proben angewendet werden kann, wobei zuvor zur regenerativen Antworten in der geschädigten adulten Nervensystems vorherzusagen.

Einleitung

Das zentrale Dogma der Neurobiologie, den von den grundlegenden Beobachtungen des Gehirns Zytoarchitektur von Ramón Y. Cajal vor über einem Jahrhundert gemacht gelegt, entschieden, dass die Neurogenese unwahrscheinlich war, nach der Adoleszenz angesichts der Komplexität der neuronalen Netze im ZNS ¹ gefunden. Trotz der Arbeit von Altman in den 1960er Jahren und später Kaplan, die zeigen, dass ³ H-Thymidin konnte in reifen Neuronen darauf hinweist, dass in der Tat Neuronen wurden in verschiedenen Bereichen des erwachsenen Gehirns erzeugt gefunden werden, das Dogma weiterhin halten ^{2, 3.} Evidence weiterhin mit Forschungs Nottebohms die jahreszeitlichen Veränderungen in der Anzahl der Singvogel in Gehirnen ⁴ vorhanden Neuronen beschreiben, zu montieren. Es war nicht bis 1999, als Gould et al. Veröffentlichten Arbeiten über die Erzeugung von Neuronen im Hippocampus steigt mit der Leistung der assoziativen Lernaufgaben in Ratte, sowie die Beobachtungen von Kornack und Rakic ​​DemonstrationTing fortgesetzt Neurogenese im erwachsenen Makaken, die das Konzept einer weniger starren, plastischer Gehirn wurde erkannt ^{5, 6.}

Die Suche nach der zellulären Quelle für diese de novo generierten Neuronen führen zur Entdeckung einer diskreten Population von Stammzellen (VZ), die in Bereichen des Gehirns befinden sich die als Nischen ^7. Die Subventrikularzone und Unter körnige Zone des Hippocampus gelten als die beiden wichtigsten neurogenen Regionen ^8,9 sein. Zellen aus diesen Standorten isoliert zeigen die klassische Merkmal der embryonalen oder fötalen abgeleitet VZ, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial. Im Fall von neuralen Stammzellen (NSC), können sie in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Darüber hinaus sind diese VZ Fleck positive fötale NSC Marker wie der Zwischen Filamentprotein Nestin ^10. Neuere Arbeiten betont, dass SCs vielleicht nicht zu diesen t begrenzt werdenWO Bereiche auf und sind in der Tat im gesamten Gehirn lokalisiert als weitgehend ruhenden Zellpopulation fest mit dem Gefäßsystem ¹¹ verbunden.

Die Beobachtungen, die VZ in Reaktion auf eine Verletzung mobilisiert legt die Möglichkeit, in der Lage, diese Zellen für regenerative Zwecke zu nutzen, um bei der Rückgewinnung von neurodegenerativen Erkrankung und Schlaganfall ^{12, 13} zu unterstützen. Das ist nicht anders als die Rolle, die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) bei der Heilung von Bindegewebe spielen, die als perivaskuläre Zellen, die das Potenzial haben, Osteoblasten, Chondrozyten, und Fettzellen werden ¹⁴ zu finden sind. Jedoch NSC nicht in der gleichen Weise wie MSCs aus dem Knochenmark durch Routine Aspiration und Dichtegradientenzentrifugation Techniken geerntet und anschließend in autologe Zelltherapien verwendet. Als Folge müssen auch andere Zellen, wie etwa die Verwendung von fetalen NSC oder neuronalen Vorläuferzellen abgeleitet von embryonic Stammzellen wurden ausführlich in der Tier Krankheiten und Verletzungen Modelle mit unterschiedlichem Erfolg ¹⁵ erforscht. Induzierte pluripotente Stammzellen-Technologien nutzen somatischen Zellquellen bieten eine weitere Möglichkeit dazu bietet der zur Herstellung therapeutisch nützlichen Zell-basierte Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen, die Überwindung der begrenzten Verfügbarkeit und ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung von embryonalen Zellen und fetalen Gewebe ^16. Allerdings klinische Umsetzung dieser Erkenntnisse hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, wie in den Kämpfen der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen mit SC-basierten therapeutischen Ansätze gezeigt, ^17,18 sowie einen gewundenen Pfad zu Regulierungsfreiheit. Als Alternative kann die Einführung von spezifischen pharmakologischen Behandlungen NSC Zahlen modulieren und zu erleichtern Erholung in Modellen der Parkinson-Krankheit und Schlaganfall ^19. Was auch immer die Strategie könnte sein, zu verstehen, wie diese Zellen effektiv zu manipulierenerfordert eine in vitro-System zugänglich.

Kulturen von NSC kann entweder als Aggregatkulturen, auch bekannt als Neurosphären, oder als Monoschicht ^8,20 durchgeführt werden. Beide Verfahren sind weit verbreitet, die die Einführung von definierten Kulturbedingungen, zB die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) als Mitogen Quelle, die für die Expansion von multi Vorstufen bereitzustellen. Während Neurosphärenkulturen zur Untersuchung klonale Vermehrung Fähigkeit eines isolierten Zelltyp besser geeignet ist das System gezeigt, um eine gemischte Population von Zellen während der Expansion ²¹ zu erzeugen. Darüber hinaus ist die geschlossene Struktur von Neurosphären die pharmakologische Manipulation der Zellen unpraktisch, und die Interpretation der Einfluss diese Faktoren haben könnten, aufgrund der in der Neurosphäre etabliert Mikroumgebung verwechselt werden. Monolayer-Kulturen, andererseits kann seinin der Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Signalübertragungsmechanismen, die SC Wachstum und Differenzierung regulieren und eröffnet die Möglichkeit, neue Verbindungen, die speziell auf diese Zellpopulation entdecken, zu erkunden.

Als Folge kann die Fähigkeit, reproduzierbar Kulturen adulter NSC aus unterschiedlichen Bereichen von Interesse im Gehirn generiert in einem breiten Spektrum von Forschungsanwendungen verwendet werden, die von Entwicklungsstudien des zentralen Nervensystems (ZNS) zu erforschen neuartige regenerative Medizin Ansätze . Die hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie zu sezieren und bewerten die Differenzierungspotenzial von ZNS-VZ von der erwachsenen Gehirn von Nagetieren isoliert.

Protokoll

Die Arbeit hält sich an die Erklärung der Helsinski und der ARVO Tiererklärung. Die Tiere wurden für die Gewebesammlung nach den Anweisungen der Tierhaltung an der Universität Dresden verwendet und alle relevanten Methoden verfolgt. Die Tiere wurden behandelt und untergebracht nach den Bundesrichtlinien für die Nutzung und Pflege von Labortieren, und die Studie wurde von der Landesdirektion Dresden genehmigt. Bitte wenden Sie sich an die Veterinärpolitik Ihrer Institution (IACUC oder andere board) zu entsprechenden Euthanasie-Methodik.

Besondere Lager-und Arbeits Konzentrationen der Reagenzien in den dieses Protokoll beigefügten Tabellen Reagenz gefunden werden.

1. Kulturschale Vorbereitung

1. Coat Gerichte mit einem ausreichenden Volumen von 75 ug / ml Poly-L-Ornithin (dh 2 ml / Well einer 6-Well-Platte) über Nacht in der Zellkultur-Inkubator 2 Tage vor dem geplanten Datum Dissektion.
2. Absaugen des Poly-L-Ornithin am nächsten Tag waschen und jede Vertiefung 2x mit 3 ml PBS für 5 min.
3. Nehmen Sie die letzte Wäsche, dann fügen Fibronektin (1:250 verdünnt, 4 ug / ml in PBS) auf die Platte und legen die Gerichte in den Inkubator über Nacht.
4. Saugen Sie den Fibronektin am Tag der Präparation und waschen das Geschirr 2x mit PBS. Bringen Sie die Platten noch mit der endgültigen PBS zu waschen, um den Brutschrank, bis die dissoziierten Gewebe ist bereit für die Kultivierung. Zu dieser Zeit, entfernen Sie die PBS vor, um die Gewebebeschichtung.
5. Mit Poly-L-ornithinein den Inkubator für bis zu 3 Wochen beschichtet Speicher-Platten. Platten mit Fibronectin beschichtet ist, kann für bis zu 1 Woche gelagert werden. Fibronektin-Beschichtung kann in weniger als 2 Stunden durchgeführt werden, wenn dringend. Fibronektin ist anfällig für Denaturierung, nicht die Lösung zu rühren oder lassen Geschirr trocknen.

2. Dissection / Auflage

1. Dieses Protokoll gilt für die Verwendung von 3 erwachsenen Ratten (3-6 Monate alt).
2. Chill das Gehirn vor dem Einschläfern die Ratte Schnittblock auf Eis.
3. Legen Sie ein 15 ml-Falcon-Röhrchen, die 5 ml N2 Medium mit bFGF auf Eis enthält.
4. Euthanize die Ratten nach Veterinärpolitik Ihrer Einrichtung.
5. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch einen Einschnitt auf der Mittellinie des Kopfes. Verwenden Pinzette abziehen der Knochen so dass für das Gehirn vorsichtig herausgezogen werden.
6. Legen Sie das Gehirn in einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS. Dadurch werden alle Rest Haar und Blut zu entfernen. (1A)
7. Legen Sie das Gehirn in den Schneideblock gekühlt. (1B)
8. Stecken Sie eine neue, saubere Rasierklinge in den Block wie in 1C dargestellt.
9. Legen Sie eine zweite saubere Rasierklinge 3 mm kaudal der ersten wie in 1D dargestellt.
10. Die Blätter vorsichtig anheben aus dem Block, und mit ihnen den Abschnitt von Interesse.
11. Float der SECTion vor der Klinge durch Eintauchen in PBS. (1E)
12. Ernte Gewebe aus dem Bereich von Interesse (in diesem Beispiel verwendeten wir die vordere Kommissur (anterior) ACA, 1F) unter Verwendung von # 5 Pinzette und Sammeln in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml N2-Medium, das bFGF.
13. Bewegen des Rohres in einer laminaren Strömung Zellkulturhaube, weiterhin den Rest des Protokolls unter sterilen Bedingungen.
14. Mechanisch distanzieren das Gewebe mit einer 1 ml Pipettenspitze auf eine P1000 Pipette befestigt. Pipette nach oben und unten mehrmals (ca. 20x mit einer Rate von 1 Pipettieren Zyklus pro Sekunde), während Sie die Öffnung der Pipettenspitze an der Unterseite des konischen Rohrs (Abbildungen 1G 1-3). Verreiben stoppen, wenn die Lösung homogen.
15. Lassen Sie die Lösung für 2 Minuten ruhen lassen, damit ein größeres nondissociated Gewebe am Boden absetzen. (1G 4)
16. Sammeln Sie die homogeneous Überstand und in einen konischen Röhrchen mit 8,5 ml N2 Medien plus 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 und 200 nMJAK Inhibitor.
17. Platten sie in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 3 ml verdünnten Zelllösung / gut.
18. Die Platte wird in einer befeuchteten Zell Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2, 5% O _2.

3. Daily Care

1. Ersetzen Sie das Medium, auf den Kulturschalen mit N2-Medium, das bFGF, Ang2, Dll4 und JAK Inhibitor 24 Stunden nach dem Ausstreichen.
2. Fügen Sie einen Bolus von bFGF, Dll4, Ang2 und JAK-Inhibitor auf den nächsten Tag.
3. Setzen Sie diesen Wechsel Prozess der Medienwechsel und Ergänzungen Faktor für insgesamt 10-14 Tage.

4. Induktion der Differenzierung

1. Ziehen bFGF, Dll4, Ang2 und JAK-Inhibitor enthält, mittel-und ersetzen Sie es mit N2-Medium, das keine zusätzliche Faktoren enthält.
2. Ändern Sie jeden zweiten Tag das Medium.
3. Befestigen Sie die Zellen nach 10 Tagen und durchzuführen, Immunzytochemie.

5. Immunzytochemische Erkennung

1. Saugen Sie das Medium und fixieren Zellkultur-Platten mit 2 ml 4% Paraformaldehyd für 20 min.
2. Wasch 2x mit 3 ml PBS für jeweils 5 min.
3. Aspirat PBS permeabilisiert und dann blockieren die Zellen durch Zugabe von 2 ml PBS mit 5% normalem Eselserum (NDS) und 0,1% Triton X-100 für 20 min.
4. Bereiten Sie den primären Antikörper-Mix in PBS mit 5% NDS. Anti-Nestin-Antikörpers zur Identifizierung VZ verwendet werden, während TuJ1 (Klasse III β-Tubulin), GFAP und CNPase Antikörper können zusammen für eine Dreifachfärbung von Differenzierungsmarkern verwendet werden.
5. Absaugen Blockierungslösung und 1,5 ml der primären Antikörpermischung in jedes Well. Inkubieren bei Raumtemperatur für 90 min.
6. Entfernen der Primärantikörper und 2x Waschen mit 3 ml PBS, und 1x mit 3 ml PBS, enthaltend 5% NDS für jeweils 5 Minuten.
7. Prepare die Sekundärantikörper in PBS mit 5% NDS.
8. Saugen Sie den letzten Waschen und fügen Sie 1,5 ml Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln für 40 min bei Raumtemperatur.
9. Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und 2 ml einer frisch hergestellten DAPI-Färbung (500 ng / ml in PBS). Inkubation für 3 min.
10. Saugen Sie den DAPI-Lösung dann waschen 3x mit 3 ml PBS für jeweils 5 min. Die Zellen können nun mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Ergebnisse

Identifizieren des interessierenden Bereichs, von dem neuralen Stammzellen zu ernten ist die kritische erste Stufe und die Zeit, die es braucht, um einen konfluenten Platte von Zellen zu definieren. Zum Beispiel ist das SVZ eine klassische neurogener Bereich und hat daher einen höheren relativen Anteil von neuralen Stammzellen. Jedoch kann das hier vorgestellte Verfahren mit anderen Regionen nicht oft eine robuste neurogene Potential im Erwachsenenalter erkannt werden. Für die Zwecke dieses Protokolls haben wir die Comm...

Diskussion

Viele der Schritte für eine erfolgreiche Isolierung, Expansion und Differenzierung von neuronalen Stammzellen aus adulten Gehirn sind gemeinsam mit Standardgewebekulturtechniken geteilt. Das Ziel zu bedenken ist, dass NSCs aus dem erwachsenen Gehirn isoliert als viele ihrer in-vivo-Eigenschaften wie möglich (2J) zu halten. Oft ist eine Balance zwischen notwendigen Vorsicht und angemessener Geschwindigkeit muss gefunden werden. Pflege mit der Isolierung des Gehirn aus dem Schädel machen die Iden...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Gewebekulturschalen	BD Biosciences	353934
Poly-L-Ornithin	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml Stammlösung, hergestellt in doppelt destilliertem Wasser (mehrere Monate stabil bei -20 & Grad; C). Arbeitskonzentration 0,5 mg/ml in Wasser (Stabil für 1 Monat bei 4 > C).
Fibronektin	R& D Systems	1030-Fn	rühren Stammlösung
Filtrationsapparat	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	Siehe Hinweis unten für die vollständige Vorbereitung des N2-Mediums
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M Stammlösung in ddH2O (stabil bei 20 &de; C für 6 Monate)
Natriumselenit	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µ M Stammlösung in ddH2O (stabil bei -20 ° C für 6 Monate)
Progesteron	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µ M Stammlösung in Ethanol (stabil bei -20°; C für 6 Monate)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Mediatech	21-040-CV
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	R& D Systems	233-FB	Arbeitskonzentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R& D Systems	1389-D4	Arbeitskonzentration & nbsp; 500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	F& D Systems	623-AN	Arbeitskonzentration & nbsp; 500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Arbeitskonzentration 200 nM & nbsp;
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- und 50-ml-Konische Röhrchen	Corning Life Sciences	430053, 430829
Weitere notwendige Gegenstände sind: Allgemeine Sezierinstrumente, einschließlich Rasierklinge und Pinzette, Erwachsene Ratte (3-6 Monate alt; Sprague-Dawley oder Long Evans), CO2 Intoxikationskammer, Laminar-Flow-Haube für Zellkultur und Inkubator Inkubator (befeuchtet, 37 Grad; C, 5 % CO2, 5 % O2). Hinweis: Für eine vollständige Aufbereitung des N2-Mediums geben Sie zu einer Flasche DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g Apotransferin, 0,0125 g Insulin (frisch vorgelöst in 1 ml 10 mM NaOH), 50 μm; L von Putrescin, 30 μ l Natriumselenit, 100 μ l Progesteronaktien und 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 7,2 ein. Filtersterilisieren und bei 4 Grad lagern; C bis zu 3 Wochen einwirken lassen und vor Licht schützen.
Immunfluoreszenz-Reagenzien Tabelle
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	15719
Normales Eselserum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml Lager Lösung in Methanol
Primäre Antikörpertabelle
Nestin	Chemicon	MAB353	Verdünnungsfaktor: 1:400 Spezies: Maus IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Verdünnungsfaktor: 1:100 Spezies: Kaninchen IgG
Sox2	R& D		Systems MAB2018 Verdünnungsfaktor: 1:100 Spezies: Maus IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Maus IgG1
β-Tubulin III (TUJ1)	R& D Systems	MAB1195	Verdünnungsfaktor: 1:500 Spezies: Maus IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako Nordamerika	Z0334	Verdünnungsfaktor 1:500 Spezies: Kaninchen
Sekundäre Antikörpertabelle
Alexa    568	Invitrogen	A-21124	Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Ziege anti Maus IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Ziege anti Maus IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Ziege anti Rabbit

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