Eine hochdurchsatzkompatible FRET-basierte Plattform zur Identifizierung und Charakterisierung von Botulinum-Neurotoxin-Leichtkettenmodulatoren

Summary

Das Botulinum-Neurotoxin Typ A Leichtkette (BoNT/A LC) ist eine Metalloprotease, die in Motoneuronen eindringt, ihr Substrat SNAP-25 spaltet und die Neurotransmission stört, was zu schlaffer Lähmung führt. Unter Verwendung eines hochdurchsatzkompatiblen FRET-basierten Assays können große Bibliotheken kleiner Moleküle auf ihre Auswirkungen auf die enzymatische Aktivität von BoNT/A LC untersucht werden.

Abstract

Botulinum-Neurotoxin (BoNT) ist ein starkes und potenziell tödliches bakterielles Toxin, das an Motoneuronen des Wirts bindet, in die Zelle aufgenommen wird und intrazelluläre Proteine spaltet, die für die Freisetzung von Neurotransmittern unerlässlich sind. BoNT besteht aus einer schweren Kette (HC), die die Bindung und Internalisierung der Wirtszelle vermittelt, und einer leichten Kette (LC), die intrazelluläre Wirtsproteine spaltet, die für die Freisetzung von Acetylcholin essentiell sind. Während Therapien, die die Toxinbindung/-internalisierung hemmen, ein kleines Zeitfenster für die Verabreichung haben, haben Verbindungen, die auf die intrazelluläre LC-Aktivität abzielen, ein viel größeres Zeitfenster für die Verabreichung, was angesichts der extrem langen Halbwertszeit des Toxins besonders relevant ist. In den letzten Jahren wurden kleine Moleküle aufgrund ihrer erhöhten zellulären Permeabilität im Vergleich zu größeren Therapeutika (Peptiden, Aptameren usw.) stark als potenzielle LC-Inhibitoren analysiert. Die Identifizierung von Leitstrukturen beinhaltet häufig ein Hochdurchsatz-Screening (HTS), bei dem große Bibliotheken kleiner Moleküle auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Modulation der therapeutischen Zielfunktion gescreent werden. Hier beschreiben wir einen FRET-basierten Assay mit einem kommerziellen BoNT/A-LC-Substrat und rekombinantem LC, der für HTS potenzieller BoNT-Inhibitoren automatisiert werden kann. Darüber hinaus beschreiben wir eine manuelle Technik, die für ein nachträgliches Sekundärscreening oder für den Vergleich der Wirksamkeit mehrerer Wirkstoffkandidaten verwendet werden kann.

Introduction

Botulinum-Neurotoxin A (BoNT/A), das stärkste derzeit bekannte Toxin (LD₅₀ ~1 ng/kg)¹, ist ein potentes Neurotoxin, das vom Bakterium Clostridium botulinum produziert wird. In einem betroffenen Wirt stört BoNT/A die Neurotransmission an der neuromuskulären Verbindung, indem es Motoneuronen bindet, in das Zytosol internalisiert und schließlich neuronale Proteine spaltet, die für die Acetylcholin-Exozytose unerlässlich sind. Einmal in einem Neuron injiziert, kann BoNT/A bis zu mehreren Monaten bestehen^{bleiben 2}. Eine langfristige Hemmung der Acetylcholinfreisetzung behindert die normale Muskelkontraktion und führt zu schlaffen Lähmungen, die in schweren Fällen zu Herz- und/oder Atemversagen führen können. Aufgrund seiner extremen Wirksamkeit, seiner einfachen Produktion und seiner Langzeitwirkung im Wirt hat die CDC alle BoNT-Serotypen als Hochrisiko-Bioterrorismusmittel eingestuft.

Der Wirkmechanismus des Toxins umfasst zahlreiche Schritte, einschließlich der Bindung an neuronale Oberflächenrezeptoren, der zellulären Aufnahme über Rezeptor-vermittelte Endozytose und der Translokation in das Neuronen-Zytosol. BoNT/A besteht aus zwei Ketten, einer schweren und einer leichten Kette, und beide Ketten sind für die Toxizität erforderlich. Die schwere Kette (HC) enthält Bindungs- und Translokationsdomänen, während die leichte Kette (LC) eine zinkabhängige Metalloprotease ist, die vom Endosom in das Zytoplasma transloziert. Im Inneren des Zytosols lokalisiert sich die LC/A-Metalloproteasse an der inneren zytoplasmatischen Membran und spaltet das membrangebundene Wirtsprotein SNAP-25. SNAP-25 ist ein Mitglied der SNARE-Proteinfamilie (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), die eine entscheidende Rolle bei der Acetylcholin-Exozytose spielt (siehe Referenz³). Die LC/A-Spaltung von SNAP-25 beeinträchtigt die Funktion des SNARE-Komplexes, wodurch die Freisetzung von Acetycholin-Neurotransmittern gehemmt und die Muskelkontraktion beeinträchtigt wird.

Derzeit ist die Behandlung von Botulismus begrenzt und beinhaltet oft die Verabreichung eines equinen neutralisierenden Antikörpers⁴; da das Toxin jedoch schnell in Neuronen internalisiert wird, hat der Antikörper ein enges Zeitfenster für die Verabreichung. Daher glauben viele Forscher, dass die BoNT/A LC ein besseres therapeutisches Ziel sein könnte. Da es sich bei der LC um eine zinkabhängige Metalloprotease handelt, bestand ein Ansatz zur Hemmung der LC/A-Aktivität darin, Verbindungen zu entwickeln, die das Zinkion im aktiven Zentrum chelatisieren. Zum Beispiel chelatisieren Hydroxamatverbindungen das Zink im aktiven Zentrum und haben eine ausgezeichnete In-vitro-Potenz (K_i des bisher besten BoNT/A-LC-Inhibitors für kleine Moleküle beträgt 77 nM)⁵. Viele kleine Moleküle können sich jedoch aufgrund verschiedener Probleme ex vivo oder in vivo nicht als Therapeutika weiterentwickeln, darunter schlechte wässrige Löslichkeit, schneller Stoffwechsel und/oder hohe Zytotoxizität. Daher werden neue Verbindungen mit verbesserten pharmakologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften benötigt. Die Identifizierung niedermolekularer Verbindungen erfordert häufig ein Hochdurchsatz-Screening (HTS), um neuartige Gerüste zu identifizieren. Erste Methoden für das BoNT/A-LC-Aktivitätsscreening basierten auf der HPLC-Detektion der kurzen Peptidsubstratspaltung, die zeitaufwändig und für^{HTS-Anwendungen 6-8} nicht geeignet ist. Anschließend entwickelten Schmidt und Kollegen⁹ einen Hochdurchsatz-BoNT/A-LC-Aktivitätsassay, der ein Fluorescein-markiertes Peptidsubstrat verwendet, das kovalent an eine Mikrotiterplatte gebunden ist. Das BoNT/A LC spaltet das Substrat und setzt Fluorescein frei, das mit einem Fluorometer quantifiziert werden kann. Das Plattenformat dieses Assays ermöglicht das gleichzeitige Screening zahlreicher Verbindungen; Der Assay erfordert jedoch die Markierung synthetischer Peptide mit Fluorescein und die Beschichtung der Assay-Platten mit derivatisierten Substratmolekülen, was umständliche Techniken sind. Eine viel einfachere Methode zum Nachweis der BoNT/A-LC-Aktivität bei niedrigen Konzentrationen wurde später von Schmidt et al. beschrieben, bei der eine Reihe von fluorogenen Substraten verwendet wurde, um die BoNT-LC-Aktivität in Echtzeit zu überwachen¹⁰. Zu den zusätzlichen Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, gehören ein auf Depolarisation nach Resonanzenergietransfer basierender Assay zum Nachweis und zur Quantifizierung der BoNT-Aktivität in Rohextrakten; Dieses Verfahren kann für Hochdurchsatzanwendungen^10,11 verwendet werden, obwohl es eine ausgeklügelte Ausrüstung zur Messung des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers (FRET) und der Polarisationssignale erfordert. Schließlich wurden mehrere zellbasierte Modelle für BoNT-Intoxikationen berichtet (siehe Referenz¹¹), die es den Forschern ermöglichen, die oft einschränkenden Eigenschaften der zuvor erwähnten Verbindungen zu untersuchen, einschließlich Zytotoxizität, Zellpermeabilität und Stabilität. Die meisten der bestehenden zellbasierten Assays sind jedoch nicht für HTS geeignet und arbeits- und zeitintensiv

.

Hierin beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine HTS-Methode, die das kommerziell erhältliche FRET-basierte BoNT/A LC-Substrat verwendet. Das Substrat basiert auf der SNAP-25-Spaltsequenz und ist ein synthetisches 13-mer-Peptid, das ein terminales Fluorophor und einen Quencher enthält. Die BoNT/A-Spaltung trennt das Fluorophor und den Quencher, wodurch FRET aufgehoben und die gemessene Fluoreszenz erhöht wird, die kontinuierlich in einem Fluorometer-Plattenlesegerät gemessen werden kann. Der Assay wird routinemäßig in unserem und anderen Laboratorien eingesetzt, um neue Klassen von BoNT/A-LC-Inhibitoren zu identifizieren oder die relative Wirksamkeit zuvor identifizierter Verbindungen^{zu bestimmen 5,12-15}. Dieser Assay eignet sich aufgrund seiner Einfachheit, seines Automatisierungspotenzials, seiner geringen Materialkosten und seiner Fähigkeit, zahlreiche Verbindungen gleichzeitig zu screenen (siehe Referenz¹⁶; Caglič et al., vorgelegt; Bompiani et al., in Vorbereitung). Zusätzlich zu HTS kann dieser Assay verwendet werden, um die relative Wirksamkeit von Verbindungen zu vergleichen, indem der IC_50-Wert (Konzentration, die erforderlich ist, um 50 % der BoNT/A-LC-Aktivität zu hemmen) einer Verbindung bestimmt wird. Der Assay kann entweder manuell in einem 96-Well-Format (Abschnitt "Manuelles Screening" des Protokolltextes) oder in einem 384-Well-Format für HTS (Abschnitt "Automatisierter Betrieb" des Protokolltextes) automatisiert werden.

Protocol

Manuelles Screening oder IC₅₀ Bestimmung

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die relative Wirksamkeit einer Verbindung (IC_50-Wert) zu bestimmen, indem eine Verdünnungsreihe der Verbindung vorbereitet wird, oder um manuell nach niedermolekularen Inhibitoren in einer Einzelkonzentration zu suchen.

1. Vorbereitung von Puffern, Reagenzien und erforderlicher Instrumentierung

1. Bereiten Sie 50 ml Assay-Puffer (40 mM HEPES, pH 7,4 und 0,01 % Tween-20) vor und sterilisieren Sie den Filter. Der Puffer kann mehrere Monate bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
2. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von rekombinantem Botulinumneurotoxin/A-Leichtkette (LC/A (1-425))¹⁷ in Assay-Puffer vor, ziehen Sie es vorsichtig vor und lagern Sie es auf Eis. Für die Prüfung jeder Verbindung ist eine Arbeitsverdünnung von mindestens 120 μl LC/A erforderlich.
3. Bereiten Sie 7 μM FRET-basiertes BoNT/A LC-Substrat in einem Assay-Puffer mit 10 % DMSO vor. Verdünnen Sie zunächst eine 5 mM Stammlösung des Substrats in einem geeigneten Volumen von 100 % DMSO, dann fügen Sie den Assay-Puffer langsam (tropfenweise) unter vorsichtigem Mischen hinzu. In Folie einwickeln und auf Eis lagern. Für die Prüfung jeder Verbindung sind mindestens 130 μl der Arbeitsverdünnung des Substrats erforderlich.
4. Konfigurieren Sie einen Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Reader so, dass die Platte 10 Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit geschüttelt wird, und überwachen Sie dann die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 490 nm bzw. 523 nm alle 5 Minuten (kinetischer Modus) für 90 Minuten bei RT. Beachten Sie, dass die Produktbildung (d. h. die Zunahme der Fluoreszenz) über diesen Zeitraum linear ist (Abbildung 1A).

2. Vorbereitung der Verbindungsverdünnungsreihe

1. Bestimmen Sie den Konzentrationsbereich der Verbindung (d. h. die Anzahl der Verdünnungen in der Verdünnungsreihe und den Verdünnungsfaktor); der Konzentrationsbereich wird auf der Grundlage des erwarteten IC_50-Werts ausgewählt, um eine optimale Kurvenanpassung zu gewährleisten. Für Verbindungen mit einem unbekannten IC₅₀ ist unverdünntes Massematerial als höchste Substanzkonzentration zu verwenden.
2. Beschriften Sie die Röhrchen mit dem entsprechenden Verbindungsnamen und der entsprechenden Konzentration.
3. Aliquotieren Sie alle Röhrchen mit 100 % DMSO, um sie für die serielle Verdünnung der Verbindung vorzubereiten. Es wird ein Endverdünnungsvolumen von mindestens 2 μl empfohlen, wobei 1 μl jeder Konzentration pro Vertiefung in der Assay-Platte verwendet wird. Bei einer standardmäßigen 1:3-Verdünnungsreihe müssen beispielsweise 2 μl der Verbindung mit 4 μl DMSO pro Röhrchen gemischt werden.
4. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von Verbindungen und Wirbeln vor oder mischen Sie zwischen jeder Verdünnung manuell gründlich; wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung. Für die Standard-Verdünnungsreihe 1:3 geben Sie 2 μl der unverdünnten Verbindung zu 4 μl DMSO in das erste Röhrchen der Verdünnungsreihe und mischen Sie gut. Entfernen Sie mit einer neuen Pipettenspitze 2 μl der ersten Verdünnung und fügen Sie 4 μl DMSO in das zweite Röhrchen hinzu. Gut mischen. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Verdünnungen. Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen der Verbindungen gut gemischt werden, um sicherzustellen, dass die Konzentrationen der Verbindungen genau sind.
5. Die Verbundröhrchen abdecken und bei RT beiseite stellen.

3. Plattenvorbereitung und Fleckenbildung (Tabelle 1)

1. Besorgen Sie sich eine undurchsichtige, schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden. Siehe die empfohlene Plattenkonfiguration in Tabelle 1, in der jede Verdünnungsreihe in Reihen einer 96-Well-Platte formatiert ist. Geben Sie manuell 1 μl der jeweiligen Compound-Verdünnung direkt auf den Boden der entsprechenden Vertiefung (Vertiefungen 1-9). 1 μl der höchsten Konzentration der zu testenden Verbindung wird an Vertiefung 11 abgegeben (intrinsische Fluoreszenzkontrolle der Verbindung).
2. Geben Sie manuell 1 μl eines bekannten potenten Inhibitors in Vertiefung 12 (Positivkontrolle) und 1 μl 100 % DMSO in Vertiefung 10 (Negativkontrolle).
3. Geben Sie mit einer automatischen Pipettore 79 μl Assay-Puffer an die Seite der Wells 1-10 und 12 (Verbindungsverdünnungen und Positivkontrolle) und 89 μl an die Seite von Vertiefung 11 (intrinsische Fluoreszenzkontrolle der Verbindung). Achten Sie darauf, dass Sie mit der Spitze nicht den Boden des Brunnens berühren, wo sich Verbindung befindet, damit Sie die Brunnen nicht kreuzkontaminieren.
4. Die LC/A-Arbeitsverdünnung wird vortexen und mit einer automatischen Pipettierer 10 μl an die Seite jeder Vertiefung gegeben, mit Ausnahme von Vertiefung 11 (intrinsische Fluoreszenzkontrolle der Verbindung). Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sicherzustellen, dass das gesamte hinzugefügte Enzym auf den Boden der Vertiefung gelangt.
5. Mischen, abdecken und die Platte 5 Minuten lang bei RT inkubieren. Diese Inkubation bietet einen Vorgleichgewichtsschritt für die Verbindungen, um vor der Substratzugabe an das LC/A zu binden.

4. Substratzugabe und Fluoreszenzmessung

1. Wirbeln Sie das BoNT/A LC-Substrat vorsichtig vor und geben Sie mit einer automatischen Pipettierer 10 μl Substrat auf die andere Seite jedes Wells. Achten Sie darauf, das Substrat an der Seite der Vertiefung hinzuzufügen, die der Stelle gegenüberliegt, an der das Enzym zuvor hinzugefügt wurde.
2. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Reagenzien zu mischen, legen Sie sie sofort in den Plattenleser und beginnen Sie die Fluoreszenzmessung mit den zuvor in Schritt 1.4 festgelegten Einstellungen.
3. Die Enzymgeschwindigkeiten werden aus der Steigung der Linie berechnet, die durch die grafische Darstellung der relativen Fluoreszenzeinheit (RFU) in Abhängigkeit von der Zeit während der linearen Periode der Reaktion erzeugt wird.

Tabelle 1.Empfohlenes Layout der Assay-Platte.

Nun #	Beschreibung des Brunnens	Verbindung	Assay-Puffer	Substrat	Lc	Dmso
1	Zusammengesetzte Dosis 1	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
arabische Ziffer	Zusammengesetzte Dosis 2	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
3	Zusammengesetzte Dosis 3	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
4	Zusammengesetzte Dosis 4	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
5	Zusammengesetzte Dosis 5	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
6	Zusammengesetzte Dosis 6	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
7	Zusammengesetzte Dosis 7	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
8	Zusammengesetzte Dosis 8	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
9	Zusammengesetzte Dosis 9	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---
10	Negativkontrolle (100% LC-Aktivität)	---	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	1 μl
11	Intrinsische Fluoreszenzkontrolle von Verbindungen	1 μl	89 μl	ca. 10 μl	---	---
12	Positivkontrolle (0 % LC-Aktivität)	1 μl	79 μl	ca. 10 μl	ca. 10 μl	---

Automatisierter Betrieb für Hochdurchsatz-Screening

5. Vorbereitung von Puffern, Reagenzien, Verbundplatten, Barcodes und erforderlicher Instrumentierung

1. Tauen Sie die versiegelten Verbundplatten mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur auf.
2. Bereiten Sie 500 ml (oder mehr, abhängig von der Anzahl der zu screenenden Verbindungen) des Assay-Puffers (40 mM HEPES, pH 7,4 und 0,01 % Tween-20) vor und sterilisieren Sie den Filter. Der filtrierte Assay-Puffer kann mehrere Monate bei RT gelagert werden.
3. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von 8,75 nM von rekombinantem BoNT/A LC (1-425) in Assay-Puffer und Vortex vor und lagern Sie es auf Eis. Jede Vertiefung in einer 384-Well-Platte mit geringem Volumen benötigt 8 μl. Bereiten Sie einen Überschuss von 10-15 % oder ca. 3,7 ml oder jede 384-Well-Platte mit geringem Volumen vor.
4. Bereiten Sie ein 3,5 μM FRET-basiertes BoNT/A LC-Substrat vor, das in einem Assay-Puffer mit 10 % DMSO verdünnt wird. Verdünnen Sie zunächst die 5 mM Stammlösung des Substrats direkt in dem entsprechenden Volumen von 100 % DMSO, dann fügen Sie den Assay-Puffer langsam (tropfenweise) unter vorsichtigem Mischen hinzu. In Folie einwickeln und auf Eis lagern. Jede Vertiefung in einer 384-Well-Platte mit geringem Volumen benötigt 2 μl. Bereiten Sie einen Überschuss von 10-15 % oder ca. 1 ml für jede 384-Well-Platte mit geringem Volumen vor.
5. Bereiten Sie Barcodes für jede schwarze Mikrotiterplatte mit geringem Volumen mit 384 Wells vor und kleben Sie das Etikett direkt auf die Seite der Platte, wo es vom Barcode-Scanner gelesen werden kann. Stellen Sie sicher, dass das Etikett nicht über die Plattenseite hinausragt, da es sonst die Handhabung und das Stapeln der Platte beeinträchtigen kann. Die Platten in numerischer Reihenfolge stapeln und beiseite stellen. Decken Sie die obere Platte ab. Beachten Sie, dass dieser Schritt optional ist, aber die Verfolgung der Ergebnisse zu den entsprechenden Verbindungen erleichtert, wenn mehrere Platten verwendet werden.
6. Zentrifugieren Sie die aufgetauten, versiegelten Stoffplatten bei 200 x g für 30 Sekunden bei RT. Entfernen Sie vorsichtig die Plattenversiegelung, stellen Sie sicher, dass der restliche Klebstoff entfernt wird, und decken Sie die Platte mit einem sauberen Kunststoffdeckel ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Beachten Sie, dass Klebstoff auf der Plattenoberfläche die automatische Deckelübergabe und das Stapeln der Platte beeinträchtigen kann. Platzieren Sie die abgedeckte Platte in einem Hotel, das an den Liquid Handler angeschlossen ist. Bewahren Sie die Platten nicht offen auf, da es sonst zu Verdunstung kommt.
7. Konfigurieren Sie einen gestapelten Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Reader, um die Fluoreszenz jeder Assay-Platte bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 490 nm bzw. 523 nm alle 30 Minuten (kinetischer Modus) für 3-6 Zyklen bei RT zu lesen.

6. Vorbereitung des Pin-Tools

1. Überprüfen Sie das Stiftwerkzeug mit 384 Köpfen visuell auf Anomalien, einschließlich Verformungen, Splittern oder großen Ablagerungen.
2. Füllen Sie drei separate Tabletts mit ca. 1 Zoll 100 % Methanol (HPLC-Qualität), 100 % Isopropanol (HPLC-Qualität) und in Reinstwasser verdünnte Reinigungslösung für das Stiftwerkzeug.
3. Befüllen Sie die Reinigungsstation auf einem Liquid Handler mit 100% DMSO.
4. Stapeln Sie 2-3 Stücke sauberes, neues Löschpapier in einem Fach. Es ist wichtig, den Roboter in der z-Achse so zu kalibrieren, dass die Stifte mit dem Löschpapier in Berührung kommen, es aber nicht durchstechen.
5. Befestigen Sie einen Lüfteraufsatz am Arbeitsbereich, um die Stifte nach dem Waschen zu trocknen.
6. Befestigen Sie das Stiftwerkzeug am Roboterarm des Liquid Handlers und reinigen Sie die Stifte vor, indem Sie es in DMSO tauchen, auf Löschpapier trocknen, 2 Minuten in Reinigungslösung einweichen, auf Löschpapier trocknen, in Isopropanol eintauchen, auf Löschpapier trocknen, in Methanol eintauchen, auf Löschpapier trocknen und schließlich über dem Lüfter trocknen.

7. Vorbereitung eines Flüssigkeitsspenders mit geringem Volumen

1. Befestigen Sie eine Kassette mit geringem Volumen (1-10 μl) an den Flüssigkeitsspender und schließen Sie eine Abfallleitung an ein geeignetes Gefäß an.
2. Überprüfen Sie die Dosierdüsen der Kassette visuell und stellen Sie sicher, dass sie nicht verzogen, gerissen oder verstopft sind. Es ist wichtig, die Kanäle und Düsen sauber zu halten, da Niederschläge oder Schmutz die Flüssigkeitsverteilung beeinflussen.
3. Grundieren Sie die Kanäle, indem Sie 30 ml Reinstwasser, 30 ml 70 % Ethanol und dann wieder 30 ml Reinstwasser direkt in das Abfallgefäß leiten.
4. Setzen Sie eine 384-Well-Assay-Platte mit geringem Volumen in den Flüssigkeitsspender ein und geben Sie ein bekanntes Volumen Wasser in jede Well. Führen Sie eine Sichtprüfung durch, um sicherzustellen, dass jedes Bohrloch das richtige Volumen erhält und zwischen den Vertiefungen keine Verschüttungen oder Lösungen abgegeben werden.
5. Grundieren Sie die Rohre ca. 5 Sekunden lang mit Luft, um das Wasser zu entfernen und die Kanäle zu trocknen.

8. Dispensieren der BoNT/A-Leichtkette in die Assay-Platte

1. Tauchen Sie die Ansaugleitung des Flüssigkeitsspenders in die BoNT/A LC-Arbeitslösung ein, entleeren Sie sie, um jegliche Luft zu entfernen, und geben Sie 8 μl in jede Vertiefung einer 384-Well-Assay-Platte mit geringem Volumen ab. Beachten Sie, dass die Platten manuell auf dem Arbeitsbereich des Liquid Handlers positioniert oder mit einem angebrachten Plattenhotel automatisch positioniert und neu gestapelt werden können.
2. Decken Sie jede Platte mit einem sauberen Plastikdeckel ab und stapeln Sie sie in eine andere Spalte des Tellerhotels, das am Liquid Handler befestigt ist. Bewahren Sie die Platten nicht unverschlossen auf, da es sonst zu Verdunstung kommt.
3. Reinigen Sie den Flüssigkeitsspender, indem Sie 30 ml Reinstwasser, 30 ml 70%iges Ethanol und 30 ml Reinstwasser erneut direkt in den Abfallbehälter geben.
4. Grundieren Sie die Rohre ca. 5 Sekunden lang mit Luft, um die Kanäle zu trocknen.

9. Prägen von Verbindungen in die Assay-Platte

1. Weisen Sie auf der Liquid-Handler-Plattform Bereiche für die Compound-Platten, Assay-Platten und Behälter mit Reinigungslösungen zu.
2. Programmieren Sie den Liquid Handler so, dass er die Compound-Platten und die Assay-Platten in den vorgesehenen Positionen platziert und die Plattendeckel vor dem Stanzen entfernt.
3. 50 nl der Verbindung werden direkt in die Assay-Platte mit 8 μl BoNT/A LC gestempelt. Achten Sie bei der Kalibrierung des Prägeprogramms darauf, dass die Stifte untergetaucht sind, aber zerkratzen Sie nicht die Unterseite der Prüfplatte. Beachten Sie, dass die Zugabe von Verbindungen in 100% DMSO eine lokale Zone der Enzymdenaturierung erzeugen kann, wenn es sich dispergiert. Daher sollte darauf geachtet werden, den Grad der Enzymdenaturierung zu beurteilen, indem die reine DMSO-Kontrolle mit der unbehandelten Kontrolle (d. h. Enzym ohne Zusatz von DMSO) verglichen wird.
4. Reinigen Sie die Stecknadeln nach jeder Platte, indem Sie sie in DMSO tauchen, auf Löschpapier trocknen, in Isopropanol tauchen, auf Löschpapier trocknen, in Methanol tauchen, auf Löschpapier trocknen und schließlich über dem Lüfter trocknen.
5. Nachdem die Verbindungen mit dem Enzym in die Assay-Platte gestempelt wurden, stapeln Sie die Standard-Compound-Platten und die Assay-Platten separat. Decken Sie die obere Assay-Platte im Stapel ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie sie beiseite. Stellen Sie sicher, dass LC mindestens 5 Minuten lang bei RT mit Verbindungen inkubiert wird. Längere Inkubationszeiten können beim Stanzen einer großen Anzahl von Platten verwendet werden.

10. Dispensieren des Substrats in die Assay-Platte

1. Tauchen Sie die Ansaugleitung des Liquid Handlers in die BoNT/A LC-Substratarbeitslösung ein und schützen Sie sie vor Licht. Überprüfen Sie die Zapfdüsen, um sicherzustellen, dass sie trocken und nicht verstopft sind. Grundieren Sie die Kanäle, um alle Luftblasen zu entfernen.
2. Entstapeln Sie die Assay-Platten und geben Sie 2 μl Arbeitsverdünnung des Substrats in jedes Well. Vergewissern Sie sich, dass das Substrat direkt in jede Vertiefung dosiert wird. Stapeln Sie die Platten und legen Sie eine leere Assay-Platte auf die erste Platte und eine leere Platte unter die untere Platte im Stapel, um eine Verdunstung während des Ablesens und Umstapelns im Plattenleser zu verhindern.

11. Fluoreszenz-Messungen

1. Laden Sie den Stapel der Assay-Platten sofort in einen Fluoreszenzplatten-Reader.
2. Beginnen Sie die Fluoreszenzmessung mit den zuvor in Schritt 5.7 festgelegten Einstellungen. Die Assay-Rate für jede Verbindung wird aus einem Diagramm der relativen Fluoreszenzeinheit (RFU) über die Zeit berechnet. Beachten Sie, dass es wichtig ist, eine Negativkontrolle (DMSO) einzubeziehen, um eine ungehemmte Rate zu erhalten. Zu jeder Platte kann auch eine Positivkontrolle mit einem bekannten Inhibitor hinzugefügt werden. Eine repräsentative Ausgabe von einem einzelnen Zeitpunkt ist in Abbildung 2 dargestellt.

12. Aufräumen

1. Jede Verbundplatte mit einer Rolle mit einer Folienversiegelung verschließen und bei -80 °C lagern.
2. Nachdem jede Assay-Platte abgelesen wurde, entsorgen Sie die Platten, alle verbleibenden LC/A- oder Substratverdünnungen im Biohazard-Abfall.

Results

Der FRET-basierte BoNT/A LC-Assay kann manuell mit niedrigem Durchsatz durchgeführt werden, um bekannte Inhibitoren zu charakterisieren oder kleine Bibliotheken zu screenen; alternativ kann das Protokoll für das Hochdurchsatz-Screening (HTS) mit großen Bibliotheken herunterskaliert und automatisiert werden, mit dem Ziel, neuartige BoNT/A LC-Inhibitoren zu identifizieren. Unabhängig vom gewählten Ansatz sollte ein Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit beobachtet werden, wenn BoNT/A LC mit dem Substrat inkubiert wird (...

Discussion

Der hier beschriebene FRET-basierte BoNT/A LC-Assay stellt eine attraktive Methode zur Identifizierung und Charakterisierung kleiner Moleküle dar, die die BoNT/A-LC-Aktivität modulieren. Die lösungsbasierte Natur des Assays macht dieses Protokoll für das Hochdurchsatz-Screening zugänglich, das im Abschnitt "Automatisierter Betrieb" des Protokolltextes beschrieben wird. Der Z-Faktor wird häufig verwendet, um die Eignung eines Assays für HTS-Kampagnen zu bestimmen¹⁸. Bestimmt als Z = 1 – 3 (σ_p + σ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Teknova	H1021
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Methanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	34860
Isopropanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	650447
96-Well, schwarze Assay-Platte	Costar	3915
384-Well, schwarze Assay-Platte mit geringem Volumen	Greiner	788076
SNAPtide FITC/Dabcyl Substrat	List Biological Laboratories	521	FRET-basiertes BoNT/A LC Substrat Pin-Reinigungslösung
	V& P Scientific	VP 110
Fusselfreies Löschpapier	V& P Scientific	VP 540DB
Biomek Dichtung und Probe Aluminiumfoliendeckel	Beckman Coulter	538619