Eine hochdurchsatzkompatible FRET-basierte Plattform zur Identifizierung und Charakterisierung von Botulinum-Neurotoxin-Leichtkettenmodulatoren

Summary

Das Botulinum-Neurotoxin Typ A Leichtkette (BoNT/A LC) ist eine Metalloprotease, die in Motoneuronen eindringt, ihr Substrat SNAP-25 spaltet und die Neurotransmission stört, was zu schlaffer Lähmung führt. Unter Verwendung eines hochdurchsatzkompatiblen FRET-basierten Assays können große Bibliotheken kleiner Moleküle auf ihre Auswirkungen auf die enzymatische Aktivität von BoNT/A LC untersucht werden.

Abstract

Botulinum-Neurotoxin (BoNT) ist ein starkes und potenziell tödliches bakterielles Toxin, das an Motoneuronen des Wirts bindet, in die Zelle aufgenommen wird und intrazelluläre Proteine spaltet, die für die Freisetzung von Neurotransmittern unerlässlich sind. BoNT besteht aus einer schweren Kette (HC), die die Bindung und Internalisierung der Wirtszelle vermittelt, und einer leichten Kette (LC), die intrazelluläre Wirtsproteine spaltet, die für die Freisetzung von Acetylcholin essentiell sind. Während Therapien, die die Toxinbindung/-internalisierung hemmen, ein kleines Zeitfenster für die Verabreichung haben, haben Verbindungen, die auf die intrazelluläre LC-Aktivität abzielen, ein viel größeres Zeitfenster für die Verabreichung, was angesichts der extrem langen Halbwertszeit des Toxins besonders relevant ist. In den letzten Jahren wurden kleine Moleküle aufgrund ihrer erhöhten zellulären Permeabilität im Vergleich zu größeren Therapeutika (Peptiden, Aptameren usw.) stark als potenzielle LC-Inhibitoren analysiert. Die Identifizierung von Leitstrukturen beinhaltet häufig ein Hochdurchsatz-Screening (HTS), bei dem große Bibliotheken kleiner Moleküle auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Modulation der therapeutischen Zielfunktion gescreent werden. Hier beschreiben wir einen FRET-basierten Assay mit einem kommerziellen BoNT/A-LC-Substrat und rekombinantem LC, der für HTS potenzieller BoNT-Inhibitoren automatisiert werden kann. Darüber hinaus beschreiben wir eine manuelle Technik, die für ein nachträgliches Sekundärscreening oder für den Vergleich der Wirksamkeit mehrerer Wirkstoffkandidaten verwendet werden kann.

Introduction

Botulinum-Neurotoxin A (BoNT/A), das stärkste derzeit bekannte Toxin (LD₅₀ ~1 ng/kg)¹, ist ein potentes Neurotoxin, das vom Bakterium Clostridium botulinum produziert wird. In einem betroffenen Wirt stört BoNT/A die Neurotransmission an der neuromuskulären Verbindung, indem es Motoneuronen bindet, in das Zytosol internalisiert und schließlich neuronale Proteine spaltet, die für die Acetylcholin-Exozytose unerlässlich sind. Einmal in einem Neuron injiziert, kann BoNT/A bis zu mehreren Monaten bestehen^{bleiben 2}. Eine langfristige Hemmung der Acetylcholinfreisetzung behindert die normale Muskelkontraktion und führt zu schlaffen L....

Protocol

Manuelles Screening oder IC₅₀ Bestimmung

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die relative Wirksamkeit einer Verbindung (IC_50-Wert) zu bestimmen, indem eine Verdünnungsreihe der Verbindung vorbereitet wird, oder um manuell nach niedermolekularen Inhibitoren in einer Einzelkonzentration zu suchen.

1. Vorbereitung von Puffern, Reagenzien und erforderlicher Instrumentierung

1. Bereiten Sie 50 ml Assay-Puffer (40 mM HEPES, pH 7,4 und 0,01 % Tween-20) vor und sterilisieren Sie den Filter. Der Puffer kann mehrere Monate bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
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Results

Der FRET-basierte BoNT/A LC-Assay kann manuell mit niedrigem Durchsatz durchgeführt werden, um bekannte Inhibitoren zu charakterisieren oder kleine Bibliotheken zu screenen; alternativ kann das Protokoll für das Hochdurchsatz-Screening (HTS) mit großen Bibliotheken herunterskaliert und automatisiert werden, mit dem Ziel, neuartige BoNT/A LC-Inhibitoren zu identifizieren. Unabhängig vom gewählten Ansatz sollte ein Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit beobachtet werden, wenn BoNT/A LC mit dem Substrat inkubiert wird (.......

Discussion

Der hier beschriebene FRET-basierte BoNT/A LC-Assay stellt eine attraktive Methode zur Identifizierung und Charakterisierung kleiner Moleküle dar, die die BoNT/A-LC-Aktivität modulieren. Die lösungsbasierte Natur des Assays macht dieses Protokoll für das Hochdurchsatz-Screening zugänglich, das im Abschnitt "Automatisierter Betrieb" des Protokolltextes beschrieben wird. Der Z-Faktor wird häufig verwendet, um die Eignung eines Assays für HTS-Kampagnen zu bestimmen¹⁸. Bestimmt als Z = 1 – 3 (σ_p + σ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Teknova	H1021
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Methanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	34860
Isopropanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	650447
96-Well, schwarze Assay-Platte	Costar	3915
384-Well, schwarze Assay-Platte mit geringem Volumen	Greiner	788076
SNAPtide FITC/Dabcyl Substrat	List Biological Laboratories	521	FRET-basiertes BoNT/A LC Substrat Pin-Reinigungslösung
	V& P Scientific	VP 110
Fusselfreies Löschpapier	V& P Scientific	VP 540DB
Biomek Dichtung und Probe Aluminiumfoliendeckel	Beckman Coulter	538619