Eine einfache Vorrichtung zur Stimulierende Evoking Punkt-wie taktile Reize: Ein Suchscheinwerfer für LFP Transitions Spike

Zusammenfassung

Um den komplexen Übergang von lokalen Feldpotentiale (LFP) aufzuklären, um eine geeignete Stimulator für leichte mechanische Reize peripheren Spikes gebaut. Als Anwendung wurden die Spick-Aktivitäten von somatosensorischen Kortex durch eine Mehrzieloptimierungsstrategie analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die vorgeschlagene Stimulator konnte taktile Reize mit Millisekunden und Millimeter Genauigkeiten liefern.

Zusammenfassung

Aktuelle neurophysiologischen Forschung hat das Ziel, Methoden zu entwickeln, um das Signal Route von Neuron zu Neuron, und zwar in den Übergängen von Spikes Lokale Feldpotentiale (LFP) und LFPs zu Spikes zu untersuchen.

LFPs haben eine komplexe Abhängigkeit von Spike-Aktivität und ihre Beziehung ist immer noch schlecht verstanden ^ein. Die Aufklärung dieser Signal Beziehungen wäre hilfreich, sowohl für die klinische Diagnostik (zB Stimulation Paradigmen für Deep Brain Stimulation) und für ein tieferes Verständnis der neuronalen Kodierung Strategien in normalen und pathologischen Bedingungen (zB Epilepsie, Parkinson-Krankheit, chronische Schmerzen). Zu diesem Zweck muss man technische Probleme zu Stimulationsgeräte, die Stimulation Paradigmen und Computeranalysen zu lösen. Daher wurde eine maßgeschneiderte Stimulationsgerät, um auf Reize in Raum und Zeit gut geregelt, die nicht in mechanische Resonanz entstehen nicht liefern entwickelt. Anschließendals ein Beispiel wurde eine Reihe von zuverlässigen LFP-Spike-Beziehungen extrahiert.

Die Leistung der Vorrichtung wurde durch extrazelluläre Aufzeichnungen untersucht, gemeinsam Spikes und LFP-Antworten auf die angelegten Stimuli aus der Ratte primären somatosensorischen Kortex. Dann wird mittels einer Mehrziel-Optimierungsstrategie, ein Vorhersagemodell für Spike Auftretens aufgrund LFP abgeschätzt.

Die Anwendung dieses Paradigma zeigt, dass das Gerät ausreichend geeignet, um Hochfrequenz taktile Stimulation liefern, übertraf gemeinsamen piezoelektrischen Aktoren. Als Beweis für die Wirksamkeit des Geräts wurden folgende Ergebnisse präsentiert: 1) der Zeitpunkt und die Zuverlässigkeit der LFP Antworten gut passen die Spike-Antworten, 2) LFPs sind empfindlich auf die Stimulation Geschichte und erfassen nicht nur die durchschnittliche Antwort sondern auch die trial-to-trial Schwankungen in der Spike-Aktivität und schließlich 3) mit Hilfe der LFP signalisieren, es ist möglich, eine Reihe o schätzenf Vorhersagemodelle, die verschiedene Aspekte der Spike-Aktivität zu erfassen.

Einleitung

Im Rahmen der Signalverarbeitung wird die Impulsantwort stellt eine grundlegende Charakterisierung des Verhaltens eines dynamischen Systems.

Obwohl die ideale Impulsreiz praktisch nicht erreichbar ist, ist es möglich, eine vernünftige Annäherung davon durch Verwendung eines Betätigungselementes, das Hochfrequenzverschiebungen erzeugt, erhalten. Diese Art von Licht taktil-Vibrationsstimulation ist bekannt, dass sowohl die tiefe Haut (zB schnelle Reaktion, schnelle Anpassung Pacini-Körperchen) ² und oberflächlichen Rezeptoren (zB niedrigschwellige langsam an Merkel scheibenförmige Strukturen) ² Ziel.

Reizstromgeräten, insbesondere piezoelektrische Aktuatoren, mit einer Reihe von Nachteilen, nicht zuletzt Resonanzen und kleine Verschiebungen berechnet. Um diese Mängel zu überwinden, ist eine alternative Implementierung des impulsartige Stimulation mit Hilfe eines stumpfen Spitze (ein Kaktus geglättet Spitze in unserem Fall) vertikal vorgeschlagenauf der Membran Zentrum einer Mid-Range-Lautsprecherkonus montiert. Dies bietet den Vorteil einer größeren Verschiebungen und breiteren Frequenzspektrum.

Eine wirksame Anwendung einer solchen Vorrichtung war die Untersuchung der relevanten neuro Problem der LFP Abhängigkeits Spikes. Wegen der subtilen zeitlichen Zusammenhang zwischen diesen elektrischen Ereignissen ein fein reguliert Gerät wurde für die Bereitstellung von peripheren Reize nötig. Die Reize hatte, so schnell und räumlich selektive wie möglich zu sein, um das "Grundrauschen" zu reduzieren und schärfen die Signale von Interesse. Zu diesem Zweck wurden die Stimulationsvorrichtung und die Reizübermittlungsprotokolls gemeinsam für die Aufgabe optimiert. In diesem Beitrag beschreiben wir die Technik und präsentieren einige repräsentative Ergebnisse.

Ein Stimulationsprotokoll basierend auf randomisierten gepaarten Impulse hat, um die Gewöhnung vermeiden ausgelegt und optimiert. Dieses Protokoll bietet den Vorteil der klassischen Paared Impulse und reduziert die Möglichkeit der Fehlschluss zwischen Reizen und spontane periodische Ausbrüche von neuronaler Aktivität.

Durch die Nutzung dieser randomisierten Doppelpuls war es möglich, schnell und zuverlässig LFP und Spike-Antworten zu erhalten und die Besonderheit dieser Antworten auf die Abhängigkeit der beiden LFPs und Spitzen auf die Stimulation der Geschichte verwandt zu erfassen. In der Tat aus den rohen LFP Reaktionen einen Satz von drei LFP Merkmale (LFP selbst, der LFP ersten Ableitung und der Phase der ersten Ableitung) stark korreliert mit dem mittleren Dorn Reaktion wurde extrahiert.

Wurden einige Methoden vorgeschlagen, um Modelle, die Spitzen von LFPs ^3,4 vorhersagen passen. Im Allgemeinen ist ein kritischer Punkt der Modellanpassungsprozesses, auch gemeinsam zur Vorhersage von Spike-Ereignis aus dem Stimulus-Signal wird durch die geeignete Wahl der Zielfunktion zu maximieren / minimieren besteht. Während eine Reihe von Zielfunktionen wurde vorschlagend (zB Korrelation und Kohärenz) ⁵ keine von diesen gemeinsam erfasst die ganze Komplexität der Spike-Antworten. Dementsprechend wird ein neuer Ansatz auf Basis von Mehrzieloptimierung eingeführt. Wir zeigen, dass durch die vorgeschlagenen erarbeitet und diese Rechen Rahmen ist es möglich, eine Reihe von Vorhersagemodellen basierend auf starken LFP Beziehungen Spike schätzen.

Protokoll

Ethische Erklärung

Zu untersuchen, wie Sinnesreize durch neuronale Aktivität dargestellt gibt es keine Alternative zur Verwendung von Tieren und die Verwendung eines in vivo-Ansatz. Alle Tiere wurden entlang der italienischen und europäischen Gesetze über die Behandlung von Tieren in der wissenschaftlichen Forschung (italienisch bioethische Ausschusses, Rechtsverordnung über die Behandlung von Tieren in der Forschung, 27. Januar 1992, Nr. 116) behandelt. Das National Research Council, in dem die Experimente durchgeführt wurden, hält sich an den Internationalen Ausschuss für Versuchstierkunde (ICLAS) im Auftrag der Vereinten Nationen für Erziehung, Wissenschaft und Kultur Organisationen (UNESCO), dem Rat für Internationale Organisationen der medizinischen Wissenschaften (CIOMS ) und der International Union of Biological Sciences (IUBS). Als solche wurde kein Protokoll-spezifische Genehmigung erforderlich. Die Genehmigung des Ministeriums für Gesundheit wird als "Biella 1, 3/2011" in die Dateien des Ethik-Ausschusses der eingestuftUniversität von Mailand.

1. Vorbereitung der Versuchstiere

1. Wählen männlichen Ratten etwa 300 bis 400 g in der Größe.
2. Anesthetize die Ratten für die Versuchsvorbereitung.
   1. Inject intraperitoneal eine Barbiturat-Lösung (Pentobarbital, 50 mg / kg für Induktion, 10 mg / kg für die Wartung).
   2. Überprüfen Sie die Anästhesie Ebene durch niedrige Schwelle und hohe Schwelle mechanische Reize über eine Pfote sicherzustellen, dass kein Rückzugsreflex auftritt.
   3. Bereiten Sie die Hirnhaut durch das Rasieren des Schädeldaches und genau dann einen Einschnitt, um die Schädeloberfläche freizulegen.
   4. Kanülieren die Luftröhre durch eine Trachealkanüle (Innendurchmesser von 2 mm und einem Außendurchmesser von 2,5 mm) Befestigung durch chirurgische Ligation der Umgebung der Luftröhre sich.
   5. Seitlich an den Luftröhrensegment setzen die Halsschlagader und kanülieren es Einführen einer Kanüle (PE10) mit einer Spritze Befestigung durch chirurgische Ligatur um das Schiff verbunden.
3. Montieren Sie die Ratte auf einen stereotaktischen Apparat.
   1. Sichern Ratte Körper und in eine Rückenlage.
   2. Befestigen Sie den Kopf nach Gehör Bars und blockieren die Schnauze. Legen Sie ein oder zwei Tropfen Lokalanästhetikum (Lidocain) in Ohr der Ratte, bevor Ohr Bars.
4. Regulieren Sie die Temperatur der stereotaktischen Pad durch eine elektronisch gesteuerte Heizkissen, wobei die Temperatur bei 37,5 ° C
5. Verbinden Sie den Trachealtubus die Atemnarkosegerät.
   1. Stellen Sie die Atemnarkosegerät bei 1 Hub / s liefern Isofluran (2,5% von 0,4 bis 0,8 l / min) und O ₂ (0,15 bis 0,2 l / min).
6. Reinigen Sie sorgfältig die Schädelhöhle durch einen PVP-Jod Antiseptikum.
7. Werfen Sie einen sterilen Skalpell und schneiden in Längsrichtung auf der Mittellinie von der Basis der Schnauze auf den Winkel des Hinterhauptbein.
   1. Divaricate die Wundgrenzen, die von einem Retraktor und befestigen Sie sie durch zwei kleine Cocker Zange angewendet to die Wundgrenzen.
   2. Identifizieren Sie die Knochenhaut mit dem Hinweis ein Licht über einen Schädeldach Beobachtung der transluzenten Oberfläche. Rubbeln Sie sorgfältig die Knochengewölbe Entfernen der Knochenhaut und das Aussetzen der Knochenoberfläche.
   3. Geben Blutstillung mit einem Wattestäbchen oder chirurgische Schwamm über die Knochenoberfläche, wenn fokale Blutungen über den Knochen erscheinen.
8. Mit einer feinen Spitze Feder, identifizieren die stereotaktische Punkt Bregma an dem Kreuzungspunkt der mediosagittal und koronalen suturas.
   1. Operationsmikroskop unter Kontrolle, identifizieren die stereoBereich (S1HL), die über der somatosensorischen Kortex kontralateral zu der hinteren Pfote für das Experiment (Bregma, AP -0,5 bis 1,2 mm, LL -2.3 bis 2,5 mm) verwendet.
9. Mit einer feinen Spitze Feder zu zeichnen den Platz Umfang das Loch gebohrt werden begrenzt.
   1. Bohren Sie ein Loch 9 mm ² auf der zuvor identifizierten blaue Quadrat Entfernen der Knochen Fliese.
   2. Reinigen und zu absorbieren potenzielle Knochenblutungen.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die Dura mater und decken den kortikalen Oberfläche mit einem chirurgischen Schwamm in künstlichen bei 37,5 ° C gehalten Rückenmarksflüssigkeit getränkt
10. Befestigen Sie die Elektrodenmatrix auf einen Halter mit einem elektronischen Mikromanipulator verbunden.
    1. Verbinden Sie den Kopf der Matrix mit dem Vorverstärker durch einen Mikro-Steckverbinder.
    2. Fahren Sie manuell die Elektrodenmatrix (unter Operationsmikroskop Kontrolle) bis zur kortikalen Oberfläche (ohne es zu berühren).
    3. Schalten Sie den Verstärker mit akustischen Signal.
    4. Fahren Sie durch die elektronische Steuerung wird die Elektrodenmatrix, um den kortikalen Oberfläche berühren, bis der Kontakt erreicht, durch eine klare Geräuschklangwechsel signalisiert.
    5. Ziehen Sie die Elektrodenmatrix durch elektronisch gesteuerte Schritte (2 um / Schritt), bis eine Tiefe von 350 bis 400 um erreicht wird (Rindenschicht IV).
    6. Überprüfen Sie die Reaktionsfähigkeit der Neuronen durch leichte Berührungen auf der kontralateralen Hinterpfote.
    7. Stellen Sie die Tiefe von ein paar weiteren Schritten, bis eine klare Antwort Spicken beobachtet.
    8. Lähmen die Ratte durch intravenöse Gallamin thriethiodide (20 mg / kg / h). Verwenden gebrochenen Dosen während des Experiments zu Curarisierung Ebenen (0,2 ml / 1 h) zu halten.

2. Signal-Behandlung

1. Stellen Sie die Software-Bandpassfilter auf [0,1 6000] Hz.
   1. Notieren Sie sich die neuronalen Signale der 8 Kanäle Mikroelektrodenmatrix bei 32 kHz abgetastet.
2. Nach Abschluss der Aufnahme, exportieren Sie die aufgezeichneten Signale in ein binäres Format, das sich für die Nachbearbeitung.
   1. Führen Sie die Spitze Sortierverfahren mit Hilfe der Toolbox Wave_clus ^11.

3. Herstellung und Konfiguration der Stimulationsvorrichtung

1. Montieren Sie einen Kaktus Stiel (mit abgestumpften Spitze) orthogonal zur Oberfläche eines Mid-Range-Lautsprecher Kleben der Stiel Basis an der Kappe.
2. Programm einMikrocontroller Spannungsimpulse an eine Treiberschaltung für den Lautsprecher zu liefern.
   1. Programmieren Sie den Mikrocontroller zu zwei gepaart Stromimpulse jeden zweiten liefern (siehe Abbildung 1C).
3. Montieren Sie den Lautsprecher und das Mikrocontroller mittels einer L293D H-Brücke mit grundlegenden passiven Komponenten (siehe Abbildung 1A).
4. Schließen Sie den Microcontroller mit einem 12 V Akku.

4. Stimulationsprotokoll

1. Kleben Sie den dorsalen Aspekt der Hinterpfote an einen festen Rahmen, Aussetzen der volaren Fläche und die Vermeidung von Gelenk Verdrehungen.
2. Setzen Sie die Spitze des Stimulationsgerätes auf die gewünschte Gliedmaßen / Pfote Position.
3. Schalten Sie das Stimulationsgerät.

Offline-Schritte:

5. Bewertung von Spike Antworten

1. Für jedes aufgezeichnete Neuron, berechnen die Shannon Mutual Information (MI) des Stimulus evozierten Spikeaktivität (Stimulus ca.tegorie ist entweder 1, Reiz, oder 0, kein Reiz).
   1. Schätzung der bedingten Antwortwahrscheinlichkeit p (r | s), wobei s den Stimulus Kategorie und r für die Anzahl von Spitzen in einem festen Zeitfenster emittiert.
   2. Korrigieren Sie die MI Schätzung mit Hilfe der Verfahren beschrieben schlurfenden ^9.

6. Bewertung der LFP Antworten

1. Filtern Sie die aufgezeichneten Signal im Frequenzbereich [0,1 100] Hz, um den LFP-Signal zu erhalten
2. Rechen LFPSNR, ein Maß für die Reaktions LFP, wie im Bezugszeichen ¹⁰ erläutert.

7. Modellschätzung

1. Generieren Sie ein Modell der Form
   
   wo die x Argumente repräsentieren drei verschiedene Funktionen LFP (x ₁ der LFP selbst < em> x ₂ sein Derivat und X ₃ die Hilbert-Phasen von dessen Derivat) und F wie folgt ausgedrückt:
   
   die g-Koeffizienten Gewichte der Linearkombination und f ist ein Operator, der entweder den absoluten Wert, der Leistung oder den ursprünglichen Wert jedes x _i nimmt.
2. Verwenden Sie die NSGAII Algorithmus, um die Modellparameter und die Betreiber mit den folgenden drei Objekte schätzen: i) ein lokales, Prozess-zu-Versuchsbasis Maß fit , Wobei N und N _{sp r} stellen jeweils die Gesamtzahl Spikes und die Länge der Antwortvektor, ii) ein globales Maß der Anpassung basierend auf der durchschnittlichen Antwortad/50941/50941eq4.jpg "width =" 205 "/> wobei N _bzw. die Länge der durchschnittlichen Antwort, iii) ein Maß für die Komplexität des Modells (siehe auch) ¹⁰ .

8. Die histologische Bestätigung

1. Opfer der Ratte.
   1. Am Ende der experimentellen Aufnahmen, legte das Tier in tiefer Narkose gasförmigen (Isofluran 2%, 4 L / min) und injizieren intravenös ein Barbiturat-Überdosis (> 50 mg / kg Pentobarbital).
   2. Warten Sie den Herzstillstand.
   3. Hängen Sie die Ratte von der stereotaktischen Apparat
2. Perfusion.
   1. Legen Sie die Ratte Verlegung über ein Gitter auf ein Becken, das Blut und Flüssigkeiten aus der Perfusion zu sammeln.
   2. Öffnen Sie den Brustkorb durch das Brustbein Sezieren der Trennung von den Rippeninsertionen.
   3. Blockieren Sie die Brustbeinschwertfortsatz mit einem Cocker Pinzette und Umkippen cranially das Brustbein und die Rippen divaricate über dem Herzen.
   4. Identifizieren Sie die linke Herzkammer und den rechten Vorhof, legen Sie ein neun Messer stumpf Spitze Nadel (nach Perfusionskanüle angeschlossen) in die Herzkammer, und öffnen Sie mit chirurgischen feinen Schere in den rechten Vorhof.
   5. Starten Sie die Perfusion mit kaltem (4 ° C) heparinisierte physiologische Lösung (250 ml), gefolgt von der Perfusion einer 4% igen Formalin-Lösung (250 ml).
3. Extrahieren Sie das Gehirn aus dem Schädel durch das Öffnen der Schädeldecke mit einer geeigneten Pinzette und legen das Gehirn in einer 10% igen Formalin-Lösung.
4. Nach einer Woche, bereiten die histologischen Schnitte mit einem Mikrotom (10 um Dicke).
5. Stain die Gehirn koronalen und sagittalen Schnitte mit Kresylviolett Lösung.

Ergebnisse

Tipp Ausflug Funktionen

Um die dynamischen Eigenschaften der vorgeschlagenen Stimulationsgerät zu charakterisieren, wurden eine Reihe von Experimenten aufgebaut. Eine spezielle Vorrichtung, die aus einer Gallium-Arsenid-Infrarot-emittierende Diode mit einer Siliziumphototransistor besteht wurde verwendet, um die Spitzenverschiebung, die Verschiebung Dauer und die möglichen Verschiebung Verzögerungen zu beurteilen. Mittels dieser optischen Unterbrecherschalter legten wir die Stimulationsspitze a...

Diskussion

Diese Arbeit zunächst präsentierte eine neue, einfache und kostengünstige Gerät ermöglicht, schnell und räumlich punktartige Sinnesreize zu liefern. Dann eine randomisierte Doppelpulsstimulationsprotokoll und einen Satz von Computeranalysen wurden validiert. Das übergeordnete Ziel war es, einen Rahmen für die Schätzung der LFP-Spike-Beziehungen in elektrophysiologischen Ableitungen während taktile Stimulation zu etablieren.

Das Gerät, das Protokoll und die analytischen Ansatz haben gemeinsam...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Microstepper	AB Transvertex (Stockholm, Schweden)		Der Mikrostepper, der zum Abziehen der Elektrodenmatrix verwendet wird
32-Kanal Cheetah System	Neuralynx (MT, USA)		Das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem
L293D h-Brücke	RS Components (Cinisello Balsamo, Italien)		Die Brücke, die verwendet wird, um den Mikrocontroller mit dem Lautsprecher zu verbinden
H21A3 Optischer Unterbrecher Schalter	Fairchild Semiconductor Corporation (San Jose, Kalifornien)		Der Fototransistor, der zur Stabilisierung der Spitzenverschiebung verwendet wird
Arduino Uno	Arduino (Duemilanove, Italien)		Der Mikrocontroller, der verwendet wird, um den Stromimpuls an den Lautsprecher zu liefern
Mikroelektrodenmatrizen GB1	FHC
Isofluran	Rhodia Organique Fine Ltd.		Das Anästhetikum zur Vorbereitung von Tieren
Stereotaktischer Apparat	Narishighe (Tokio, Japan)
Männliche Sprague-Dawley-Ratten	Charles River (Calco, LC, Italien)
Gallaminethriethiodid	Sigma-Aldrich		Die Verbindung, die zur Kurarisierung der Tiere verwendet wird
Cresylviolett	Sigma-Aldrich
Topische Antiseptika (Betadin 10%)	Meda Pharma (Mailand, Italien)
Heparin	Sigma-Aldrich
Formaldehyd	Carlo Erba Reagenzien (Pomigliano Milanese, Mailand, Italien)