Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Zusammenfassung

In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt.

Zusammenfassung

Gewebekultur ist ein wertvolles Werkzeug, um viele Aspekte der Zellfunktion zu untersuchen, von der normalen Entwicklung für Krankheiten. Herkömmliche Zellkulturverfahren beruhen auf der Fähigkeit von Zellen, entweder an einem festen Substrat einer Gewebekulturschale befestigen oder in Suspension in einem flüssigen Medium wachsen. Mehrere wurden unsterbliche Zelllinien erstellt und aufgewachsen mit solchen Ansätzen, aber diese Methoden häufig scheitern, wenn Primärzellen brauchen, um ex vivo kultiviert werden. Ein solches Versagen ist das Fehlen von geeigneten extrazellulären Matrixkomponenten des Gewebemikroumgebung von den Standardsystemen, bei denen Gewebekultur-Plastik ist als Oberfläche für Zellwachstum eingesetzt zurückzuführen. Extrazelluläre Matrix ist ein integraler Bestandteil der Gewebemikroumgebung und die Präsenz von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen, wie Zellpolarisation, das Überleben und die Proliferation ist. Hier präsentieren wir eine 3-dimensionale Gewebekultur-Methode, bei der primären Knochenmark-cells sind in der extrazellulären Matrix formuliert, um die Mikroumgebung des menschlichen Knochen (RBM-System) rekapitulieren gewachsen. Eingebettet in der extrazellulären Matrix werden die Zellen mit Nährstoffen durch das Medium, ergänzt mit Humanplasma zugeführt wird, wodurch ein umfassendes System, bei dem das Überleben der Zelle und die Proliferation kann für bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden, während die zelluläre Zusammensetzung des primären Gewebes. Mit der rBM System haben wir erfolgreich primäre Knochenmarkszellen von normalen Spendern und Patienten mit Amyloidose und verschiedenen hämatologischen Malignomen gewachsen. Die rBM System ermöglicht direkte, in-Matrix Echtzeit-Visualisierung des Zellverhaltens und Bewertung von präklinischen Wirksamkeit neuer Therapeutika. Darüber hinaus können Zellen aus dem rBM isoliert und anschließend zur in vivo-Transplantation, Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Nukleinsäure-und Proteinanalyse. Zusammengenommen stellt die rBM Verfahren ein zuverlässiges System für das Wachstum von primären Knochen marrow Zellen unter physiologischen Bedingungen.

Einleitung

Gewebekultur wurde entwickelt, um das Verhalten der Zelle in einer kontrollierten Umgebung zu studieren, um die Variabilität zu minimieren, wenn systemische Vergleich verschiedener Prozesse in intakten Organismen. Diese Methode wurde erstmals im Jahr 1900 ^1,2 festgelegt und bezieht sich auf eine Technik, bei der Gewebe-Explantate wurden in eine Glasschale kultiviert ex vivo. In der Mitte der 1900er Jahre wurde das System angepasst, um verstreuten Zellen eher als Fragmente intakter Gewebe wachsen, und die Begriffe "Gewebekultur" und "Zellkultur" wurde zum Synonym für ^drei. Bei solchen herkömmlichen Zellkultursystemen Zellen auf der Oberfläche der Gewebekultur-Plastik mit Wachstumsmedium mit verschiedenen Wachstumsfaktoren überlagert gewachsen. Adhärenten Zellkultur, in der Zellen anlagern und ausbreiten auf der Gewebekultur-Kunststoff und nicht-adhärenten Kulturen, wo Zellen in Suspension propagiert: Zwei Arten von Kulturen haben auf der Grundlage der Haftfähigkeit von verschiedenen Zellen entstanden. Seit den frühen Tagen des ZellEs wurden Kultur verschiedenen unsterblichen Zelllinien wie ^HeLa-4, der ersten menschlichen Krebszelllinie. Diese Zelllinien haben die Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in Zellkultur zu vermehren, und die meisten keine spezielle Behandlung erforderlich, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.

Die reduktionistische Ansatz der ursprünglichen Zellkulturverfahren wurde entwickelt, um das System so weit wie möglich, indem die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation aufrecht Minimum Komponenten vereinfachen. , Vereinfachte Zellkultur Ansätze scheitern jedoch ex vivo meisten primären humanen Zelltypen mit begrenzter Lebensdauer unterstützen. Daher neue Kultursysteme werden entwickelt, um die Gewebemikroumgebung so eng wie möglich anzunähern, wodurch Zell Explantate unter physiologischen Bedingungen zu wachsen. Im Gegensatz zu den herkömmlichen / Reduktionist Zellkulturansätze, 3-dimensionale (3-D) werden nun Kultursystemen zu einem bevorzugten Verfahren, um effizient verschiedene Kulturmenschlichen Zelllinien und Primärzellen anschließend untersuchen Mechanismen in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind, im Rahmen einer Mikroumgebung. Solche 3-D-Systeme sind in der Regel mit rekonstruierten Matrizen und / oder Medium mit Wachstumsfaktoren gesetzt, um die Gewebe-Mikroumgebung zu rekapitulieren, um Zelltypen von Interesse studieren. Die erste dieser 3-dimensionalen (3-D) Kulturmodelle entwickelt, um Brustdrüsenentwicklung zu untersuchen. Um die Zellen mit nativen Bedingungen Brustepithelzellen in Matrigel eingebettet, Collagen IV und Laminin-reiche Quelle von extrazellulärer Matrix (ECM) zu schaffen, und bedeckt mit Wachstumsmedium. Unter solchen Bedingungen, bildeten die Mamma-Epithelzellen Cluster ähnlich der Brust Acini und nach Stimulation mit laktogene Hormone, diese Azini sezerniert Kasein, Milchproteine ​​und andere, in den Hohl Lumena der Acini artige Strukturen. Casein-Sekretion wurde nicht in Standard-Kulturen auch nach Zugabe von Prolaktin ⁵ beobachtetWeitere Betonung der Rolle der Mikroumgebung bei der Erhaltung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von Zellen. Eine weitere Demonstration der Verlust der normalen Zellfunktion, wenn die Zellen aus dem Kontext ihrer physiologischen Mikroumgebung genommen ist eine Demonstration, dass ohne Mikroumgebung, Keratinozyten nicht, geschichtete Epidermis ⁶ zu bilden. Eine Anzahl von anderen 3-D-Modelle wurden entwickelt, um die ex vivo Vermehrung von primären Zellen ^7,8 erlauben.

Die entscheidende Rolle der Mikroumgebung der Zellverhalten wurde elegant in einer Studie, in Brustepithelzellen gebildet "inside-out", wenn Acini in Kollagen kultivierten I Matrix, verglichen mit dem vollständig polarisiert Acini, die in Matrigel gebildet wurden demonstriert. Dieser Verlust der korrekten Morphologie wurde rückgängig gemacht, wenn Laminin-produzierenden Myoepithelzellen wurden den Kulturen Kollagen I ⁹ aufgenommen. Darüber hinaus ist die richtige Mikroumgebung für die genaue erforderlichGenotyp Manifestation. In einer Schale gezüchtet, MCF7-Brustkrebszellen mit einem Zell-Zell-Adhäsionsmolekül CEACAM1 transfiziert verhalten sich genau die gleiche wie die nicht-transfizierten CEACAM negativen Zellen. Wenn jedoch in Matrigel kultiviert, in Kontakt mit ECM, Wildtyp MCF7 Form tumorartige Strukturen, während MCF7 Zellen mit CEACAM1 transfiziert wieder zu einem normalen Phänotyp und Form Acini mit Hohl Lumena, wie mit nicht-malignen Brustepithel ¹⁰ eingerichtet. Ebenso Sperr β1-Integrin in Brustkrebszellen nicht deren Verhalten unter Standardkulturbedingungen zu ändern, aber der gleiche Versuch in 3-D-Kulturen durchgeführt zeigt, dass die Blockierung β1-Integrin kehrt malignen Zellen zu einem normalen Phänotyp ^11. Daher wird das Gewebe-Mikroumgebung nicht nur erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten, sondern auch um die richtige Zellfunktion beizubehalten.

Neben der Bereitstellung eines Systems, wo das Zellverhalten unter physiologischen Zustand untersucht werdens, funktionieren 3-D-Kulturen als robustes und zuverlässiges Medium für die präklinische Testung neuer Therapeutika ^8,12,13. Kultivieren von Zellen in 3-D ermöglicht Screening von Verbindungen unter den experimentellen Bedingungen der Umwelt-vermittelte ^{Resistenz-14,} wo der Beitrag der Zell-Zell-und Zell-ECM-Adhäsion beurteilt werden konnte. Darüber hinaus können Off-Target-Toxizität neuer Verbindungen, die durch die mehrfache zellulären Kompartimenten verschiedener Gewebe festgestellt werden. Solche Bildschirme können schneller durchgeführt werden und sind kostengünstiger als vergleichbare Studien in vivo ^8.

Hier präsentieren wir ein Setup von einem 3-D-Modell des rekonstruierten Knochenmark (RBM), wo normalen und malignen Knochenmark (BM)-Zellen vermehren ex vivo in einem System eng imitiert die Mikroumgebung des menschlichen BM. Frühere Versuche zur wachsenden primären humanen Zellen BM in 2-D-Kulturen, flüssigen oder haft Co-Kulturen mit verschiedenen Komponenten des BM StromaOder 3-D, halbfesten Agarkulturen haben mit beschränktem Erfolg aufgrund ihrer Unfähigkeit, die Zellen mit den Komponenten der Gewebemikroumgebung liefern ^15-18 erfüllt. In diesen Systemen hatte BM primären Zellen schlechte Rentabilität und nicht zu vermehren ex vivo. Ein anderes System, wo menschliche BM Vorläuferzellen in Sphäroid-Co-Kulturen mit BM Stromazellen gewachsen ist ein 3-D-System, wo hämatopoetischen Stammzelllebensfähigkeit und Proliferation wurde für mindestens 96 Stunden ¹⁹ getragen. Obwohl sehr nützlich für das Verständnis der hämatopoetischen Vorläufer Biologie, dieses System nicht getreu rekapitulieren die Mikroumgebung des BM aufgrund der Abwesenheit von ECM-Komponenten, also die Begrenzung ihrer Nützlichkeit. Die hier beschriebene rBM Modell präsentiert ein umfassendes System, wo beide zellulären und extrazellulären Kompartimenten des menschlichen BM werden in vitro rekonstruiert. Wir zeigen, dass rBM Kulturen ex vivo Wachstum von normalen menschlichen BM-Zellen unterstützen, wie wirll als Zellen von Patienten mit verschiedenen hämatologischen Störungen isoliert.

Protokoll

1. Advance-Vorbereitung

1. Halten sterilen serologischen Pipetten und Pipettenspitzen bei 4 ° C
   Fehlerbehebung: Matrigel Gele bei Raumtemperatur (RT), mit kaltem Pipetten und Tipps werden Matrigel geliert während der Kultur-Setup verhindern.
2. Tauen Sie eine Flasche Matrigel bei 4 ° C über Nacht.

2. Vorbereitung der Reagenzien

1. Vorbereitung von Fibronektin-Stammlösung: Machen Sie eine 1 mg / ml Stammlösung von Fibronektin durch Auflösen von 100 mg humanem Fibronektin in 100 ml destilliertem Wasser. Sobald die Fibronektin gelöst hat, Sterilfilter, aliquote, und bei 4 ° C bis zu 6 Monaten.
   Fehlerbehebung: Wenn Fibronektin nicht schnell auflösen inkubieren Sie die Lösung für ein paar Minuten in einem Wasserbad Satz bei 37 ° C
2. Herstellung von 10x PBS: Man löst 80 g Natriumchlorid NaCl, 14,4 g Na ₂ HPO _4, 2 g KCl und 2,4 g KH ₂ PO _{4 in 1 l destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4, steril filtriert und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate.}
3. Vorbereitung der Neutralisationspuffer ^20: Machen Sie eine Lösung, die 100 mM HEPES 2x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 1 M HEPES und 10x PBS-Stammlösungen. Einstellen des pH der Lösung auf 7,0. Lagern bei 4 ° C für 2-3 Monate.
4. Herstellung von 2 mg / ml-Lösung von Rattenschwanz-Kollagen Typ I: Einen 2 mg / ml Kollagen-I-Lösung in der Neutralisationspuffer (Schritt 2.3). Mischen Sie die Lösung bei niedriger Geschwindigkeit und vorsichtig durch Pipettieren von oben und unten. Da diese Kollagen sehr zähflüssig ist, zu vermeiden Erzeugung von Luftblasen beim Pipettieren. Es wird empfohlen, Kollagen I-Lösung jedes Mal frisch zubereiten. Die Lösung wird auf Eis bis zum Gebrauch.
5. Vorbereitung der endostalen Beschichtung (Rend): Mischen Sie 1 mg / ml Fibronektin-Lager mit 2 mg / ml Kollagen I Lager (Schritte 2.1 und 2.4) bis zu einer Endkonzentration von 77 pg / ml und 29 pg / ml, in 1x &# 160; sterilem PBS. Mischen und bei 4 ° C bis zu 1 Monat.
6. Vorbereitung der rekonstruierten Knochenmatrix (RBM):
   1. Vorkühlen 1,5 ml Reaktionsgefäße auf Eis. Halten Sie alle Matrix-Lösungen auf Eis zu allen Zeiten.
   2. Mischung 4 Teile Matrigel (Matrigel-Konzentration variiert von Charge zu Charge, aber die Variationen gefunden vernachlässigbar ist), 2,5 Teile 1 mg / ml Fibronektin und 1 Teil von 2 mg / ml Kollagen I auf Eis durch erste Pipettieren in Matrigel der Schlauch mit kaltem Pipettenspitzen und fügen Sie dann Fibronektin und Kollagen I. Matrigel beginnt Erstarren bei Temperaturen über 4 ° C, so schnell arbeiten beim Pipettieren Matrigel. Mischen Sie die Matrix sehr vorsichtig durch Pipettieren von oben und unten, vermeiden die Einführung Blasen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, während das Mischen der rBM.
7. Vorbereitung der Knochenmarkwachstumsmedium (BMGM): Stellen Sie 500 ml BMGM enthält 6,2 x 10 ^-4 M CaCl _2, 10 ^-6 M Natrium-Succinat, 10 ^-6 M Hydrocortison, 20% Humanplasma (normalen oder malignen von gesunden Spendern oder Patienten gesammelt) und 1% Penicillin / Streptomycin in RPMI-1640. CaCl _2, Natrium-Succinat, und Hydroergänzungsmittel können bei -80 ° C für> 6 Monate 1.000 x Stammlösungen aufbewahrt werden. Wenn wachsende Zelllinien können fetales Rinderserum (FBS) für Humanplasma ersetzt werden.
8. Herstellung von 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF): In 37% Formaldehyd-Stammlösung PBS bei 10% v / v 1x Gut mischen und bei Raumtemperatur lagern 2-3 Wochen vor Licht geschützt.
9. Herstellung von 1% Rinderserumalbumin (BSA): Wiegen geeignete Menge BSA und löst ihn in 1x PBS. Lagerung bei 4 ° C und innerhalb von 1 Woche. BSA-Lösung neigt dazu, verunreinigt, wenn für längere Zeit gehalten gekühlt zu werden. Alternativ können BSA-Lösung aliquotiert und bei -20 ° C eingefroren werden für die Langzeitlagerung. Vermeiden Frost-Tau-Zyklen.
10. Herstellung von Zell Recovery-Lösung (CRS): Stellen Sie 5 mM EDTA, 1 mM Natriumvanadat (Na _{3 VO 4) und 1,5 mM Natriumfluorid (NaF)-Lösung in 1x PBS. Sterilfilter und bei 4 ° C bis zu 6 Monaten.}

3. Eingebettete 3D-Kultur von nicht-malignen und malignen humanen BM-Zellen

1. Reinige Primär BM mononuklearen Zellen durch Ficoll-Plaque-Zentrifugation den Anweisungen des Herstellers.
   Optionaler Schritt: Zellen mit 0,25 uM Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) den Anweisungen des Herstellers, die Zellproliferation in der gesamten Kulturperiode folgen beschriftet werden.
   Fehlerbehebung: Wenn Zellen sterben nach CFSE-Färbung titriert die Menge der CFSE die Konzentration hängt vom Zelltyp, 0,25 uM funktioniert gut für Primär BM mononuklearen Zellen.
2. In 65 ul Rend-Lösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Gewebekulturplatte behandelt. Verbreiten Sie die Lösung gleichmäßig auf die gesamte Fläche der gut decken und Inkubation für> 30min bei RT.
3. Vorbereitung der Zellsuspension in einer Dichte von 0,5 × 10 ⁶ Zellen in 10 ul 1x PBS pro Vertiefung einer 48-Well-Platte. In einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mischen die Zellsuspension mit 100 ul rBM Matrix pro Vertiefung. Mischen Sie die Zellen und rBM Matrix durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren; vermeiden Einführung Blasen. Halten die Zell / Matrix-Mischung auf Eis, um ein Gelieren der Matrix zu vermeiden.
   Hinweis: Die rBM System ist vollständig skalierbar, um das System in einem nicht-48-Well-Format einzurichten, passen Sie die Mengen aller Reagenzien (Matrizen und Medium) auf der Grundlage der Fläche der Platte verwendet. Skalieren der Anzahl von Zellen entsprechend beschichtet werden.
4. Saugen Sie den verbleibenden zerreißen und fügen Sie die Zell / Matrix-Mischung in der Mitte der Brunnen. Schnell verbreitete die Zell / Matrix-Gemisch, um die gesamte Oberfläche der Wanne gleichmäßig bedecken. Die Platte wird für 30-60 min bei 37 ° C, 5% CO _{2-Gewebekultur-Inkubator,} damit die Matrix zu verfestigen. Schütteln oder dissiertem die Platte während der Inkubation.
   Fehlerbehebung: Um ungleichmäßige Verteilung der Zellen in rBM verhindern, gut mischen vor dem Beschichten. Mischen, nachdem jeder ^5. Vertiefung ausplattiert, um Zellen sich am Boden des Rohrs zu vermeiden. Sobald zogen, keine Zellen, die nicht auf den Boden des Bohrlochs durch Zug an der Matrixoberfläche sinken.
   Fehlerbehebung: Um ungleichmäßige Verteilung der Zellen in rBM verhindern, gut mischen vor dem Beschichten. Mischen, nachdem jeder ^5. Vertiefung ausplattiert, um Zellen sich am Boden des Rohrs zu vermeiden. Sobald zogen, keine Zellen, die nicht auf den Boden des Bohrlochs durch Zug an der Matrixoberfläche sinken.
5. Vorwärmen BMGM in einem Wasserbad auf 37 ° C eingestellt
6. Nach 30 Minuten, um zu sehen, dass die Matrix richtig eingestellt, es wird wie ein weiches Gel-Schicht, die sich nicht bewegt, wenn die Platte gekippt bilden. Überlagern der Zell / Matrix-Schicht mit 1 ml warmem BMGM. Reißen der Matrix Pipette das Medium sehr leicht zu vermeiden (Abgabe Tropfen für Tropfen) unter Verwendungeine serologische Pipette. Legen Sie die zusammengebauten rBM Kultur in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Gewebekultur-Inkubator und Kultur für den gewünschten Zeitraum.
   Hinweis: die Lebensfähigkeit der Zellen wird für mindestens 30 Tage gehalten, ohne Medium; wenn Mediumwechsel ist erforderlich, jedes Mal ändern, nur 50% des Mediums.
   Critical Schritt: Es ist entscheidend, dass das Medium nicht kalt wie Kälte könnte den bereits festgelegt Matrix stören. Achten Sie darauf, um das Medium auf der Matrix zu spritzen, es könnte die weiche Matrix-Schicht brechen.
   Fehlerbehebung: Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen in der rBM System niedrig ist, kann die Zelldichte müssen experimentell bei der Arbeit mit anderen als primäre mononuklearen Zellen aus BM saugt Zellen bestimmt werden. Bei der Arbeit mit Zelllinien, verringern Sie die Anzahl der Zellen 10-fach, als immortalisierte Zelllinien vermehren sich schneller als Primärzellen.

4. 'In-Matrix "Imaging

1. Lichtmikroskopie
   1. Bild die kultivierten Zellen direkt in rBM mit Hellfeld, Differential-Interferenzkontrast (DIC), konfokale oder andere bildgebende Verfahren, Fern Bildgebung zu ermöglichen, wie die Matrix ist etwa 1 mm dick. Verwenden Sie die Z-Stapel-Funktion auf vielen der Mikroskope zur Verfügung, um Bild die gesamte Kultur von oben nach unten.
2. Immunfluoreszenzfärbung
   Tipp: Für die Immunfärbung Protokoll unten vermeiden Absaugen Färbung / Waschlösungen, statt die Platte zu kippen und Lösungen zu entfernen mit einer Pipette.
   1. Entfernen Sie die BMGM mit Hilfe einer Pipette und waschen 2-3x mit 100 ul / Wäsche / Vertiefung RT 1x PBS. Stellen Sie sicher, dass genügend PBS wird verwendet, um die gesamte Oberfläche des gut abzudecken.
   2. Zellen in der Matrix zu fixieren, indem 100 ul / Vertiefung (für eine 48-Well-Platte) von 10% NBF für 15 min bei RT. NBF entfernen und waschen die Zellen zweimal mit 100 ul / Wäsche / Vertiefung RT 1x PBS.
      Anmerkung: Vermeiden Sie kalte NBF, da es die Matrix zu verflüssigen.
   3. PBS entfernen, fügen Sie 1% BSA für 1 h bei RT oder bei 4 ° C über Nacht, um unspezifische Bindung von Antikörpern zu blockieren.
   4. Vorbereitung Primärantikörperlösung in 1% BSA in der erforderlichen Verdünnung. Die Verdünnung wird für jeden Antikörper ändern, bitte mit dem Hersteller oder titriert, um die optimale Antikörperkonzentration zu bestimmen. Füge 100 &mgr; l / Vertiefung von primärem Antikörper-Lösung und Inkubation nach den Anweisungen des Herstellers.
      Kritischer Schritt: Alle Inkubationen mit Antikörpern gegen Fluorophore oder Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert im Dunkeln durchgeführt werden.
   5. Entfernen primären Antikörperlösung und waschen 3x mit 1x PBS für 5 min.
   6. Für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung, Inkubation mit einem sekundären Antikörper, um fluoreszierende Sonde für 1 Stunde bei Raumtemperatur konjugiert. Verdünnte Antikörper in 1% BSA in einer Konzentration vom Hersteller vorgeschlagen.
   7. Entfernen Sie die Sekundär einntibody Lösung und waschen 3x mit 1x PBS für 5 min.
      Fehlerbehebung: Um zu vermeiden, hohen Hintergrund während der Bildgebung, titriert die fluoreszenz konjugierten Sekundärantikörper und die niedrigste Konzentration, die eine angemessene Signal liefert. Wenn hohe Hintergrund ist immer noch ein Problem ist, erhöhen Sie die Anzahl und die Dauer der Waschschritte, oder nutzen Sie direkt konjugiert primären Antikörper und überspringen Sie Schritt 4.2.6.
   8. Um die Kerne färben hinzufügen 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) Kernfärbung Lösung, bei der Verdünnung durch den Hersteller empfohlen, und Inkubation für 7-10 min bei RT.
   9. Entfernen Kernfärbung Lösung und waschen 2x mit 1x PBS für 5 min.
   10. Entfernen Sie die PBS aus dem letzten Wasch und fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium (regulärer Satz), auf die Probe, um die Fluoreszenz zu bewahren. Bild mit entsprechender Anregung / Emission Einstellungen auf einem Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop.
       Hinweis: Imaging sollte innerhalb von 2 Tagen nach der Färbung durchgeführt werden, um den Abbau der Matrix und der Verlust von rBM Integrität und Verlust der Fluoreszenzsignals zu vermeiden. Wenn es nicht sofort abgebildet werden, sollte gefärbten Proben bei 4 ° C aufbewahrt werden, vor Licht geschützt, bis Bildgebung.

5. Isolierung von Zellen aus rBM

1. Medium vorsichtig entfernen, ohne die Matrix-Schicht zu stören. Saugen Sie nicht.
2. Waschen Sie die Zellen 2x mit sterilem 1x PBS. Saugen Sie nicht.
3. 0,5 ml eiskaltem CRS in jede Vertiefung und entfernen Sie die gesamte Matrix-Schicht zusammen mit den Zellen, durch kräftiges Auf-und Abpipettieren. Sammeln Sie die Zellen, Matrix und CRS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zeigen auf Eis.
4. Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml CRS auf den gleichen gut und sammeln Sie alle verbleibenden Materials. Transfer zum selben Reaktionsgefäß.
5. Vortex die Mischung von Zellen, Matrix und CRS und Inkubation auf Eis für 1 Stunde. Vortex-Zellen alle 15 Minuten, um die Freisetzung aus der Matrix zu erleichtern.
6. Überprüfen Sie die Mischung nach 1 Stunde, ohne sichtbare Klumpender Matrix vorhanden sein.
   Fehlerbehebung: Wenn Klumpen von Matrix noch nach 1 Stunde sichtbar, Transfer Zellen / Matrix / CRS Mischung zu einem größeren Rohr, fügen zusätzliche 2-5 ml CRS, und Inkubation für weitere 30 bis 60 min.
7. Zentrifuge Zellen in CRS bei 1.000 UpM für 5-10 Minuten bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml kaltem PBS 1x.
8. Zentrifugieren bei 1.000 rpm für 5-10 min und Überstand. Wiederholen Sie den PBS-Wasch noch einmal.
9. Der zweite PBS-Wasch vervollständigt die Wiederherstellung von Zellen von Matrix und isolierte Zellen können für beliebige nachfolgende Anwendungen wie DNA / RNA / Protein-Isolierung verwendet werden, Durchflusszytometrie, in vivo Transplantation usw..

Ergebnisse

Da primäre Knochenmarkszellen nicht, unter Standard-Zellkulturbedingungen vermehren, wurde die rBM System geschaffen, um genau imitieren die Knochen-Mikroumgebung, die Bereitstellung eines Systems zur Kultur und zu erweitern BM Zellen ex vivo. Die Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix BM, Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und ²¹ wurden in rBM Matrix eingebaut, um die strukturelle Gerüst des 3-D-Kultur bereitzustellen. Endosteum, die Schnittstelle zwischen dem Knochen und dem BM, rei...

Diskussion

Die rBM Modell bietet ein umfassendes System, in dem zellulären Zusammensetzung des BM wird ex vivo für bis zu 30 Tage gehalten. BM-Zellen in rBM Selbst Schichtung nach ihrer Funktion eng imitiert die BM-Architektur in vivo gefunden gewachsen. Außerdem ist das erste System, das für die Expansion des multiplen Myeloms Klon ⁸ ermöglicht. Die wichtigsten Schritte für die Gewährleistung der robuste Wachstum der BM-Zellen und den Gesamterfolg der Kultur sind: 1), um eine gesunde Population der BM...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CellTrace CFSE-Proliferationskit für die Durchflusszytometrie	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronektin aus menschlichem Plasma	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel-Basalmembranmatrix	BD Biosciences	354234
Rattenschwanzkollagen Typ I	BD Biosciences	354249	Collagen I von Millipore polimerisiert mit diesem Protokoll nicht richtig
VECTASHIELD Eindeckmedium für Fluoreszenz (reguläres Set)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX Tabletten	Sigma-Aldrich	F4648	Für TRAP-Färbung
SigmaFast BCIP/NBT Tabletten	Sigma-Aldrich	B5655	Für alkalische Phosphatase-Färbung
Zeiss konfokales Mikroskop LSM 510	Carl Zeiss
Zeiss 510 Software	Carl Zeiss		Bildanalysesoftware für die konfokale Analyse
Zeiss Axiovert 200M Inversmikroskop	Carl Zeiss
MetaMorph Software	Molekulare Bauelemente		Bildanalysesoftware für Axiovert 200M
FACSort Durchflusszytometer	BD Biosciences
CellQuest Pro Software	BD Biosciences		Software für die Analyse von Durchflusszytometrie-Daten