Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

Summary

Dieses Papier beschreibt die Bildung von hochgeordnete Strukturen auf Peptid-Basis durch die spontane Prozeß der Selbstorganisation. Das Verfahren nutzt Handel befindlichen Peptiden und gemeinsame Laborgeräte. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Peptiden angewendet werden und kann auf die Entdeckung von neuen Peptid-basierten Anordnungen führen.

Abstract

In der Natur werden die komplexen funktionellen Strukturen durch Selbstorganisation von Biomolekülen unter milden Bedingungen gebildet. Das Verständnis der Kräfte, die Selbstorganisation zu steuern und imitiert diesen Vorgang in vitro wird über große Fortschritte in den Bereichen Materialwissenschaft und Nanotechnologie zu bringen. Unter den verfügbaren biologischen Bausteine ​​sind Peptide mehrere Vorteile, da sie erhebliche Vielfalt zu präsentieren, deren Synthese im großen Maßstab ist einfach, und sie können leicht mit biologischen und chemischen Einheiten ^1,2 geändert werden. Mehrere Klassen entworfen Peptide wie zyklische Peptide, amphiphile Peptide und Peptid-Konjugate Selbstorganisation zu geordneten Strukturen in Lösung. Homoaromatische Dipeptide, sind eine Klasse von kurzen selbstorganisierten Peptide, die alle erforderlichen Informationen, um molekulare geordnete Strukturen wie Nanoröhren, Kugeln und Fibrillen bilden ^3-8 enthalten. Eine Vielzahl dieser Peptide ist im Handel erhältlich. 9. Die hier vorgestellten Protokolle können andere Klassen von Peptiden oder biologische Bausteine ​​und möglicherweise angepasst werden kann zur Entdeckung neuer Peptidstrukturen und eine bessere Kontrolle ihrer Montage.

Introduction

Naturformen bestellt und Funktionsstrukturen durch das Verfahren der biomolekularen Selbstmontage. Das Verständnis der Kräfte, die diese spontane Prozess regieren kann auf die Fähigkeit zur Selbstorganisation in vitro zu großen Fortschritten im Bereich der Materialwissenschaften ^10,11 imitieren und damit zu führen. Peptide, insbesondere ein großes Versprechen als biomolekulare Baustein, da sie große Strukturvielfalt, einfache chemische Synthese zu präsentieren, und kann leicht mit biologischen und chemischen Einheiten funktionalisiert werden. Das Gebiet der Peptidselbstorganisation durch Ghadiris und seiner Kollegen, die die Selbstorganisation von Peptid-Nanoröhren durch cyclische Peptide mit alternierenden D-und L-Aminosäuren ¹² gezeigt, voran. Andere erfolgreiche Ansätze für den Entwurf von Peptidanordnungen umfassen lineare Peptide Bolaamphiphil ^5, Amphiphile (AP) ^6, nichtkonjugierten selbstkomplementären ionischen Peptide ^13, Tensid-ähnliche Peptide ^{4,14 und Diblock Copolypeptide 15.}

Ein neuerer Ansatz ist die Selbstorganisation von kurzen Peptiden aromatischen, bezeichnet als homoaromatische Dipeptide. Diese Peptide umfassen nur zwei Aminosäuren mit aromatischer Natur (z. B. Phe-Phe-, tert-Butyldicarbonat (Boc)-Phe-Phe) ^7,8,16-21. Die von diesen Peptiden gebildet homoaromatische Strukturen sind röhrenförmige Strukturen, Kugeln, blattartige Baugruppen und Fasern ^{6,8,15,21-32.} Die Fasern in einigen Fällen erzeugen eine Fibrillen-Netz, das ein Hydrogel ^33-37 ergibt. Diese Baugruppen sind für Anwendungen von Biosensoren, Drug Delivery, molekulare Elektronik, etc. genutzt. ^38-45

Dieses Papier beschreibt die experimentellen Schritte, um die spontane Selbstorganisation von homoaromatischen Peptide starten benötigt. Darüber hinaus stellt sie den Prozess der Peptid Coassemblierung. Dieser Prozess beinhaltet die Selbstanordnung von mehr als einem Typ von PeptidMonomer.

Unsere Demonstration umfasst die Coassemblierung zweier kommerziell erhältlicher Peptide: Peptid die Diphenylalanin (NH _{2-Phe-Phe-COOH)} und Boc geschützte Analogon (Boc-Phe-Phe-OH). Jedes der Peptide selbst montiert in eine super Struktur: Die Diphenylalanin Peptid Formen Rohrbaugruppen und die Boc-Phe-Phe-OH Peptidselbstorganisation in entweder Kugeln oder Fasern je nach Lösungsmittel ^7,17,46. Wir mischten die beiden Peptide in bestimmten Verhältnissen und dadurch die Folge Anordnungen durch Elektronenmikroskopie, Kraftmikroskopie und FT-IR-Spektroskopie. Die Verfahren zeigten die Bildung einer Peptid-Struktur, die auf der Basis von kugelförmigen Elementen mit einem Durchmesser von mehreren Mikrometern (1-4 um), die durch längliche Anordnungen mit einem Durchmesser von einigen hundert Nanometern verbunden sind (~ 300-800 nm) besteht . Die Anordnungen ähneln Perlen Strings in ihrer Morphologie, wie die sphärischen Strukturen scheinen auf die Gewinde werdenlängliche Baugruppen. Deshalb bezeichnet diese Baugruppen "biomolekularen Halsketten". Die "biomolekularen Halsketten" könnte als neues Biomaterial zu dienen, als Drug-Delivery-Agent oder als Gerüst für elektronische Anwendungen. Darüber hinaus kann das Verfahren, das zum Selbstorganisation von Peptiden führt mit anderen Klassen von Peptiden und Biomolekülen verwendet werden. Es kann zu einem besseren Verständnis der bei der Selbstorganisation und die Bildung von neuen geordneten Strukturen auftretenden Kräfte führen.

Protocol

1. Die Selbstorganisation von homoaromatischen Dipeptide

1. Wiegen Sie das gewünschte Peptid in seiner gefriergetrockneter Form (z. B. NH _{2-Phe-Phe-OH,} Boc-Phe-Phe-COOH) und bereiten eine Stammlösung durch Lösen des Peptids in 1,1,1,3,3,3-Hexafluor -2-propanol (HFP) mit der entsprechenden Konzentration (beispielsweise 100 mg / ml für die NH _2-Phe-Phe-OH und Boc-Phe-Phe-COOH) ^7,17,46.
2. Mischen Sie die Lösung mit Wirbel und Platz auf der Bank, bis das Peptid vollständig gelöst und die Lösung scheint klar (ein paar Minuten).
3. Verdünnt das Peptidstammlösung mit einem geeigneten Lösungsmittel, auf die geeignete Konzentration (beispielsweise 2 mg / ml NH _2-Phe-Phe-OH in Wasser dreifach destilliert (TDW) zur Bildung von Nanoröhrchen, indem 2 ul der Peptid Stammlösung zu 98 &mgr; l TDW, 5 mg / ml Boc-Phe-Phe-COOH in Ethanol zur Bildung von sphärischen Strukturen).
4. Die Lösung wird bei RT für 24hr.
5. Um jede preaggregation vermeiden, sind die frischen Lösungen für jedes Experiment.

2. Cozusammenlagerung von zwei homoaromatische Dipeptide

1. Eine Lösung aus 50% Ethanol durch Mischen gleicher Volumina von absolutem Ethanol und TDW. Verwenden Wirbel um die beiden Lösungen mischen.
2. Wiegt 2 mg des NH _{2-Phe-Phe-OH-Peptid} und 1 mg des Boc-Phe-Phe-OH-Peptids. Lösen jedes Peptid in HFP zu einer Konzentration von 100 mg / ml.
3. Mischen Sie die Peptide Stammlösungen mit Wirbel und legen Sie sie auf der Bank, bis die Peptide vollständig gelöst und die Lösungen scheinen klar.
4. Mischen Sie die Peptide Stammlösungen in das gewünschte Verhältnis. In diesem speziellen Experiment Mischung 10 ul der NH _2-Phe-Phe-OH Peptid mit 6 ul des Boc-Phe-Phe-OH-Peptid (bis zu einer endgültigen Verhältnis 5:3 beziehungsweise). Aufgrund der hohen Volatilität der HFP Lösungsmittel, ist es empfehlenswert, eine große Menge von dieser Stammlösung werden (bei least 10 ul).
5. Verwenden Wirbel um die gemischte Peptide Stammlösung mischen.
6. Verdünnen Sie die Blended-Peptide Stammlösung mit 50% Ethanol in die gewünschte endgültige Konzentration. In diesem speziellen Experiment, um eine Endkonzentration von 5 mg / ml für die NH _2-Phe-Phe-OH und 3 mg / ml Boc-Phe-Phe-OH bzw. zu schneiden, 8 &mgr; l der Stammlösung vermischten Peptide 92 &mgr; l der 50% igen Ethanol-Lösung. Mit einer Pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung.
7. Die Lösung wird bei RT für 24 Stunden.
8. Es sei darauf hingewiesen, dass aufgrund der sehr flüchtigen Natur des Lösungsmittels, die Experimente sind empfindlich gegenüber kleinen Änderungen in der Konzentration der Peptide werden. Daher sollten frische Stammlösungen für jedes Experiment vorbereitet werden.

3. Charakterisierung der Selbst montiert Strukturen mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

1. Nach 24 Stunden Inkubation, gelten ein 10 ul Tropfen der Lösung Peptide auf einem Glas Buchtr Schlupf und trocken bei RT.
2. Beschichtung der Probe auf dem Glas mit einer dünnen Schicht aus Gold (wenige Nanometer) unter Verwendung eines Sputter-Beschichtungsvorrichtung für 90 Sekunden.
3. Bild die Baugruppen mit SEM, die bei 10-20 kV.

4. Charakterisierung der Selbst montiert Strukturen mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

1. Legen Sie eine 10 &mgr; l-Tropfen der Lösung Peptide auf einem 200-Mesh-Kupfergitter mit Kohlenstoff bedeckt und durch eine Polymer-Trägerfilm stabilisiert.
2. Nach 1 min die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier.
3. Bereiten Sie eine Lösung von 2% Uranylacetat in TDW. Die Lösung wird mit 0,22 um-Filtereinheit.
4. Um das Beispiel (negative Färbung) Fleck, einen Tropfen von 10 ul Uranylacetatlösung in der Startaufstellung.
5. Nach 30 sec entfernen überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier. Es sei angemerkt, dass, obwohl eine negative Färbung verbessert den Kontrast der Bilder, ist es nicht wesentlich, in allen Fällen.
6. Bild der Probe auf the Gitter durch TEM bei 120 kV.

5. Dreidimensionale Charakterisierung der Versammlungen von Atomic Force Microscopy (AFM)

1. Bereiten Sie eine Probe für die AFM-Analyse unter Verwendung des in Absatz 3.1 beschriebenen Verfahren.
2. Analysieren Sie die Probe auf dem Glas mittels einer AFM-Instrument arbeiten im AC-Modus. Verwenden Siliziumcantilevern mit einer Federkonstante von 3 N / m und einer Resonanzfrequenz von 75 kHz.
3. Starten durch Abtasten einer großen Fläche des Gitters, um die gewünschte Struktur zu finden. Dann konzentrieren sich auf einen bestimmten kleineren Bereich und scannen sie (die Scan-Größe 2,5 x 2,5 um um für das Bild in dieser Handschrift enthalten).

6. Charakterisierung der Sekundärstruktur von FT-IR

1. Tragen Sie eine 30 ul Tropfen der Peptide Lösung zu einem _{CaF2-Fenster.}
2. Die Lösung wird bei Raumtemperatur trocknen.
3. Die Adsorption von Wasser in dem IR-Spektrum ist auf 1.650 cm ^-1.Dieser Peak ist in der Mitte der Amid-I-Bande der Peptidbindung. Es ist auch eine typische Spitzen für α-Helix-Strukturen von Peptiden und Proteinen ^47. Um dieses Problem zu überwinden, und das Signal von Wasser zu vermeiden, muss ein Wasserstoff-zu-Deuterium-Austausch durchgeführt werden. Geben Sie einen Tropfen von Deuteriumoxid (D ₂ O) auf die getrocknete Peptidprobe. Der Tropfen sollte groß genug sein, um das Peptid Beläge auf der komplett abzudecken.
4. Die Probe wird unter Vakuum zu trocknen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 6.3 und 6.4, 2x, um eine maximale Wasserstoff-Deuterium-Austausch zu gewährleisten. Speichern Sie die Probe unter Vakuum bis zu ihrer Analyse.
6. Notieren Sie sich die FT-IR-Spektren mit einem deuterierten Triglycinsulfat (DTGS)-Detektor. Die FT-IR-System beinhaltet einen Reinigungsgasgenerator, um die Luftfeuchtigkeit in der Umgebung der Probe zu verhindern. Bei Proben von kurzen Peptiden, ist es am besten, um die Probe mit einer Auflösung von 4 cm ^-1 scannen 2.000 x. Die Durchlässigkeit Minimalwerte können durch die so bestimmt werden,ftware mit dem Gerät geliefert.

Results

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Bildung geordneter Strukturen in der Nano-und Mikrometerskala durch die Selbstorganisation von Peptiden. Um dieses einfache Verfahren präsentieren wir demonstrieren und zu charakterisieren, die Coassemblierung von zwei einfachen aromatischen Peptide (Abbildung 1). Eines der Peptide, die NH _2-Phe-Phe-OH (Diphenylalanin)-Peptid, das durch Selbstorganisation kann in einer wässrigen Lösung in das hohle röhrenförmige Strukturen mit Abmessungen im Nanome...

Discussion

Zusammenfassend zeigt dieses Dokument die Leichtigkeit, mit der Peptid-basierten Anordnungen können in vitro gebildet werden. Das Verfahren beinhaltet im Handel befindlichen Peptiden und Lösungsmittel, und es tritt spontan unter Umgebungsbedingungen durch die Zugabe eines polaren Lösungsmittels in das Reagenzglas. Es ist entscheidend, HFP als Lösungsmittel der Peptide zu verwenden, aufgrund der geringen Löslichkeit der Peptide in anderen organischen Lösungsmitteln. Darüber hinaus aufgrund der hohen Volatilität ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NH2-Phe-Phe-OH	Bachem	G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH	Bachem	A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol	Sigma-Aldrich	52512-100ML
Ethanol absolut (dehydriert) AR steril	Bio-Lab Ltd.	52555	Mischen mit TDW zur Herstellung von 50%iger Lösung
Uranylacetat	Sigma-Aldrich	73943	Zur Negativfärbung. Es ist möglich, ohne sie zu arbeiten.
Glasdeckglas	Marienfeld Laboratory Glaswaren	110590
TEM-Gitter	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	FCF200-Cu-50	Formvar/Carbon 200 Mesh, Cu
Quantitatives Filterpapier	Whatman	1001055
Deuteriumoxid (D2O)	Sigma-Aldrich	151882-100G	99,9 Atom % D
CaF2 Fenster	PIKE Technologies	160-1212	25 mm x 2 mm Fenster. Für FT-IR-Messungen
AFM-Spitzen	NanoScience Instruments	CFMR	Aspire Sonden, CFMR-25
Serie Filtereinheiten	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0,22 μ m, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert
REM	FEI		Quanta 200 ESEM
TEM	FEI		Tecnai T12 G2 Spirit
AFM	JPK Instruments		A JPK NanoWizard3
FT-IR	Thermo Fisher Scientific		Nicolet 6700 fortschrittliches Goldspektrometer
FT-IR Spülung	Parker		BALSTON FT-IR Spülgasgenerator Modell 75-52
OMNIC (Nicolet) Software	Thermo Nicolet Corporation		Für die Analyse von FT-IR-Spektren
Vortex-Mischer	Wisd Laborgeräte		ViseMix VM
Gewicht	Mettler Toledo		NewClassic MS
Sputter Coater	Polaron		SC7640 Sputter Coater