Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

1. In vivo Analyse der Skelettmuskelstruktur durch Doppelbrechung

Bereiten Sie am
1. späten Nachmittag nach der Fütterung Paarungskäfige vor, in denen das Männchen vom Weibchen der gewünschten Zebrafischlinie(n) getrennt wird.
   1. Unterscheiden Sie Weibchen an ihrem größeren Unterbauch und der leichten blau-weißen Färbung und Männchen an ihrer schlanken Körperform und ihren rosa/gelben Farbtönen.
   2. Der Erfolg bei paarweisen Kreuzungen (ein Männchen und ein Weibchen) kann nur etwa 50% betragen. Für eine höhere Erfolgsquote verpaaren Sie ein Männchen mit 2-3 Weibchen.
2. Entfernen Sie die Käfigtrennwände am nächsten Morgen kurz nach Lichteinbruch und lassen Sie die Fische ungestört laichen.
3. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb, wenn eine ausreichende Anzahl befruchteter Eier auf den Boden des Tanks gelegt wurde.
4. Übertragen Sie die Embryonen in eine tiefe Petrischale, indem Sie das Sieb mit Fischwasser spülen, und setzen Sie die Elternfische in ihre Tanks zurück. Legen Sie die Schalen mit den Embryonen in einen 28,5 °C heißen Inkubator.
5. Reinigen Sie die unbrauchbaren Eier und Ablagerungen später am Tag oder am nächsten Morgen und legen Sie die Embryonen für das weitere Wachstum in den Inkubator zurück.
6. Embryonen/Larven erreichen das geeignete Alter, um 3-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) eine Doppelbrechung zu beobachten, da die Ergebnisse vor 3 dpf möglicherweise unter einem begrenzten Kontrast leiden können. Wildtyp-Embryonen schlüpfen zwischen 48 und 60 Stunden nach der Befruchtung (hpf) aus ihren Chorionen, gefolgt von einer Aufrichtung der Körperachse. Spät geschlüpfte Wildtyp- oder mutierte Embryonen können eine manuelle Dechorionierung erfordern.
   1. Machen Sie mit einer scharfen Pinzette vorsichtig einen Riss in den Chorion und drehen Sie ihn auf den Kopf, so dass der Embryo herausfällt.
   2. Lassen Sie dechorionierte Embryonen sich begradigen, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
   3. Betäuben Sie die Embryonen mit Tricain (0,04 % in Fischwasser), um ihre korrekte Positionierung zu unterstützen.
7. Statten Sie ein Präpariermikroskop mit einer polarisierten Linse aus, die gedreht werden kann, um den Winkel des polarisierten Lichts einzustellen (Abbildung 1A).
8. Platzieren Sie dechorionierte, anästhesierte Embryonen direkt auf einer zweiten polarisierten Linse entlang der lateralen Achse des Körpers. Die zweite Linse sollte unterhalb der oberen Linse auf dem Mikroskoptisch positioniert werden (Abbildung 1B). Verwenden Sie während des Doppelbrechungstests zu keinem Zeitpunkt Petrischalen aus Kunststoff, da Kunststoff kein geeignetes Medium für die Übertragung von gebrochenem Licht ist.
9. Drehen Sie die obere Linse mit dem interessierenden Embryo im Blickfeld, bis die Polarisationsachsen der beiden Linsen im 90°-Winkel zueinander ausgerichtet sind und der Hintergrund vollständig dunkel ist.
10. Die optimale Ausgabe des Assays hängt von der Ausrichtung der Fische zwischen zwei polarisierten Linsen ab. Bewegen Sie den Fisch herum, um sicherzustellen, dass er so flach wie möglich liegt.
    1. Wenn der Fisch gekrümmt ist, lassen nur die Segmente mit dieser flachen Ausrichtung das polarisierte Licht durch und weisen eine Doppelbrechung auf. In solchen Fällen ist die Doppelbrechung in den flachen Bereichen zu messen und die Doppelbrechung der entsprechenden Fläche bei den Wildtyp-Fischen (z. B. Somiten 1-10 sowohl bei Wildtyp- als auch bei mutierten Fischen) zu erfassen.
11. Beobachten Sie den doppelbrechenden Phänotyp des Fisches.
    1. Wildtyp-Fische mit hochorganisierter Skelettmuskulatur zeigen eine helle Doppelbrechung, da der Brechungsindex für das Licht parallel zu den Myofilamenten höher ist als das polarisierte Licht senkrecht zu diesen Strukturen.
    2. Fische mit einer desorganisierten Skelettmuskulatur, die auf eine nicht-degenerative Myopathie oder einen Entwicklungsdefekt hindeuten, zeigen typischerweise eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung.
    3. Fische mit unorganisierter Skelettmuskulatur, die für eine Muskeldystrophie charakteristisch sind, weisen häufig ein fleckenartiges Muster der Doppelbrechung auf, wobei dunkle Bereiche eine Muskeldegeneration zwischen hellen Bereichen normaler Muskelarchitektur darstellen.
12. Quantifizieren Sie die Doppelbrechung, indem Sie Bilder von Wildtyp- und mutierten Fischen unter polarisiertem Licht bei gleichen Belichtungseinstellungen und Vergrößerungen aufnehmen. Speichern Sie Bilder als .tiff Dateien.
    1. Öffnen Sie Doppelbrechungsbilder in der ImageJ-Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Wählen Sie für jedes Bild den Bereich des Zebrafischmuskels aus, indem Sie mit der Option "Polygonauswahl" in der Symbolleiste eine Linie um den Körper ziehen.
    3. Verwenden Sie "Messungen festlegen" im Dropdown-Menü "Analysieren", um die erforderlichen Statistiken für das Bild auszuwählen.
       1. Die Mindestauswahl erfordert, dass die Kontrollkästchen für "Bereich", "Mittlerer Grauwert" und "Minimaler und maximaler Grauwert" aktiviert sind.
       2. Ein maximaler Grauwert von >255 gibt die Pixelsättigung an. Verwenden Sie daher Bilder mit maximalen Grauwerten von weniger als 255.
    4. Normalisieren Sie die mittlere Intensität mit dem ausgewählten Bereich und wiederholen Sie das gleiche Quantifizierungsverfahren für jedes Doppelbrechungsbild.

2. Assay für berührungsevoziertes Fluchtverhalten

1. Bilden Sie Paarungen der entsprechenden Zebrafischlinie(n) und entnehmen Sie Embryonen, wie oben in den Schritten 1.1-1.5 beschrieben.
2. 2-7 Tage nach der Befruchtung legen Sie dechorionierte Embryonen/Larven einzeln in eine tiefe Petrischale oder in die Kammern von Multiwell-Platten.
3. Wenn Sie jeweils nur mit einem Embryo arbeiten, zentrieren Sie den Embryo im Sichtfeld eines Nikon SMZ1500-Stereomikroskops mit einem SPOT RT3 Digitalkamerasystem oder ähnlichem und beginnen Sie mit der sequentiellen Bildgebung.
   1. Die gleiche Häufigkeit der Bildgebung sollte sowohl für Wildtyp- als auch für mutierte Fische verwendet werden. Es werden Bildraten >30 Hz empfohlen, da langsamere Raten in der Regel nicht ausreichen, um das schnelle Schwimmen von Wildtyp-Fischen einzufangen.
4. Geben Sie mechanosensorische Reize an den Embryo ab, indem Sie den Schwanz mit einer Insektennadel berühren.
5. Beenden Sie die Bildgebung, wenn der Embryo aufgehört hat zu schwimmen oder aus dem Sichtfeld geschwommen ist.
6. Konvertieren Sie sequenzielle Bilder in eine Videodatei oder analysieren Sie einzelne Frames von Zeitrafferbildern offline mit der Software SPOT 5.1 Advanced. Ähnliche Softwarepakete umfassen Open Lab, NIS Elements oder das frei verfügbare ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
7. Quantifizieren Sie das Schwimmverhalten, indem Sie die berührungsprovozierte Reaktion in mehreren Embryonen durchführen.
   1. Dies kann erreicht werden, indem die Entfernung, die Embryonen innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls schwimmen können, mit Hilfe einer Software oder eines metrischen Lineals gemittelt wird, um den Start- und Endpunkt des Schwimmtrainings zu markieren.
   2. Vermeiden Sie, dass sich Embryonen im Laufe der Zeit an den Berührungsreiz gewöhnen, indem Sie den Assay bei jeder experimentellen Wiederholung mit einem neuen Embryo durchführen. Das Verhalten in Wildtyp- und zuverlässigen Mutantenmodellen ist in der Regel hochgradig reproduzierbar.

Die Doppelbrechung kann als effizienter, nicht-invasiver Assay verwendet werden, um Licht auf den Zustand der myofibrillären Organisation in lebenden Zebrafischembryonen zu werfen. Beispiele von Wildtyp-Zebrafischen sowie von Zebrafischen mit verminderter Expression von Genen, die für die Entwicklung und Funktion der Skelettmuskulatur entscheidend sind, werden vorgestellt. Wildtyp-Zebrafische mit 5 dpf zeigen unter polarisiertem Licht aufgrund der geordneten Anordnung von Myofilamenten eine stark doppelbrechende Skelettmuskulatur (Abbildungen 2A-B). Im Gegensatz dazu zeigt ein altersangepasster Embryo, der homozygot für eine pathogene Mutation im Dystroglykan-Gen (dag1) ist, eine fleckige Doppelbrechung, die auf Bereiche mit Muskeldegeneration hinweist (Abbildungen 2C-D)2. Dieses fleckenartige Muster und das schnelle Fortschreiten der Muskeldegeneration während der frühen Entwicklung stimmt mit anderen dystrophischen Fischmodellen überein1,3. Die Quantifizierung der Doppelbrechung von 5 dpf dystrophischen dag1-Mutanten zeigt eine signifikante Verringerung der Helligkeit auf 27,9%±5,3 % der maximalen Doppelbrechung, die bei ihren Wildtyp-Geschwistern beobachtet wurde. Diese Reduktion ist schwerwiegender als die Reduktion auf 52,4 %±5,5, die bei myopathischen mtm1-Morphanten mit 3 dpf beobachtet wurde (Wildtyp/dag1/mtm1: n = 3; t-Test des Schülers, P < 0,001) (Abbildung 4). Myopathische Fischmodelle (Abbildungen 3C-D) zeigen stattdessen tendenziell eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung im Vergleich zum Wildtyp (Abbildungen 3A-B), da es oft eine myofibrilläre Desorganisation in den großen axialen Skelettmuskeln gibt, aber keine Hinweise auf degenerative Veränderungen.

Berührungsevoziertes Fluchtverhalten kann verwendet werden, um zu zeigen, dass Zebrafischmodelle von Skelettmuskelerkrankungen Bewegungsstörungen und Schwimmschwierigkeiten aufweisen. Die lebenden Schwimmphänotypen von Wildtyp- und Dag1-Fischen wurden mittels Videomikroskopie mit einem berührungsevozierten Fluchtverhaltensassay untersucht (Videos 1 und 2)2. Die Videos wurden dann Bild für Bild analysiert, um zu bestätigen, dass dag1-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine beeinträchtigte Bewegung als Reaktion auf taktile Reize aufweisen (Abbildung 5). Die Entfernungen, die beide Embryonentypen innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls zurücklegen konnten, wurden gemittelt (Wildtyp: 6,2±0,4 cm/0,1 sec, n = 10; Mutante: 0,75±0,08 cm/0,1 sec, n = 10; Student's t-Test, P < 0,001) und weisen auf eine verminderte motorische Funktion bei dag1-Mutanten hin. Verminderte Berührungs-Evoke-Reaktionen bei neuromuskulären Mutanten könnten jedoch auch auf Defekte im Zentralnervensystem und/oder der neuromuskulären Verbindung zurückzuführen sein. Daher kann die elektrophysiologische Messung der Spannungsantwort in Muskeln, die durch taktile Stimulation hervorgerufen werden, helfen zu unterscheiden, ob Berührungsstörungen auf ein sensorisches Defizit oder auf einen primären Defekt in der Skelettmuskulatur zurückzuführen sind13.

Abbildung 1. Schema eines Standard-Präpariermikroskops, das mit einer Kamera und polarisierten Linsen (A) ausgestattet ist. Der Probenaufbau mit polarisierten Linsen und anästhesierten Zebrafischembryonen ist in (B) größer dargestellt. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 2. Wildtyp-Fische zeigen eine helle Doppelbrechung, die auf eine stark organisierte Muskulatur bei 5 dpf (B) hinweist. Altersangepasste dag1-mutierte Fische erscheinen bei normalem Licht grob normal, während eine ausgedehnte Muskeldegeneration bei den meisten Somiten durch den Verlust der Doppelbrechung unter polarisiertem Licht demonstriert wird und mit einem dystrophischen Phänotyp übereinstimmt (D). Hellfeldbilder des Wildtyp-Fisches (A) und der dag1-Mutante (C) werden als Referenz gezeigt. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 3. Der Morpholino-basierte Knockdown von Myotubularin (mtm1) im Zebrafisch führt zu Defekten in der Skelettmuskulatur bei 3 dpf. Eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung wird bei mtm1-morphanten Fischen (D) im Vergleich zu Wildtyp-Fischen (B) beobachtet, was mit einem myopathischen Phänotyp übereinstimmt. Hellfeldbilder des Wildtyp-Fisches (A) und der mtm1-Morphante (C) werden als Referenz gezeigt. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 4. Zebrafischembryonen mit Skelettmuskeldefekten zeigen eine hochsignifikante Reduktion der Doppelbrechung im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen. Die Quantifizierungsdaten werden berechnet, indem die mittlere Intensität durch den ausgewählten Bereich des Fisches dividiert wird (ImageJ) und die Prozentwerte auf Wildtyp normalisiert werden. Die Daten werden als Mittelwerte±SEM dargestellt und ** zeigt P < 0,001 durch den Student's t-Test an. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Abbildung 5. Dag1-mutierte Embryonen zeigen eine verminderte berührungsevozierte Reaktion bei 5 dpf (E-K), während die mechanosensorische Stimulation dazu führt, dass 5 dpf Wildtyp-Embryonen schnell wegschwimmen und das Sichtfeld vollständig verlassen (A-D). Maßstabsleiste = 1 mm. Klicken Sie hier, um das Bild zu vergrößern.

Video 1. Assay des berührungsevozierten Fluchtverhaltens an Wildtyp-Zebrafischen. Normale Jungfische (5 dpf) schwimmen bei Berührung sehr schnell weg. Klicken Sie hier, um das Video anzusehen.

Video 2. Assay des berührungsevozierten Fluchtverhaltens an dag1-mutierten Zebrafischen. Dag1-Brutzellen (5 dpf) reagieren beeinträchtigt auf Berührungen und verlassen das Sichtfeld nicht. Klicken Sie hier, um das Video anzusehen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.