Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.
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Methodenartikel
Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Homogenisierung Wulst Prügel ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit, DNA, RNA, Proteine und Metaboliten aus Hefe-Zellen, die notorisch schwer zu stören sind freizugeben. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Perlmühle homogenisiert zur Gewinnung von Proteinen in Puffer optimiert, um die Funktionen, die Interaktion und post-translationalen Modifikationen von Proteinen zu erhalten. Logarithmisch wachsenden Zellen, die das Protein von Interesse in einem flüssigen Wachstumsmedium Wahl geworden. Die Nährmedien mit Reagenzien können ergänzt werden, um die Proteinexpression von Promotoren (zB Galaktose) zu induzieren, synchronisieren Zellzyklusstadium (zB Nocodazol) oder hemmen Proteasom-Funktion (zB MG132). Die Zellen werden dann pelletiert und in einem geeigneten Puffer, der Protease und / oder Phosphatase-Inhibitoren und entweder sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung. Homogenisierung wird durch sechs Zyklen von 20 sec erreicht bead-Schlagen (5,5 m / sec), die jeweils von einem minütigen Inkubation auf Eis. Das erhaltene Homogenisat wird durch Zentrifugation geklärt und kleine Partikel kann durch Filtration entfernt werden. Die resultierende gelöscht Ganzzellextrakt (WCE) ausgefällt mit 20% TCA zur direkten Analyse des gesamten Proteine durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting. Extrakte eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinen, die Detektion von post-translationalen Modifikationen, oder der Analyse der Co-Reinigung von Proteinen. Wie bei den meisten Proteinreinigung Protokolle können einige Enzyme und Proteine eine eindeutige Bedingungen oder Puffer-Zusammensetzungen für die Reinigung und andere möglicherweise instabil oder unlöslich ist unter den angegebenen Bedingungen. Im letzteren Fall kann das Protokoll präsentiert einen nützlichen Ausgangspunkt, um empirisch die besten Perlen-Prügel Strategie für Protein Extraktion und Reinigung. Wir zeigen die Extraktion und Reinigung eines epitopmarkierter SUMO E3 Ligase Siz1 ein Zellzyklusreguliertes Protein, das sowohl sumoyliert und phosphoryliert, sowie eine gezielte SUMO-Ubiquitin-Ligase-Untereinheit Slx5 wird.
Einleitung
Die gewaltige Kraft der Hefegenetik ist legendär, aber die Vorbereitung und Analyse von nativen Proteinen aus Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist oft mit Problemen behaftet. Letzteres ist aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit und Elastizität der Hefezellwand 1. Verschiedene Mittel sind für die enzymatische, chemische, mechanische und Druck auf die Unterbrechung des Hefe-Zellen zu erhalten, Ganzzell-Proteinextrakt 2-6 beschrieben. Diese Techniken sind sehr unterschiedlich in ihrer Wirksamkeit zu Zell-Vertreter, native Protein-Extrakte, die für spätere Analysen oder Reinigungsschritte verwendet werden können, zu erhalten. Zum B....
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Protokoll
Reinigung von 6xHis-markierte Proteine in Hefe-Zellen unter nativen Bedingungen ausgedrückt
1. Wachstum von Hefe-Zellen und Induktion der Proteinexpression
(Geändert von 2)
Optional: Verwenden logarithmisch wachsenden Hefekulturen Ausdruck Protein von Interesse anstelle der Galaktose-induzierten Kulturen beschrieben.
- Verwandeln Zellen eines Gal + Hefestamm mit einem Plasmid, das ein Galaktose-induzierbaren 6XHIS-markierten Protein der Wahl. Siehe zum Beispiel Reagenzien Liste.
- Impfen Transformanten in 5 ml geeigneten selektiven Medien (z. B. SD-Uracil)....
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Ergebnisse
Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Perlen-Schläge und Protein Extraktionsprotokoll nützlich für die reproduzierbare Herstellung von Proteinen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen (in Tabelle 2). SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung von WCES gefolgt zeigen, dass eine Vielzahl von Proteinen (~ 12 bis> 250 kDa) reproduzierbar aus Hefezellen (1A) extrahiert werden. Diskrete Bands über einen Bereich von Molekulargewichten sind bezeichnend für hochwe.......
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Diskussion
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von intakten, nativen und posttranslational modifizierte Proteine von Hefe-Zellen für down-stream Applikationen. Bevor dieses Protokoll, ist es wichtig zu bestimmen, ob das Protein von Interesse kann leicht in Proteinextrakte unter denaturierenden Bedingungen 12 hergestellt detektiert werden. Wenn polyklonale Antikörper nicht verfügbar sind, kann es vorteilhaft sein, Epitop-Markierung des Proteins von Interesse, so dass das Fusionsprotein auf Western-Bl.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken allen Mitgliedern der Kerscher Labor für ihre Unterstützung. Wir danken Mark für Hochstrasser Hefestamm MHY3765. Diese Arbeit wurde von der NSF 1051970 (OK) und Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reisestipendium und Monroe Scholars Program Grant (ES) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Hefe-ORF-Stamm in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ Hefestamm, der für die Induktion und Extraktion verwendet werden |
| kann pYES2.1 TOPO Vektor | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ Hefestamm, der für Induktion und Extraktion verwendet werden kann; enthält einen V5/6xHIS Tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail ( 100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2,0 ml Röhrchen mit Sockel und angebundenem Schraubverschluss | BioExpress | C-3369-3 | Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen richtig in den Perlenruptor passt |
| Glasperlen, säuregewaschen, 425-600 & micro; m (30-40 US-Sieb) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X Zentrifugenröhrchenfilter | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Zur zusätzlichen Filterung von geklärtem Lysat |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Für die Aufreinigung von 6xHIS-markierten Proteinen |
| NuPAGE LDS Probenpuffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | Zur Vorbereitung und/oder Eluierung von Proben vor SDS-PAGE und Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Fertiggele, die häufig für SDS-PAGE vor Western Blotting verwendet werden |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein-Gel-Färbung |
| Säugetier-Lysepuffer | Promega | G9381 | Alternativer kommerzieller Lysepuffer |
| Anti-V5-Agarose | Sigma | A7345 | Methode der Immunpräzipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF-Membran | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS Gele | Life Technologies | NP0321BOX | |
| Anti-Myc-Antikörper | Covance | mms-150R | |
| Sekundärantikörper | Abcam | ab97040 | Ziege pAb zu Maus IgG (HRP) |
Referenzen
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19....
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Nachdrucke und Genehmigungen
