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Methodenartikel

Gestaltung Silk-Seidenprotein-Legierungen für biomedizinische Anwendungen

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DOI:

10.3791/50891

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13. August 2014

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1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Blending ist ein effizienter Ansatz zur Biomaterialien mit einem breiten Spektrum von Eigenschaften und Funktionen kombiniert erzeugen. Durch die Vorhersage der molekularen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen natürlichen Seidenproteinen, können neue Seide-Seidenprotein-Legierung Plattformen mit einstellbaren mechanischen Elastizität, elektrische Antwort, optische Transparenz, chemische Verarbeitbarkeit, biologische Abbaubarkeit oder thermische Stabilität ausgelegt werden.

Zusammenfassung

Faserproteine ​​zeigen unterschiedliche Sequenzen und Strukturen, die für verschiedene Anwendungen in biomedizinischen Bereichen wie Biosensoren, Nanomedizin, Geweberegeneration und Drug-Delivery verwendet wurden. Entwicklung von Materialien auf der Basis der molekularen Maßstab Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen wird Ihnen helfen zu generieren neue multifunktionale Protein-Legierung Biomaterialien mit einstellbaren Eigenschaften. Solche Legierungsmaterial Systeme bieten auch Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen synthetischen Polymeren durch die Materialien biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Haltbarkeit im Körper. Dieser Artikel verwendete die Proteinmischungen von Wild Tussahseide (Antheraea pernyi) und inländischen Maulbeerseide (Bombyx mori) als Beispiel, um nützliche Protokolle zu diesen Themen, darunter, wie Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch computergestützte Methoden, wie man Protein Legierung herzustellen vorherzusagen bieten Lösungen, wie Legierungssystemen durch thermische Analyse zu überprüfen, und zum variablen Legierungsmaterialien herzustelleneinschließlich der optischen Materialien mit Beugungsgitter, elektrische Materialien mit Schaltungen Beschichtungen und pharmazeutische Materialien für Drogenfreigabe und Auslieferung. Diese Methoden können wichtige Informationen für die Gestaltung der nächsten Generation multifunktionalen Biomaterialien auf der Basis verschiedener Protein-Legierungen bieten.

Einleitung

Natur Strategien entwickelt, um abstimmbare und multifunktionale biologischen Matrices unter Verwendung einer begrenzten Anzahl von Strukturproteinen zu erzeugen. Beispielsweise Elastin und Kollagen werden immer zusammen in vivo verwendet werden, um die einstellbaren Stärken und Funktionen für spezifische Gewebe 1,2 erforderlich ist. Der Schlüssel zu dieser Strategie ist die Vermischung. Blending das Mischen Proteine ​​mit spezifischen Verhältnissen und ist ein technologischer Ansatz zur einfachen Materialsysteme mit einstellbaren Eigenschaften und abwechslungsreiches 3-5 zu generieren. Verglichen mit Kunsttechnik Strategien 6,7 können auch Misch verbessern Gleichförmigkeit Materials und die Fähigkeit, das Material aufgrund der einfachen Bedienung 8-16 verarbeiten. Daher Gestaltung multifunktional, biokompatible Proteinlegierungsmaterialien ist ein aufstrebendes Gebiet der medizinischen Forschung. Diese Technologie wird auch systematisches Wissen über die Auswirkungen der natürlichen Protein Matrizen auf Zell-und Gewebefunktionen sowohl in vitro und in vivo 10,17. Durch die Optimierung des Molekular Schnittstellen zwischen verschiedenen Proteine, Protein-basierten Legierungsmaterialien eine Reihe von Körperfunktionen, wie zum Beispiel thermische Stabilität bei verschiedenen Temperaturen, Elastizität, verschiedene Gewebe, elektrische Empfindlichkeit variabel Organe zu unterstützen und optische Eigenschaften für die Hornhautgeweberegeneration 3 umfassen, 18-27. Das Ergebnis dieser Studien wird eine neue Protein-Materialien-Plattform auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung mit direkter Relevanz für abstimmbare Gewebe repariert und Krankheitsbehandlungen und weitere führen zu biologisch abbaubaren Implantaten, wo ihre neue therapeutische und diagnostische Funktionen vorstellbar 3 werden kann.

Viele natürliche Strukturproteine ​​haben kritische physikalische und bioaktiven Eigenschaften, die als Kandidaten für die Biomaterial-Matrizen ausgenutzt werden können. Seide aus verschiedenen Wurmarten, Keratine von Haaren und Wolle, Elastine und Kollagene aus verschiedenen Geweben undverschiedene Pflanzenproteine ​​sind einige der häufigsten Strukturproteinen für die Gestaltung variablen Materialien auf Proteinbasis (1), 18-27 verwendet. Im Allgemeinen können diese Proteine ​​unterschiedlichen Molekularsekundärstrukturen (zB Beta-Faltblätter für Seide, oder Spiralspulen für Keratine) aufgrund ihrer einzigartigen wiederholende primären Aminosäuresequenzen 3,28-35 bilden. Diese Eigenschaften fördern die Bildung von selbstorganisierten Strukturen makroskopischen mit einzigartigen Funktionen auf biologischen Schnittstellen aufgefordert ihre Nützlichkeit als wertvollen Ressource von Biopolymermaterialien. Hier sind zwei Arten von Strukturproteinen eingesetzt wurden (Protein A aus Wild Tussahseide und Protein B von domestizierten Maulbeerseide als Beispiel), die allgemeinen Protokolle der Herstellung von verschiedenen Protein-Legierung Biomaterialien zu demonstrieren. Die gezeigten Protokolle sind Teil 1: Protein-Interaktionsvorhersagen und Simulationen, Teil 2: Produktion von Protein-Legierung Lösungen und Teil 3: Herstellung von Protein-LegierungSysteme und für die optische, elektrische und pharmazeutische Anwendungen.

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Abbildung 1. Rohstoffe verschiedener Strukturproteine, die häufig in unserem Labor für die Gestaltung von Materialien auf Proteinbasis, einschließlich Seide aus verschiedenen Wurmarten verwendet werden, Keratine von Haaren und Wolle, Elastine aus verschiedenen Geweben und verschiedene Pflanzenproteine.

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Protokoll

1. Vorhersage von Protein-Wechselwirkungen

  1. Bioinformatik-Analyse von Proteinmolekülen
    1. Besuchen Sie das National Center for Biotechnology Information Website (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) und suchen Sie die Protein-Namen, die für die Legierung Studie verwendet werden soll. Hinweis: Bei diesem Beispiel werden zwei Proteine ​​verwendet wurden: Protein A, die das wilde tussah Seidenfibroins ist, und Protein B, die die heimische Maulbeerseide Fibroin ist. Für Protein A, können die Aminosäuresequenzen in "Fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi ist die chinesische (Eiche) Tussah Moth). Für die Protein B können die Aminosäuresequenzen in "Fibroin schwere Kette Vorstufe [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001106733.1" und "Fibroin leichte Kette Vorstufe [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1" zusammen (Bombyx mori ist die domestizierte Seidenraupe des Maulbeerbaums).
    2. Auswählen und sabereits die Aminosäuresequenzen des Proteins A und Protein B aus der Datenbank.
    3. Besuchen Sie die ExPASy Website (die SIB Bioinformatics Resource Portal) (www.expasy.org) oder andere kommerzielle Software für die Berechnung der Grund Bioinformatik Daten von Proteinen anhand ihrer Sequenzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Gesamtladung pro Molekül, Hydrophobie Index begrenzt Molekül Titrationskurve der Moleküle bei unterschiedlichen pH-Werte, usw. Diese Informationen werden als Grundelemente für die rechnerische Simulation von Protein-Interaktionen verwendet werden, und hilft zu verstehen, ob diese zwei Proteine ​​und starke Interaktion. [Anmerkung: Dieser Schritt ist nicht genau vorherzusagen jedes Detail der Protein-Interaktion, wie sie in kleine Peptide oder funktionelle Proteine ​​Wissenschaft verwendet. Der Zweck dieser Abschnitt ist nur zu vermeiden, Herstellung eines Proteingemisches mit offensichtlichen Makrophasentrennungen, die nicht eine "Legierung" Material aufgerufen werden können. Daher könnte die Schätzung ungefähre, aber thE-Protein-Legierungssystem kann durch einen Schritt 3.1 mit präzisen thermischen Analyse] beschriebenen experimentellen Verfahren verifiziert werden.
  2. Computational Simulation von Protein-Legierungssystem
    Unten ist ein Verfahren, um das Protein-Legierungssystem zu simulieren beschrieben. Ein Simulationsprogramm in der Programmiersprache C, die auf einem Einzel-oder Mehrprozessor-Computersystem verwendet werden kann, geschrieben. Ein Gitter-Feder-Masse-(LSM)-Modell wurde verwendet, um die Legierung-Proteine ​​36-39 simulieren. Die LSM-Modell gibt eine einfache Beschreibung des Nettokraft auf die Masse, wenn sie einer Feder befestigt und man kann die Kraftgleichung, die Bewegung für jeden Massen verstehen zu lösen. Ein einfaches Programm Algorithmus zur Modellierung dieses Protein Legierungssystems mit der LSM-Modell ist gegeben wie folgt:
    1. Stellen ein einzelnes Protein als grobkörnige Partikel, die eine Masse m hat.
    2. Verwenden Sie ein Hookeschen oder eine neo-Hooke Frühjahr, um eine Bindung 38,39 darzustellen. Durch die Verknüpfung eine endliche Anzahl von Partikeln mit Federn, kann man mAKE eine Unterlegierung Domäne, die eine stabile Baustein der Legierungs-Proteine ​​darstellt. Um verschiedene Arten von Anleihen, die an inner Verknüpfung darzustellen, verwenden Sie unterschiedliche Federkonstanten / Steifigkeit.
    3. Modellierung der Proteinlegierungssystem als Material stumpf vernetzten Unter Legierungen. Hier wieder unterschiedliche Steifigkeiten wurden verwendet, um verschiedene Verbindungen zwischen Verflechtungen der Teil Legierungen darstellen.
    4. Modellierung der Bindungsbruch und Reformierungsprozess von einem Bell Model 40,41, durch die schwachen Bindungen sind erlaubt reformiert werden, aber starke Bindungen kann nicht reformieren, wenn sie defekt sind. Wenn das System genug betont (sowohl auf den inner suballoy und inter suballoy Anleihen) können Anleihen brochen und reformiert werden.
    5. Um Verformung Wirkungen auf die Legierung Proteine ​​zu untersuchen, wenn sie beansprucht werden, gelten äußeren Kräfte auf das System. Verteilen Sie diese Kräfte gleichmäßig auf jedes Teilchen, wenn die Lösung der Kraftgleichung (Die Newtonschen Gesetze).
    6. Um Interaktionen zu modellierenzwischen der Lösung (wie beispielsweise Wassermoleküle) und den Proteinen, gelten eine zusätzliche Schleppkraft oder Reibungskraft auf jedes Teilchen.
    7. Lösen Sie das Kraftgleichung für jedes Teilchen mit den Aktionen der einzelnen Kraft (die Federkraft aus der Anleihe, der äußeren Kraft und der Reibungskraft).
    8. Berechnen und Extrahieren der Positionen der Proteinpartikel als Funktion der Zeit.
    9. Berechnen der physikalischen Größen, die die Legierung Proteine ​​zu charakterisieren von den Positionen der Teilchen.
    10. Ändern Sie die Bindung Steifigkeit im Programm, um Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen zu verstehen. (Die durchschnittliche Bindungssteifigkeit von der Young-Modul der Proteinmaterialien berechnet. Der Young-Modul der verschiedenen Faserprotein Materialien können entweder von Universal Zugversuch 18 oder direkt aus früheren Literatur 2-4,18) erhalten werden.

2. Herstellung von Protein-Legierung Lösungen

Wild Tussahseide (Protein A) und inländischen Maulbeerseide (Protein B) werden hier als ein Beispiel für Protein-Legierungssystem ausgewählt. Dieses Protokoll stellt ersten, wie man den wilden Tussahseide (Protein A) Lösung zu erhalten.

  1. Schneiden Sie rohe Wild Tussah Seidenkokons oder Fasern mit einem Gewicht von 3 g.
  2. Maßnahme 3 g Natrium -dicarbonat oder Natriumcarbonat (Hinweis: Bei der Verwendung von Natriumcarbonat, wird das Molekulargewicht der Proteinketten während des Kochprozesses 42 zu reduzieren).
  3. Füllen Sie einen 2 L Becherglas mit destilliertem Wasser (H 2 O). Dann legen Sie das Becherglas auf einer heißen Phase, bedecken Sie es mit Aluminiumfolie und zum Sieden.
  4. Entfernen Sie die Alufolie und fügen Sie die gemessenen Natriumdicarbonat langsam in das kochende Wasser, so dass sie vollständig zu lösen. (Anmerkung: Die Rolle der Natriumdicarbonat ist die "Seife" zu reinigen Sie löslich Serizin Proteine ​​und andere Verunreinigungen auf der Oberfläche der wilden Seidenfasern angebracht Bei Verwendung oth.ER Natur Proteinfasern, wählen Sie bitte entsprechenden chemischen Mitteln nach der Literatur).
  5. Fügen Sie die rohen Proteinfasern (Wildseide-Fasern) in das kochende Wasser und lassen Sie für 2-3 h (Hinweis kochen. Die Kochzeit hat entscheidenden Einfluss auf das Molekulargewicht der Proteinketten 26,43 Man sollte eine angemessene Zeit nach wählen in der Literatur oder durch Durchführen einer Steuerung Experimente 26,43. Die Siedetemperatur könnte ebenfalls eingestellt werden, um das Molekulargewicht der Proteinketten 26,43,44) auswirken.
  6. Nach dem Kochen vorsichtig die Proteinfasern mit einem Spatel aus der Lösung und drücken Sie sie, um das überschüssige Wasser zu entfernen. (ACHTUNG: Die Fasern sind sehr heiß!)
  7. Nächsten, tauchen die Fasern in einem 2-Liter-Becher mit kaltem destilliertem Wasser und waschen die Fasern zweimal für jeweils 30 Minuten, um die unreinen Reste vollständig zu entfernen von der Faseroberfläche. Trocknen Sie die Fasern in einem Abzug für mindestens 12 Stunden.
  8. Schmelzen 45,784 g Calcium nitRate (Ca (NO 3) 2) in ein Becherglas, eine Flüssigkeit bei 65 ° C zum Auflösen der Wildseidenproteinfasern zu bilden. (Hinweis: Wenn Sie andere natürliche Proteinfasern, wählen Sie eine entsprechende Lösungsmittel, um die Proteine ​​auflösen Hier können Sie auch 9,3 M LiSCN oder LiBr-Lösung oder eine 85% ige Phosphatlösung zum Lösen verschiedener Seidenfasern zu verwenden.).
  9. Kombinieren der Fasern und das Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 g Faser in 10 ml Lösungsmittel. Die Fasern müssen bei 95 ° C für 5 bis 12 Stunden auflösen. (Anmerkung: Die Lösezeit ist abhängig von dem Molekulargewicht der Proteine ​​26,43-45)
  10. Unter Verwendung von Spritzen, spritzen die Wildseide-Lösung in 12 ml Dialysekassetten (maximal 1.000 MW als die Cutoff-Größe) oder versiegelte Dialyseschläuche (maximal 1.000 MW als die Cutoff-Größe) und Dialyse gegen 2 l destilliertem Wasser. (Anmerkung: Die Injektion ist effizienter, wenn die Lösung bei 35 ° C, da sonst die Viskosität der Proteinlösung wird bei Raumtemperatur dramatisch erhöhen). Ändern Sie den destilliertem Wasser häufig Ca entfernen (NO 3) 2 Lösungsmittel in der Lösung (nach 30 min, 2 h, 6 h und dann alle 12 Stunden für 3 Tage. Insgesamt gibt es ca. 8 Wasserwechsel sein).
  11. Nach 3 Tagen sammeln die Proteinlösungen aus den Dialyse-Kassetten oder Schläuche aufnehmen und in 13.000 rpm bewertet Röhren.
  12. Zentrifugieren der Lösung für 1 Stunde bei 3500 rpm bei 4 ° C 3x um Ablagerungen zu entfernen. Nach jedem Zentrifugenlaufs schnell ziehen Sie den Überstand in neue Schläuche. Bewahren Sie die endgültigen Lösungen in einem 4 ° C Kühlschrank.
  13. Gießen Sie 5 ml Proteinlösung auf eine Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat oder andere flache hydrophobe Substrat und lassen Sie es vollständig trocknen (das dauert in der Regel mehr als 12 h). Wiegen Sie das verbleibende feste Proteinfilm und berechnet die endgültige Lösungskonzentration in Gewichtsprozent (w / v%) = gemessene Gewicht (in mg) ÷ 5 (in ml) ÷ 10.
  14. Sammeln Sie eine andere ausgewählte, natürliche Proteinfaser (in diesem case, wurde domestiziert Maulbeerseide wie das Protein B verwendet wird), und wiederholen Sie obige Verfahren mit einem entsprechenden "Seife" und Lösen Lösungsmittel, bis die endgültige Protein-Wasser-Lösung mit gemessenen Konzentration erreicht ist. [Hinweis: Wenn die Eiweißstoffe sind in Pulverform, entsprechende poröse Schläuche oder Membranen, die während des Prozesses "Einseifen" der Proben zu halten. Wenn das Protein wurde bereits gereinigt, gehen Sie direkt zu Schritt 2.8, um das Pulver aufzulösen. Wenn das Protein wurde bereits gereinigt und in Wasser löslich ist, bilden seine wässrige Lösung mit einer gewünschten Konzentration und dann gehen Sie mit Schritt 2,15 bis Mischung Proteinlösungen zu machen.]
  15. Langsam verdünnen das Protein eine Lösung (hier Wildseide-Lösung) in destilliertem Wasser bei 4 ° C, um eine 1,0 Gew% Protein A-wässrige Lösung zu bilden. Machen Sie dasselbe Verfahren für die Protein-B (hier häuslich Seide).
  16. Langsam mischen die 1 Gew% Protein-A-Lösung mit Protein B-Lösung bei 4 ° C unter Verwendung einer Pipette zu vermeiden protein Aggregation beim Mischen. (Anmerkung 1: Verwenden Sie nicht einen Wirbel Instrument, um die Proteine ​​zu mischen, da einige Proteine ​​(zB Seide) wird Hydrogele während der Vibration 46,47 bilden. Hinweis 2: Wenn möglich, weitere Geräte zu verwenden, um die Mischgeschwindigkeit und Mischgröße zu Steuer sicher, dass sie so langsam wie möglich, um die Aggregation zu vermeiden mischen. nicht schnell die Lösung während des Mischens pipettieren).
  17. Sollte die endgültige Verschmelzung Lösungen haben einen bestimmten Massenverhältnis oder ein molares Verhältnis von Protein A: Protein B. Typischerweise mischen sie mit Massenverhältnis von 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 zu erhalten ein breites Spektrum von Legierungslösungen. Verwenden reines Protein A und Protein B-Lösungen als Kontrollen. Für eine Mischlösung mit einem molaren Verhältnis von Protein A: Protein B = R: (100-R). Berechnen der Volumenmischverhältnis (bezogen auf einen gleichen 1% ige Lösung) von: Volume A: Volume B = R · (MW A): (100-R) · (Molekulargewicht von B).
  18. Die endgültigen Lösungen sofort gegossen auf PDMS Substrate, um Filme oder andere desi bildenknüpfung Materialien. (Hinweis: hohe Konzentration Protein-Legierung Lösungen für eine lange Zeit lagern Weitere Aggregate können später aufgrund der Protein-Protein-Wechselwirkungen in Wasser zu bilden.). Wenn nötig, verdünnte die Mischung Lösungen mit ionenfreiem destilliertem Wasser und halten sie in einem 4 ° C Kühlschrank, zusätzliche Proteinaggregation in Lösungen zu vermeiden.

3. Herstellung von Protein-Variable Legierungsmaterialien

  1. Bestätigen Alloy-Vorhersage durch Thermische Analyse 3,9,31-35
    1. Bereiten PDMS Substrate und reinigen Sie durch Einweichen in destilliertem Wasser.
    2. Warf die Protein-Mischung Lösungen mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen auf die PDMS-Substraten.
    3. Trocknen Sie die Lösungen für mindestens 12 Stunden in einer chemischen Abzugshaube mit Luftstrom, bis Filme gebildet werden (Hinweis: Verwenden Sie das gleiche Volumen für verschiedene Lösungen, so dass die Dicke der Filme festgelegt werden kann).
    4. Entfernen Sie die Protein-Legierungsfilme aus den PDMS Substrate und legen Sie sie auf sauberes Geschirr.
    5. Wiegen viele Differential Scanning Calorimetry (DSC) Aluminiumpfannen und Deckel für DSC-Studie. Ordnen Sie die Pfanne und Deckel Paare eine gleiche Gesamtgewicht (Gewicht der Pfanne plus Gewicht des Deckels entspricht einer Gewichtskonstanz). Zum Beispiel wurde hier ein Gesamtgewicht von Deckel und Behälter 22,50 mg, und acht Sätze von Deckel und Behälter-Kombinationen mit diesem Gesamtgewicht, hergestellt.
    6. Kapseln 6 mg jede Art von getrockneten Protein fügt sich in Aluminium-DSC-Pfannen und versiegeln sie mit ihren abgestimmten Deckeln in Prozess 3.1.5. Siegel eine leere Pfanne und Deckel Paar mit der Probe als Referenz verwendet, so dass nur die Wärmekapazität der Proben selbst werden bei der thermischen Analyse (Hinweis aufgenommen werden: Der DSC wird die Wärmekapazität des Referenz Pfanne + Deckel gegen das vergleichen Probe + + Pfanne Deckel. Aufgrund der gleichen Gewichten, wird der Hintergrund Wärmekapazität aus den Pfannen und Deckel für so dass nur die Wärmekapazität der Probe in der Pfanne) zu bilanzieren.
    7. Setzen versiegelt Referenzen und Probenschalen in ein DSC-Gerät, mitgespülten Trockenstickstoffgasstrom von 50 ml / min und mit einem gekühlten Kühlsystem ausgestattet. Bevor die Probe Messungen sollte die DSC-Gerät zunächst mit Saphir und Indium für Wärmestrom und Temperatur bzw. kalibriert werden.
    8. Vorlauf der DSC bei einer Heizrate von 2 K / min auf 150 ° C und dann bei dieser Temperatur für 15 Minuten, um alle verbleibenden Wassermoleküle in den Proben (typischerweise um 3-10% des Gesamtgewichts) zu entfernen. Schnell abkühlen (10 K / min) bis 25 ° C.
    9. Ausführen des DSC wieder bei einer Heizrate von 2 K / min auf 300 ° C, oder bis der Abbau Peakproteinmischungen erscheinen 34. Aufzeichnung der Wärmekapazitäten der Proteinprobe bei verschiedenen Temperaturen während dieses Prozesses. Kühlen Sie den DSC und ändern Sie die alten Probe zu einer neuen Probe mit einem anderen Mischungsverhältnis.
    10. Berechnung und Darstellung der Wärmekapazität gegen Temperaturkurven für jede Proteinmischung Probe mit der DSC Software 31-35.
    11. Beurteilen die miscibility Proteinmischungen durch das folgende Verfahren (siehe Abbildung 4 Thermische und 5), und wenn die beiden Proteine ​​sind vollständig mischbar sind, können sie als "Protein-Legierungen". Andernfalls wird der Begriff "Protein zusammengesetzt" wäre ein geeigneter Name sein nach Polymer beschreibenden Theorien 48,49):
      1. Die einzelnen Proteine ​​A und B sollten individuelle Einzelglasübergänge Temperatur T g (A) und T g (B) (Siehe die grüne und blaue Kurven in Abbildung 5) 3,48 haben;
      2. Diese einzige Glasübergangstemperatur liegt normalerweise zwischen denen der beiden einzelnen Proteinkomponenten, T g (A) und Tg (B) (siehe Abbildung 5) 3,48;
      3. Unmischbaren Blends Phasentrennung erhalten wird, wenn sowohl T g (A) und Tg (B) erschien in ihre ursprüngliche Position (Figur 5), und mit jedem T g SchrittHöhe im Verhältnis zu der Zusammensetzung sind die beiden Proteine ​​vollständig mischbaren 3,48.
      4. Halb mischbar Verbund Mischung Typ wird eine sehr breite Glasübergangs haben, oder noch haben zwei Glasübergänge, aber jeder hat näher zueinander in Bezug auf die reine Proteinkomponenten, T g (A) und T g (B) (migriert siehe Abbildung 5). In diesem Fall kann es zu Mikro heterogenen zwischen den zwei Proteinkomponenten gebildet Phasenstrukturen sein, und die Zusammensetzung kann von Ort zu Ort variieren.
    12. If (3.1.11.1) ist der in der DSC dargestellten Fall, und es bestätigt, dass das Protein AB ist ein Legierungssystem werden, fahren Sie dann mit Protein-Legierungen herzustellen.
  2. Herstellung von Optical Materials durch Protein-Legierungen
    1. Produzieren (bei der Herstellung Labor) oder Kauf einer topographischen Oberfläche konzipiert zum Gießen. In diesem speziellen Beispiel ein Glas mit vier Beugungsmuster verwendet wurden (Abbildung 4Optical).
    2. Legen Sie das Glas mit Beugungsmuster in eine Schale, und stellen Sie sicher, dass die strukturierte Oberfläche ist nach oben gerichtet.
    3. Verbreiten PDMS-Lösung gleichmäßig auf der Glasoberfläche und die Oberflächenstrukturen vollständig zu decken (: 1 Mischungsverhältnis nach der Benutzeranweisung 23,44 Die PDMS-Lösung wird durch Vergießen und Katalysatorlösung in einem 9 gemacht).
    4. Legen Sie das Gießen in eine Schüssel 65 ° C im Ofen für mindestens 2 Stunden, während auf eine ebene Fläche. Die PDMS-Lösung sollte in einem festen Substrat während dieses Prozesses zu trocknen.
    5. Entfernen PDMS Substrat aus Glas. Die Beugungsmuster soll nun der PDMS Oberfläche übertragen werden.
    6. Punch-Out die PDMS-Formen mit Beugungsmuster mit einem geeigneten Locher.
    7. Drop Protein Legierung Lösungen auf dem PDMS Oberflächen-Beugungsmuster, und trocknen Sie sie für mindestens 12 Stunden, um Filme mit Beugungsmuster zu erhalten.
    8. Zu unlöslichen Proteinlegierungsmaterialien zu erhalten, setzen Sie den gesamten Satz von dry Filme, einschließlich PDMS Formen in einem 60 ° C Vakuumofen (25 kPa) mit einer Wasserschale auf dem Boden der Kammer. Pumpen Luft in den Ofen, und lassen Sie die Wasserdämpfe Glühen Proben für mindestens 2 Stunden. (Dieser Vorgang wird als temperaturgeregelte Wasserdampf Tempern 45. Vergleich mit den weit verbreiteten Verfahren Methanol, kann es ähnlich Beta-Faltblatt-Gehalt in der Seidenstoffe 45 zu erzeugen). Das Vakuum, und ziehen Sie das Wasser unlöslichen Film aus der PDMS-Substrat mit einer Pinzette. Für dieses Beispiel sind Wildseide domestizierten Seiden Legierungen verwendet.
    9. Testen Sie die Qualität der Beugungsmuster auf Filme durch den Vergleich mit den Original-Muster auf dem Glas (zB sammeln REM-Bilder für die Mikroskala Details, sammeln Laserbeugungsmuster für die allgemeine Muster-Qualität).
  3. Herstellung von elektrischen Schaltungen auf Protein-Legierungen Materialien
    1. Um ein elektrisches Schaltungsmuster auf einem Glassubstrat herzustellen, zuerst Cleana Glasträger mit einigen Entfettungsmittel wie Alconox mit Ultraschall für 5 Minuten, gefolgt von 5 min in Aceton, gefolgt von 5 min in Methanol. Das Methanol wird verwendet, da es zuletzt langsamer als Aceton, so können Sie das Substrat nicht Trocknung und rückstandslos verdampft geblasen werden.
    2. Schlag den Glasobjektträger trocken mit trockener Stickstoffgas, das durch die Boil-off von einem 180 L flüssigem Stickstoff Dewar erzeugt wird.
    3. Einführung der Substratmaterialien in die Abscheidungskammer. (Diese Richtlinien sind für ein Sputter-System, sondern auch andere Abscheidungstechniken verwendet werden könnten.) Wenn die Kammer mit einer Ladeschleuse ausgebildet ist, wird das Vakuum in der Abscheidungskammer nicht wesentlich beeinflusst. Evakuierung der Schleuse zu einem Druck von 30 Torr.
    4. Öffnen der Schieber zwischen der Ladeschleuse und der Hauptdepositionskammer und die Einführung des Substrats in die Kammer.
    5. Schalten Sie das Ar-Gas und dem Druckregler und steuern den Druck auf die gewünschte Deposition Druck. Höhere Drücke geben geringeren Energie zerstäubt Metallatome und gleichmäßiger Filme, während niedrigere Drücke zu besseren Einhaltung schneller abgeschiedenen Filme. Der Druckbereich ist in der Regel zwischen 3 und 60 Torr Torr, mit 20 Torr, die gut arbeiten.
    6. Metalle werden dann auf eine Blende, die das Substrat vor der Beschichtung unter Verwendung einer HF-Leistung von 100 W. Eine Abstimmschaltung erforderlich, um die HF-Leistung an den Metall-Target zu richten schützt projiziert. Gleichstrom könnte anstelle von RF für metallische Objekte verwendet werden. Um Oxidschichten und Verunreinigungen aus dem Ziel zu entfernen, vor-Sputtern für einige Minuten.
    7. Öffnen Sie den Auslöser und Sputter das Metall auf das Substrat. Die Abscheidungsrate für die beschriebene Konfiguration ist etwa 10 nm pro min. Diese Rate wird vom Arbeitsabstand, Druck, Magnetstärke in der Magnetron-Kathoden-, Solldicke und dem Metall zerstäubt abhängen. Einstellen der Abscheidungszeit, um die gewünschte Dicke zu erreichen.
    8. Entfernen Sie die beschichteten Objektträger aus derKammer.
    9. Verwendung einer Schleuder, schleudern einer Photoresistbeschichtung auf der Oberfläche der Folie. Viele Resists verwendet werden. Für diesen Fall wurde positiver Photoresist verwendet wird.
    10. Nachdem das Resist auf die Folie, weiche Backen bei 90 ° C für 5 min zentrifugiert, um das Resist zu trocknen.
    11. Legen Sie eine Kontaktmaske mit einem Bild der Vorrichtung fest gegen den Widerstand zu leisten. Eine UV-Lichtquelle verwendet wird, um das Photoresist aus. Die Belichtung beträgt 10 s, aber in Abhängigkeit von der Stärke der Lichtquelle abhängig, und der Resist verwendet.
    12. Platzieren der Folie in der Photoresistentwickler, bis das projizierte Bild erscheint. Die Entwickler wäscht die wider das war die UV-Licht, die den Bruch der Polymerbindungen führen ausgesetzt. Unmittelbar nach dem Bild erscheint, tauchen den Film in DI-Wasser, um den Entwickler von der Arbeit auf dem unbelichteten Photolack zu stoppen.
    13. Blasen die Filme trocken mit trockenem Stickstoffgas.
    14. Zeigen die Folien in einem Ofen bei 120 ° C für 15 min zu "hard bake" Fotozu widerstehen.
    15. Nachdem die Filme abkühlen, legen sie in eine Ätzlösung, bis das Metall nicht durch den Photolack geschützt abhebt. Bad im Wasser, um das Ätzen zu stoppen.
    16. Spülen mit Aceton, um den Photolack gehärtet entfernen.
    17. Spülen mit Methanol und föhnen mit trockenem Stickstoff.
    18. Nachdem die beschichteten Gläser sind bereit, fallen verschiedene Proteinlegierungslösungen auf den Glasoberflächen, und trocknen Sie sie für mindestens 12 Stunden, um Protein-Legierungsfilme auf der Brille erhalten. (Es wird empfohlen, zuerst die Legierung Lösungen konzentrieren bis 5 Gew% auf Protein dicken Legierungsfilme zu erhalten.)
    19. Aufgrund der hydrophoben-hydrophilen Wechselwirkungen, werden die dünnen Metallfilme von den Glasflächen auf die beigefügte Protein-Legierungsfilm Flächen 51 übertragen werden. Abziehen der Protein-Legierungsschichten mit den dünnen Metallmuster aus der Glassubstrate mit einer Pinzette.
    20. Zu unlöslichen Proteinlegierungsmaterialien legen Sie die trockene Filme in einen 60 ° C Vakuumofen (25 kPa) mit aw zu erhalten,asser Schale auf dem Boden der Kammer. Pumpen Luft in den Ofen, und lassen Sie die Wasserdämpfe Glühen Proben für mindestens 2 Stunden. Das Vakuum, und ziehen Sie das Wasser unlöslichen Film aus dem Substrat mit einer Pinzette.
    21. Testen der elektrischen Eigenschaften von Metallmustern auf Protein-Legierungsschichten wie elektrischen Widerstand und vergleicht sie mit den ursprünglichen Muster auf dem Glas.
  4. Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffen durch Protein-Legierungen
    1. Um ein Protein-Legierungsschichten mit pharmazeutischen Verbindungen herzustellen, zunächst eine PDMS-Substrat herzustellen, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Reinigen Sie die gebildet PDMS-Substrat mit destilliertem Wasser.
    2. Auflösen oder Dispergieren des pharmazeutischen Verbindungen in einer wässrigen Lösung. Verwenden Ultraschall oder Wirbel homogen mischen die pharmazeutische Verbindungen mit dem Wasser. Wenn die Verbindungen nicht löslich Wasser, Dispergieren der Pulver mit einer homogenen Verteilung in der ionenfreiem destilliertem Wasser.
    3. Berechnen Sie den gewünschten Massenverhältnisvon Verbindungen zu den Protein Legierungen durch: Volumen der Verbindungslösung x Gewichtsanteil von Verbindungslösung: Volumen der Proteinlösung x-Legierung Gewichtsanteil von Verbindungslösung (hier 1 Gew% Legierungslösung wurde verwendet). Wählen eines Verhältnisses, um einen Film mit der gewünschten Verbindung Dichte in dem Protein-Legierungsschicht erhalten.
    4. Langsam mischen der Lösung der Verbindung mit dem Protein-Legierung Lösung nach den gleichen Anweisungen in Abschnitt 2 Verfahren 2.16. (Hinweis: Um Gelieren zu vermeiden, nicht ultrasonicate bzw. Wirbel die Lösung während des Misch).
    5. Gießen Sie eine berechnete Volumen der Mischung auf die PDMS-Substrat und trocknen Sie es mindestens 12 Stunden in einer chemischen Abzugshaube zu einem Protein zu erhalten Legierung Film, der ein Verhältnis entwickelt von pharmazeutischen Verbindungen.
    6. Physisch vernetzt den Film nach dem gleichen Unterricht in Abschnitt 3.2 Verfahren 3.2.8. Ein Beispiel eines Legierungsfilme mit unlöslichen Modellsubstanzen von niedriger Dichte (LD) oder einer hohen (HD) Dichte kann in 4 gesehen werden, Chemical.

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Ergebnisse

Typische Protein-Protein-Interaktionen (zB zwischen Protein A und Protein B) konnte Ladungs-Ladungs-(elektrostatische) Attraktionen, Wasserstoffbrücken Bildung, hydrophobe-hydrophile Wechselwirkungen sowie Dipol-, Lösungsmittel, Gegenionen und entropischen Effekte zwischen der spezifischen enthalten Domänen der beiden Proteine ​​(Abbildung 2) 3. Daher grundlegend, können wir die Effekte dieser Wechselwirkungen durch Computersimulationen vorherzusagen.

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Diskussion

Einer der kritischsten Verfahren in der Herstellung von "Legierung" Proteinsystem ist, um die Mischbarkeit der gemischten Proteine ​​verifizieren. Ansonsten ist es nur eine nicht mischbare Mischung oder Protein-Protein-Verbundsystem ohne stabile und einstellbaren Eigenschaften. Eine experimentelle thermische Analyseverfahren kann für diesen Zweck verwendet werden und deren Legierungseigenschaften zu bestätigen. Protein-Protein-Interaktionen können nach der Flory-Huggins-Gittermodell 48, wie Wechselw...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Die Autoren danken der Rowan University für die Unterstützung dieser Forschung. XH auch dank Dr. David L. Kaplan an der Tufts University und der NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) für frühere technische Schulungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Q100 Dynamische Differenzkalorimeter (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/ASie können jede Art von DSC mit einer Software zur Berechnung der Wärmekapazität verwenden.
SS30T Vakuum-Sputtersystem T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USAN/AMit kundenspezifischen Teilen; Sie können jede Art von Sputtersystem zum Beschichten verwenden.
VWR 1415M VakuumschrankVWR International, Bridgeport, NJ, USAN/ASie können jede Art von Vakuumschrank verwenden, um die Proben physisch zu vernetzen.

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