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Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

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DOI:

10.3791/50925

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13. Dezember 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist mittlerweile ein etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug zur Modellierung von Muskeldystrophien, angeborenen Myopathien und verwandten neuromuskulären Erkrankungen. Doppelbrechung und berührungsevoziertes Fluchtverhalten sind zwei gängige nicht-invasive Assays, die verwendet werden, um den Grad der Muskeldesorganisation und der Beeinträchtigung des Bewegungsapparates von Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung zu bestimmen.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) sind zu einem besonders effektiven Werkzeug für die Modellierung menschlicher Krankheiten geworden, die die Skelettmuskulatur betreffen, einschließlich Muskeldystrophien1-3, angeborene Myopathien4,5 und Störungen in der sarkomerischen Assemblierung6,7, aufgrund hoher genomischer und struktureller Konservierung bei Säugetieren8. Muskeldesorganisation und Beeinträchtigung des Bewegungsapparates können beim Zebrafisch in den ersten Tagen nach der Befruchtung schnell beurteilt werden. Zwei Assays zur Charakterisierung von Skelettmuskeldefekten beim Zebrafisch sind die Doppelbrechung (strukturell) und die berührungsevozierte Fluchtreaktion (verhaltensbezogen).

Doppelbrechung ist eine physikalische Eigenschaft, bei der Licht beim Durchgang durch geordnete Materie, wie z.B. die pseudokristalline Anordnung von Muskelsarkomeren9, gedreht wird. Es handelt sich um einen einfachen, nicht-invasiven Ansatz zur Beurteilung der Muskelintegrität bei durchscheinenden Zebrafischlarven in einem frühen Entwicklungsstadium. Wildtyp-Zebrafische mit hochorganisierten Skelettmuskeln erscheinen sehr hell vor einem dunklen Hintergrund, wenn sie zwischen zwei polarisierten Lichtfiltern visualisiert werden, während Muskelmutanten Doppelbrechungsmuster aufweisen, die spezifisch für die primäre Muskelerkrankung sind, die sie modellieren. Zebrafische, die Muskeldystrophien modellieren, Krankheiten, die durch Myofaserdegeneration gefolgt von wiederholten Regenerationsrunden gekennzeichnet sind, zeigen degenerative dunkle Flecken in der Skelettmuskulatur unter polarisiertem Licht. Nichtdystrophische Myopathien sind nicht mit Nekrosen oder regenerativen Veränderungen verbunden, sondern führen zu unorganisierten Myofasern und Skelettmuskelschwäche. Myopathische Zebrafische zeigen typischerweise eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung, was die Desorganisation der Sarkomere widerspiegelt.

Der berührungsevozierte Escape-Assay beinhaltet die Beobachtung des Schwimmverhaltens eines Embryos als Reaktion auf taktile Stimulation10-12. Im Vergleich zu Wildtyp-Larven zeigen mutierte Larven häufig eine schwache Fluchtkontraktion, gefolgt von langsamem Schwimmen oder einer anderen Art von Bewegungseinschränkung, die die Larven nicht mehr als eine kurze Strecke vorantreibt12. Der Vorteil dieser Assays besteht darin, dass das Fortschreiten der Krankheit bei derselben Fischart mehrere Tage lang in vivo überwacht werden kann und dass eine große Anzahl von Fischen in kurzer Zeit im Vergleich zu höheren Wirbeltieren analysiert werden kann.

Protokoll

1. In vivo Analyse der Skelettmuskelstruktur durch Doppelbrechung

    Bereiten Sie am
  1. späten Nachmittag nach der Fütterung Paarungskäfige vor, in denen das Männchen vom Weibchen der gewünschten Zebrafischlinie(n) getrennt wird.
    1. Unterscheiden Sie Weibchen an ihrem größeren Unterbauch und der leichten blau-weißen Färbung und Männchen an ihrer schlanken Körperform und ihren rosa/gelben Farbtönen.
    2. Der Erfolg bei paarweisen Kreuzungen (ein Männchen und ein Weibchen) kann nur etwa 50% betragen. Für eine höhere Erfolgsquote verpaaren Sie ein Männchen mit 2-3 Weibchen.
  2. Entfernen Sie die Käfigtrennwände am nächsten Morgen kurz nach Lichteinbruch und lassen Sie die Fische ungestört laichen.
  3. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb, wenn eine ausreichende Anzahl befruchteter Eier auf den Boden des Tanks gelegt wurde.
  4. Übertragen Sie die Embryonen in eine tiefe Petrischale, indem Sie das Sieb mit Fischwasser spülen, und setzen Sie die Elternfische in ihre Tanks zurück. Legen Sie die Schalen mit den Embryonen in einen 28,5 °C heißen Inkubator.
  5. Reinigen Sie die unbrauchbaren Eier und Ablagerungen später am Tag oder am nächsten Morgen und legen Sie die Embryonen für das weitere Wachstum in den Inkubator zurück.
  6. Embryonen/Larven erreichen das geeignete Alter, um 3-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) eine Doppelbrechung zu beobachten, da die Ergebnisse vor 3 dpf möglicherweise unter einem begrenzten Kontrast leiden können. Wildtyp-Embryonen schlüpfen zwischen 48 und 60 Stunden nach der Befruchtung (hpf) aus ihren Chorionen, gefolgt von einer Aufrichtung der Körperachse. Spät geschlüpfte Wildtyp- oder mutierte Embryonen können eine manuelle Dechorionierung erfordern.
    1. Machen Sie mit einer scharfen Pinzette vorsichtig einen Riss in den Chorion und drehen Sie ihn auf den Kopf, so dass der Embryo herausfällt.
    2. Lassen Sie dechorionierte Embryonen sich begradigen, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
    3. Betäuben Sie die Embryonen mit Tricain (0,04 % in Fischwasser), um ihre korrekte Positionierung zu unterstützen.
  7. Statten Sie ein Präpariermikroskop mit einer polarisierten Linse aus, die gedreht werden kann, um den Winkel des polarisierten Lichts einzustellen (Abbildung 1A).
  8. Platzieren Sie dechorionierte, anästhesierte Embryonen direkt auf einer zweiten polarisierten Linse entlang der lateralen Achse des Körpers. Die zweite Linse sollte unterhalb der oberen Linse auf dem Mikroskoptisch positioniert werden (Abbildung 1B). Verwenden Sie während des Doppelbrechungstests zu keinem Zeitpunkt Petrischalen aus Kunststoff, da Kunststoff kein geeignetes Medium für die Übertragung von gebrochenem Licht ist.
  9. Drehen Sie die obere Linse mit dem interessierenden Embryo im Blickfeld, bis die Polarisationsachsen der beiden Linsen im 90°-Winkel zueinander ausgerichtet sind und der Hintergrund vollständig dunkel ist.
  10. Die optimale Ausgabe des Assays hängt von der Ausrichtung der Fische zwischen zwei polarisierten Linsen ab. Bewegen Sie den Fisch herum, um sicherzustellen, dass er so flach wie möglich liegt.
    1. Wenn der Fisch gekrümmt ist, lassen nur die Segmente mit dieser flachen Ausrichtung das polarisierte Licht durch und weisen eine Doppelbrechung auf. In solchen Fällen ist die Doppelbrechung in den flachen Bereichen zu messen und die Doppelbrechung der entsprechenden Fläche bei den Wildtyp-Fischen (z. B. Somiten 1-10 sowohl bei Wildtyp- als auch bei mutierten Fischen) zu erfassen.
  11. Beobachten Sie den doppelbrechenden Phänotyp des Fisches.
    1. Wildtyp-Fische mit hochorganisierter Skelettmuskulatur zeigen eine helle Doppelbrechung, da der Brechungsindex für das Licht parallel zu den Myofilamenten höher ist als das polarisierte Licht senkrecht zu diesen Strukturen.
    2. Fische mit einer desorganisierten Skelettmuskulatur, die auf eine nicht-degenerative Myopathie oder einen Entwicklungsdefekt hindeuten, zeigen typischerweise eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung.
    3. Fische mit unorganisierter Skelettmuskulatur, die für eine Muskeldystrophie charakteristisch sind, weisen häufig ein fleckenartiges Muster der Doppelbrechung auf, wobei dunkle Bereiche eine Muskeldegeneration zwischen hellen Bereichen normaler Muskelarchitektur darstellen.
  12. Quantifizieren Sie die Doppelbrechung, indem Sie Bilder von Wildtyp- und mutierten Fischen unter polarisiertem Licht bei gleichen Belichtungseinstellungen und Vergrößerungen aufnehmen. Speichern Sie Bilder als .tiff Dateien.
    1. Öffnen Sie Doppelbrechungsbilder in der ImageJ-Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Wählen Sie für jedes Bild den Bereich des Zebrafischmuskels aus, indem Sie mit der Option "Polygonauswahl" in der Symbolleiste eine Linie um den Körper ziehen.
    3. Verwenden Sie "Messungen festlegen" im Dropdown-Menü "Analysieren", um die erforderlichen Statistiken für das Bild auszuwählen.
      1. Die Mindestauswahl erfordert, dass die Kontrollkästchen für "Bereich", "Mittlerer Grauwert" und "Minimaler und maximaler Grauwert" aktiviert sind.
      2. Ein maximaler Grauwert von >255 gibt die Pixelsättigung an. Verwenden Sie daher Bilder mit maximalen Grauwerten von weniger als 255.
    4. Normalisieren Sie die mittlere Intensität mit dem ausgewählten Bereich und wiederholen Sie das gleiche Quantifizierungsverfahren für jedes Doppelbrechungsbild.

2. Assay für berührungsevoziertes Fluchtverhalten

  1. Bilden Sie Paarungen der entsprechenden Zebrafischlinie(n) und entnehmen Sie Embryonen, wie oben in den Schritten 1.1-1.5 beschrieben.
  2. 2-7 Tage nach der Befruchtung legen Sie dechorionierte Embryonen/Larven einzeln in eine tiefe Petrischale oder in die Kammern von Multiwell-Platten.
  3. Wenn Sie jeweils nur mit einem Embryo arbeiten, zentrieren Sie den Embryo im Sichtfeld eines Nikon SMZ1500-Stereomikroskops mit einem SPOT RT3 Digitalkamerasystem oder ähnlichem und beginnen Sie mit der sequentiellen Bildgebung.
    1. Die gleiche Häufigkeit der Bildgebung sollte sowohl für Wildtyp- als auch für mutierte Fische verwendet werden. Es werden Bildraten >30 Hz empfohlen, da langsamere Raten in der Regel nicht ausreichen, um das schnelle Schwimmen von Wildtyp-Fischen einzufangen.
  4. Geben Sie mechanosensorische Reize an den Embryo ab, indem Sie den Schwanz mit einer Insektennadel berühren.
  5. Beenden Sie die Bildgebung, wenn der Embryo aufgehört hat zu schwimmen oder aus dem Sichtfeld geschwommen ist.
  6. Konvertieren Sie sequenzielle Bilder in eine Videodatei oder analysieren Sie einzelne Frames von Zeitrafferbildern offline mit der Software SPOT 5.1 Advanced. Ähnliche Softwarepakete umfassen Open Lab, NIS Elements oder das frei verfügbare ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. Quantifizieren Sie das Schwimmverhalten, indem Sie die berührungsprovozierte Reaktion in mehreren Embryonen durchführen.
    1. Dies kann erreicht werden, indem die Entfernung, die Embryonen innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls schwimmen können, mit Hilfe einer Software oder eines metrischen Lineals gemittelt wird, um den Start- und Endpunkt des Schwimmtrainings zu markieren.
    2. Vermeiden Sie, dass sich Embryonen im Laufe der Zeit an den Berührungsreiz gewöhnen, indem Sie den Assay bei jeder experimentellen Wiederholung mit einem neuen Embryo durchführen. Das Verhalten in Wildtyp- und zuverlässigen Mutantenmodellen ist in der Regel hochgradig reproduzierbar.

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Ergebnisse

Doppelbrechung kann als effiziente, nichtinvasive Methode verwendet werden, um Aufschluss über den Zustand der Myofibrillenorganisation in lebenden Zebrafischembryonen zu erhalten. Es werden Beispiele für Wildtyp-Zebrafische sowie für Zebrafische mit verringertem Ausmaß der Expression von Genen, die für die Entwicklung und Funktion der Skelettmuskulatur entscheidend sind, präsentiert. Wildtyp-Zebrafische im Alter von 5 Tagen postfertilisation (dpf) weisen unter polarisiertem Licht stark doppelbrechende Skelettmuskeln auf...

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Diskussion

Primäre neuromuskuläre Erkrankungen werden traditionell als dystrophische oder nicht-dystrophische Prozesse klassifiziert. Muskeldystrophien sind gekennzeichnet durch eine Myofaserdegeneration, gefolgt von wiederholten Regenerationsrunden, die schließlich zu einem Prozess im Endstadium führt, der durch Fibrose und Ersatz durch Fettgewebe gekennzeichnet ist14. Nichtdystrophische Myopathien sind im Gegensatz dazu nicht mit Nekrosen oder regenerativen Veränderungen verbunden, führen jedoch zu unorganisierten Myof...

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Wir danken Behzad Moghadaszadeh für seine wunderbare Hilfe bei der Quantifizierung von Doppelbrechungsbildern. Diese Arbeit wurde von der Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) und dem National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345) sowie mit großzügiger Unterstützung von A Foundation Building Strength, Cure CMD und der AUism Charitable Foundation finanziert. VAG wird von K01 AR062601 des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases unterstützt, und LLS wird von F31 NS081928 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tricain SigmaA5040
PetrischalenFischer Scientific0875711Z
PinzetteFischer Scientific100189-588
InsektenstiftFischer ScientificS67375
Polarisierte LinsenRitz CameraQuantaray Tristar Optics C-PL 72mm
InkubatorFischer ScientificIsotemp Inkubator Modell 630D
MikroskopNikon Instruments Inc.SMZ 1500
Kamera-Diagnoseinstrumente Inc.SPOT RT3
BildgebungssoftwareDiagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 Fortgeschritten

Referenzen

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ZebrafischlarvenDoppelbrechungs Assayber hrungsinduzierte FluchtreaktionAnalyse der MuskelstrukturPolarisationsmikroskopieQuantifizierung der Muskelintegrit tMessung der FluchtreaktionIn vivo MonitoringHigh Throughput Screening

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