Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

Zusammenfassung

Wir entwickelten ein in vitro-Modell, das eine wichtige Komponente der akuten Entzündungsreaktion während der Infektion der Blase mit uropathogenen Escherichia coli nachahmt. Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay erlaubt die quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen Migration über Blasen Epithelien auf lässigen Träger kultiviert, in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktiven Stoffen.

Zusammenfassung

Die Rekrutierung von Immunzellen von der Peripherie zum Ort der Entzündung ist ein wesentlicher Schritt bei der angeborenen Immunantwort zu jedem Schleimhautoberfläche. Während der Infektion der Harnblase, polymorphkernige Leukozyten (PMN; Neutrophile) wandern aus dem Blutkreislauf zu durchqueren und die Blase Epithel. Nicht Infektion in Abwesenheit einer Antwort neutrophilen beheben zeigt die Bedeutung der PMN in der Blase Verteidigung. Zur Besiedlung der Blase Epithel, uropathogenen Escherichia coli (UPEC) zu erleichtern, der Erreger der Mehrheit der Harnwegsinfektionen (HWI), dämpfen die akute Entzündungsreaktion mit einer Vielzahl von teilweise definierten Mechanismen. Zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Wirt und Bakterien-Pathogen, ein in vitro-Modell von diesem Aspekt der angeborenen Immunantwort zu UPEC entwickelten wir. In der transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test, eine Variante der Boyden-Kammer, kultivierte Blase epithElial Zellen gezüchtet werden, um auf die Unterseite eines durchlässigen Träger Konfluenz. PMN aus menschlichem venösem Blut isoliert und zur basolateralen Seite der Blase epithelialen Zellschichten aufgebracht. PMN-Migration, das die physiologisch relevante basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktive Moleküle mit einer Zählkammer gezählt. Dieses Modell kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen UPEC und eukaryontischen Zellen zu untersuchen sowie die molekularen Anforderungen für die Durchquerung von Blasen Epithelien von PMN abzufragen. Die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Modell wird unser Verständnis der Anfangs entzündliche Reaktion auf UPEC in der Blase zu fördern.

Einleitung

Die Bewegung der Zellen im gesamten Körper, oft über lange Strecken, für Wachstum und Entwicklung, Wundheilung, Immunantwort und erforderlich. Zellmigration ist komplex und erfordert die Koordinierung der verschiedenen Verfahren, einschließlich Signalkaskaden und die Umlagerung von Zytoskelett-Komponenten. Die Zellen können nach dem Zufallsprinzip zu definierten chemischen Gradienten (Chemotaxis) bewegen (Chemokinese) sowie. Viele Techniken wurden entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu studieren. Die älteste und am weitesten verbreitete Technik, die Boyden-Kammer, bestehend aus einer vertikalen Zweikammersystem, in dem eine chemoattraktive Substanz in der unteren Kammer und die interessierenden Zellen angeordnet sind in der oberen Kammer ¹ angeordnet. Die Bewegung der Zellen über die durchlässige Filter mit Poren definierter Größe zwischen den beiden Kammern wird überwacht. Zusätzliche Techniken entwickelt worden, um Zellmigration zu untersuchen, einschließlich der Zigmond Kammer ² und der Kammer Dunn^3. Diese kollektive Ansätze wichtige Einblicke in die Bewegung von vielen verschiedenen Zelltypen ergeben.

Zusätzlich zur Abfrage der Grundprinzipien der Chemokinese und Chemotaxis, haben Zweikammer-Tests für die Untersuchung von Zellmigration durch extrazelluläre Matrixkomponenten und sowohl endotheliale und epitheliale Zellschichten erleichtert. Ein Vorteil des Zweikammersysteme gegenüber anderen Techniken ist, dass die poröse Membran mit Proteinen wie Kollagen oder Fibrinogen beschichtet werden, und die Zellmigration in einem extrazellulären Matrix-ähnlichen Barriere kann beurteilt werden. Zusätzlich kann kultivierten Zelllinien gezüchtet und auf den durchlässigen Träger unterschieden werden. Um die Bewegung von Zellen in einer endothelialen Barriere zu untersuchen, werden kultivierte Endothelzellen ausgesät und in das obere Reservoir der durchlässigen Träger aufgewachsen. Bewegliche Zellen, wie Immunzellen, sind in den oberen Stausee und Migration in das untere Reservoir über die en hinzugefügtEndothel-Barriere in der physiologischen apikal-to-basolateralen Richtung beobachtet wird. Dieses Modell wurde im Verständnis Extravasation von Immunzellen aus dem Blutstrom von unschätzbarem Wert. Im Gegensatz zu transendotheliale Migration, die Bewegung von Zellen in einer epithelialen Barriere tritt typischerweise in der basolateralen-zu-apikal. Um diese Ereignisse in-vitro-Modell, Forschern und Samen wachsen kultivierten Epithelzellen an der Unterseite der durchlässigen Träger. Bewegliche Zellen werden in das obere Reservoir und Migration über die epitheliale Barriere, die die basolaterale-zu-apikal zugegeben wird überwacht. Solche Modelle der transepithelialen Migration haben wesentlich zu unserem Verständnis von Entzündungsreaktionen an Schleimhautoberflächen, insbesondere der Lunge und Darm ^4,5 beigetragen.

Im Gegensatz dazu hat Immunzelltransport durch das Epithel der Harnwege viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Um unsere understandi weiter(; Neutrophilen PMN) Bewegung über eine Blase epithelialen Barriere ⁶ ng der angeborenen Immunantwort in den Harnwegen während der Infektion mit uropathogenen Escherichia coli (UPEC), einem in-vitro-Test, der die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Assay, die Untersuchung von polymorphkernigen Leukozyten ermöglicht entwickelten wir ^-8. Wie bei anderen Zweikammer-Modelle der transepithelialen Migration werden kultivierten humanen Epithelzellen der Blase an der Unterseite einer durchlässigen Träger gewachsen und bilden konfluente epitheliale Schichten. Menschliche Neutrophile aus venösem Blut isoliert werden zur basolateralen Seite der epithelialen Schicht aufgebracht, und die Migration in das Epithel im physiologisch relevanten basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine Infektion mit verschiedenen Stämmen von E. quantifiziert coli oder das Vorhandensein von chemoattraktiven Moleküle. Viel Forschung auf Neutrophilen Bewegung konzentriert hatte, sowohl Chemokinese und Chemotaxis, in Abwesenheit von zusätzlichen Zelltypen. Die transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test ist von Vorteil, da es berücksichtigt komplexen Wechselwirkungen zwischen Blase Epithelzellen und Immunzellen während der Infektion. Diese gefügig in vitro-Modell hat das Potenzial, um die detaillierte Untersuchung von Immunreaktionen bei uroepithelial Oberflächen zu ermöglichen.

Protokoll

1. Kulti 5637 Blase Epithelzellen

Führen Sie die folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Gewebekultur Kapuze mit UV-Bestrahlung vorbereitet und sich mit 70% Ethanol abgewischt.

1. Vorbereitung RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) [bezeichnet RPMI +], Filter sterilisiert unter Verwendung eines 0,22 &mgr; m Porengröße filtriert und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad.
2. Tauwetter ein Kryoröhrchen von 5637 Zellen (American Type Culture Collection HTB-9, von Blasenkarzinom abgeleitet) in einem 37 ° C Wasserbad. Schnelle Übertragung der aufgetauten Zellen in einer 75 cm ² Zellkulturflasche mit 20 ml RPMI +.
3. Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _2, bis die Zellen etwa 95% konfluent (~ 6 x 10 ⁶ Zellen pro Kolben), ca. 4 Tage.
4. Um die 5637 Zellen Subkultur:
   1. Entfernen des Mediums aus der Flasche. Waschen der Zellen mit 10 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Saline (DPBS) bei Raumtemperatur.
   2. 6 ml warmem (37 ° C) 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA-Lösung in den Kolben gegeben, und bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 15 min.
   3. Übertragen der Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen und Pellet durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. Entfernen Sie die Trypsin / EDTA-Lösung.
   4. Resuspendieren der Zellen in 6 ml RPMI + (10 ⁶ Zellen / ml) und 1 ml (10 ⁶ Zellen) in eine neue 75 cm ^2-Kolben mit 20 ml RPMI +.
5. Wiederholen Sie Schritt 1,4 bis Subkultur Zellen alle 4 Tage oder, wenn die Zellen zu erreichen 95% Konfluenz.

2. Säen und Wachsen 5637 Zellen auf durchlässigem Unterstützt

Führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube unter aseptischen Bedingungen. Für optimale Ergebnisse verwenden 5637 Zellen, die weniger als 10 Subkulturen unterzogen haben.

1. Mit einer sterilen Pinzette, kehren die durchlässigen Träger in einer sterilen 25 mm tiefe Gewebekulturschale.
2. Trypsinieren eine 75 cm ^2-Kolben von 5637 Zellen bei 95% Konfluenz nach den Schritten 1.4.1-1.4.3.
3. Verwendung einer 1,000 ul-Pipette vorsichtig resuspendieren in ~ 2 ml RPMI + in einer Konzentration von 3 x 10 ⁶ Zellen / ml, die durch Zellzählung unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt.
4. Anwenden 50 ul der Zellsuspension (1,5 x 10 ⁵ Zellen) in jede durchlässige Träger ohne Berührung der Membran. Den Deckel auf die Schüssel, und vorsichtig die Schale bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für nicht mehr als 16 Stunden.
5. Mit einer sterilen Pinzette, rechts die durchlässigen Träger in eine 24-Well-Platte mit 0,6 ml RPMI + pro Vertiefung. 0,1 ml RPMI + in den oberen Stausee von jedem durchlässigen Träger. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO _2.
6. Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage. Zuerst saugen Medium aus dem Oberbecken, gefolgt von dem Unterbecken, und dann gilt frischem RPMI + in umgekehrter Reihenfolge, um das untere Reservoir (0,6 ml) und dann den oberen Reservoir (0,1 ml).
7. Sieben Tage nach dem Aussäen der durchlässigen Träger mit 5637 Zellen beurteilen Konfluenz der Zellen. Füllen Sie das Oberbecken mit RPMI + (~ 0,35 ml). Die Zellen konfluent genug, wenn das Medium nicht zwischen den oberen und unteren Behältern äquilibrieren.

3. Herstellung des bakteriellen Inokulums

1. Unter aseptischen Bedingungen 20 ml geeigneten Kulturbrühe in einen 250-ml-Kolben mit einer Kappe. Verwenden Luria-Bertani (LB)-Bouillon für die E. coli-Kulturen, und Antibiotika hinzufügen, um die Brühe gegebenenfalls.
2. Mit einer sterilen Impföse, impfen die Brühe mit Bakterien aus einem Glycerin-Lager oder einem Streifen Platte. Für UPEC Stämme, Inkubation der Bakterienkultur bei 37 ° C für ca. 16 h ohne Schütteln (zur Förderung der Produktion von Typ-1-Pili).
3. Übertragen die Bakterienkultur in ein Zentrifugenröhrchen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 10 min.
4. Den Überstand umfüllenUnd Resuspendieren der Bakterien in PBS auf eine OD ₆₀₀ = 1,000, entsprechend ~ 10 ⁹ CFU / ml.
   1. Um eine durch Wärme abgetöteten Bakterien Stimulus erzeugen, Inkubation eines Aliquots (z. B. ~ 1,5 × 10 ⁸ CFU in 150 &mgr; l) der resuspendierten Bakterien bei 55 ° C für 30 min. Platte einen aliquoten Teil der Hitze abgetötete Bakteriensuspension auf den Tod bestätigen.
5. Unmittelbar vor der Anwendung verdünnen die Bakterien resuspendiert (live oder Hitze abgetöteten) 10-fach bis 10 ⁸ CFU / ml in warmen Serum-freien RPMI [bezeichnet RPMI-] in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

4. Isolierung menschlicher Neutrophile aus peripherem Blut

Die Sammlung von Blut von erwachsenen Freiwilligen bedarf der vorherigen Prüfung und Genehmigung von einem Institutional Review Board. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung und entsorgen Gefahrstoffe, um die Exposition der menschlichen Blut zu vermeiden.

1. Etwa 25 ml venöses Blut von gesunden Erwachsenen volunteer sollte durch geschultes Personal in Aderlass in 3 sterile Natrium-Heparin-haltigen Blutentnahmeröhrchen gezogen werden.
   1. Dicht wickeln eine Gummiaderpresse um den Oberarm, über dem Ellbogen.
   2. Desinfizieren Sie die Eintrittsstelle, die Ellenbeuge, mit einer sterilen 70% Alkoholtupfer.
   3. Bringen Sie ein Kunststoffrohrhalter zu einem geflügelten Butterfly-Nadel-System.
   4. Führen Sie die Nadel in eine Antekubitalvene in einem 30 °-Winkel oder weniger, Kegel nach oben ein. Die Nadel in die Vene punktiert, wenn ein Strahl von Blut in dem Kunststoffrohr angezeigt wird.
   5. Legen Sie eine Blutentnahmeröhrchen in die Kunststoffrohrhalter. Wenn die erste Sammelrohr voll ist, ersetzen mit der zweiten Sammelrohr. Wiederholen Sie mit der dritten Röhre.
   6. Wenn die dritte Sammelrohr ist etwa halb voll ist, entfernen Sie den Stauschlauch.
   7. Decken Sie die Einstichstelle mit einem sterilen Wattebausch und langsam aus der Vene ziehen Sie die Nadel. Schieben Sie den Schutzschirm über der Nadel und Ort ina Biohazard Behälter für scharfe Gegenstände.
   8. Üben Sie Druck auf die Einstichstelle. Decken Sie die Einstichstelle und Wattebausch mit einem Pflaster.
   9. Vorsichtig invertieren die Blutentnahmeröhrchen, um die Heparin zu zerstreuen.

Führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube unter aseptischen Bedingungen.

2. Mit einem 10 ml-Pipette vorsichtig das Blut zu übertragen, um eine frische, sterile 50 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen eines äquivalenten Volumens von 3% (w / v) Dextran in 0,9% NaCl und mischen durch Umkehrung. Das Röhrchen stehend bei Raumtemperatur für 20 min.
3. Ohne Unterbrechung der unteren Schicht, sorgfältig absaugen obere Schicht und die Übertragung auf einen neuen 50 ml konischen Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min. Überstand verwerfen.
4. Zellpellet in einem Volumen von 0,9% NaCl äquivalent zu dem Ausgangsvolumen des Blutes.
5. Schicht 10 ml Dichtezentrifugation Lösung unter der Zellsuspension, S.Reservierung der Grenzfläche zwischen den beiden Phasen. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min ohne Bremse. Überstand verwerfen.
6. Um verbleibenden roten Blutkörperchen lysiert, Zellpellet in 10 ml kaltem 0,2% NaCl. Inkubation für 30 Sekunden, und dann sofort 10 ml kaltem 1,6% NaCl in den Isotonie wieder herzustellen.
7. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 6 min. Überstand verwerfen.
8. Wiederholen Sie die Schritte, bis 4,6-4,7 das Zellpellet erscheint frei von roten Blutzellen, in der Regel drei Runden der Lyse zu sein.
9. Verwendung eines 1,000 &mgr; Pipette Zellpellet, in erster Linie PMN, in warmem (37 º C) RPMI in einer Konzentration von 10 ⁷ Zellen / ml, die durch Zellzählung unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Halten der Zellen bei 37 ° C bis zur Verwendung. Typischerweise PMN Lebensfähigkeit und Reinheit> 99%, wie durch Trypanblau-Ausschluß und Visualisierung von Kernmorphologie nach Färbung bzw. beurteilt.

5. Transuroepithelial Neutrophilen-Migration alssagen

Führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie nur durchlässigen Träger Lager 5637 konfluenten Zellschichten, wie in Schritt 2.7 bestimmt. Die 24-Well-Platten, enthaltend RPMI-können im Voraus hergestellt werden, und bei 37 ° C gehalten, mit 5% CO ₂ bis zur Verwendung.

1. Aliquot 1 ml RPMI-erwärmen pro Well in einer 24-Well-Platte; vorbereiten 3 Wells pro lässigen Träger.
2. Aspiration des Mediums von den oberen und unteren Reservoirs der durchlässigen Träger.
3. Mit einer sterilen Pinzette, übertragen Sie die durchlässigen Träger an die 24-Well-Platte in Schritt 5.1 vorbereitet. Drei Mal durch die Übertragung der Unterstützungen von Brunnen zu Brunnen Waschen der durchlässigen Träger.
4. Wenn eine bakterielle Inokulum verwendet werden, kehren die durchlässige Träger in einer sterilen 25 mm tiefe Gewebekulturschale. Wenn ein chemoattractant (zB N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) oder IL-8) verwendet werden soll, gehen Sie zu Schritt 5.6.
5. Für Experimente mit lebenden oder getötet bactErial Stimuli inokulieren der apikalen Seite einer jeden durchlässigen Träger mit 60 ul RPMI-(Mock-Infektion) oder mit dem bakteriellen Inoculum (6 × 10 ⁶ CFU) in Schritt 3.5 hergestellt. Den Deckel auf die Schüssel und bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 1 Stunde.
6. In 0,6 ml RPMI-pro auch auf eine 24-Loch-Low-Befestigungsplatte, bereiten ein gut durchlässigen Träger pro. Bereiten 3 Brunnen mit 0,5 ml RPMI-zu Eingangs PMN aufzuzählen.
   1. Wenn ein chemoattractant wird an Stelle von Bakterien verwendet wird, fügen Sie die chemoattractant auf 0,6 ml RPMI-in der 24-Well-Platte in Schritt 5.6 vorbereitet.
7. Rechts die durchlässigen Träger in den 24-Loch-Low-Befestigungsplatte.
8. 0,1 ml PMN (10 ⁶ PMN), die in Schritt 4.9 hergestellt, mit dem oberen Behälter (basolateralen Seite) einer jeden durchlässigen Träger. 100 l PMN direkt an Vertiefungen mit 500 ul RPMI-. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 1 Stunde.
9. Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig kratzen dieMembran des durchlässigen Träger gegen den Rand der Vertiefung zusätzliche PMN von der apikalen Seite zu entfernen, und dann entsorgt des Trägers.
10. Sammeln PMN durch leichtes Kratzen der Boden jeder gut mit dem 1000 ul Pipettenspitze und übertragen PMN Suspensionen Mikrozentrifugenröhrchen auf.
11. Auflisten von PMN mit einer Zählkammer.
12. Um die Gesamtzahl von PMN in das untere Reservoir berechnen, multiplizieren Sie die Anzahl der PMN in 1 mm ² (100 nl) von 6000. Daten können als Prozentsatz der Eingangs PMN gemeldet werden, oder als PMN Nummern 10 ⁶ PMN Eingangs normalisiert.

Ergebnisse

Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay ermöglicht die quantitative Bewertung der menschlichen PMN-Migration in kultivierten Epithelzellen Blasenschichten als Reaktion auf verschiedene Reize (Abbildung 1B). Während das Protokoll ist einfach, es gibt eine Reihe von Variablen, die PMN-Migration zu beeinflussen und folglich auf die Reproduzierbarkeit des Assays kann. Die Maßnahmen sollten während der Vorbereitung die durchlässigen Träger und der PMN an Variabilität zwischen technischen und biolo...

Diskussion

Mit einem kultivierten Blasenzelllinie und frisch isolierten menschlichen PMN, haben wir ein in vitro Modell der transuroepithelial Migration von Neutrophilen. Dieses Modell wurde bei der Anfang, um die Komplexität der angeborenen Immunantwort während Harnwegsinfektion (HWI), eine extrem häufige bakterielle Infektion in der Regel durch UPEC ⁹ verursacht sezieren. Während der Infektion der Blase oder Zystitis ist Rekrutierung von PMN zu den Blasenlumen wichtig für bakterielle Clearance ^10. ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Transwell-Einsätze (d.h.  durchlässige Stützen)	Corning	3472 6,5	mm, 3 μ m Poren, Polyester-Membraneinsatz
BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml grüne Kappe Röhrchen mit Natriumheparin
BD Safety-Lok Blutentnahme- und Infusionsset	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0,75 Zoll Nadel x 12 Zoll
BD Vacutainer zum Einmalgebrauch, nicht stapelbarer	Halter Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	Aus Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS Dichte-Zentrifugationslösung	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-Well, klarer flacher Boden
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	rekonstituiert in DMSO zu 10 mM
rekombinantem humanem CXCL8/IL-8	R& D Systems	208-IL	Rekonstituierung in PBS auf 100 μ g/ml

Schlauch