Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Kultursystem aufzubauen, das die zelluläre und intrazelluläre Mikroumgebung des menschlichen Knochenmarks genau rekapituliert. Zunächst wird die Oberfläche einer Gewebekulturvertiefung mit der industriellen Matrix beschichtet. Dann werden mononukleäre Zellen des Knochenmarks oder andere Zellen von Interesse mit der Knochenmarkmatrix vermischt.

Später wird die industrielle Matrix entfernt und das Zellmatrixgemisch in die Vertiefung gegeben. Sobald die Matrize geliert ist, wird sie mit Wachstumsmedium überzogen. Letztlich können Zellen direkt in der Matrix sichtbar gemacht oder für nachgelagerte Analysen isoliert werden, verglichen mit bestehenden Methoden zur Kultivierung von Zellen.

Zum Beispiel Standard-Gewebekulturmethoden oder die Co-Kultur-Modelle, bei denen Zellen auf Kunststoff gezüchtet werden. Der Hauptvorteil einer 3D-Kulturmethode besteht darin, dass die Zellen in der physiologischen Mikroumgebung gezüchtet werden und somit Zellen unter den nativen Bedingungen des Gewebes untersucht werden können. Bereiten Sie eine 48-Well-Platte vor, in der die Zellen plattiert werden.

Indem Sie zuerst 65 Mikroliter industrielle Beschichtungslösung in jede Vertiefung geben, verteilen Sie die Lösung gleichmäßig, um die gesamte Oberfläche der Vertiefung zu bedecken. Diese Methode ist auch auf andere Oberflächen skalierbar. Lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Zellsuspension von 50.000 Zellen pro Mikroliter PBS vor. Bereiten Sie genug vor, um 10 Mikroliter in jede Vertiefung zu geben, dann mischen Sie die Zellsuspension in einem Einor-Röhrchen mit 100 Mikrolitern rekonstruierter Knochenmatrix pro Well. Gut vorsichtig mischen und Blasenbildung vermeiden.

Bewahren Sie die Mischung auf Eis auf, damit die Matrix nicht geliert, wenn die Platte fertig ist. Inkubieren, die gesamte Flüssigkeit entfernen und die Beschichtungslösung durch Aspiration dotieren. Dann fügen Sie jeweils 100 Mikroliter gut gemischte Zellsuspension mit Matrix hinzu.

Kippen Sie die Platte schnell mit einer Pipette, um die gesamte Oberfläche der Vertiefung gleichmäßig abzudecken. Mischen Sie die Suspension zwischen den Well-Füllungen weiter, da die Zellen nach vollständiger Beladung verklumpen. Inkubieren Sie die Platte 30 bis 60 Minuten lang ohne Rühren, bis sich die Matrix verfestigt.

Anschließend erwärmen Sie das Knochenmarkwachstumsmedium in einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Wasserbad. Überprüfen Sie nach 30 Minuten Inkubation, ob die Matrix richtig ausgehärtet ist. Eine gute Matrix bildet eine weiche, gelartige Schicht, die sich nicht bewegt, wenn die Platte gekippt wird.

Wenn die Matrize fertig ist, beschichten Sie sie vorsichtig mit einer serologischen Pipette tropfenweise mit einem Milliliter Medium. Anschließend wird die zusammengesetzte rekonstruierte Knochenmatrixkultur für bis zu 30 Tage ohne Mediumwechsel in den Inkubator zurückgebracht. Wenn ein Mediumwechsel erforderlich ist, wechseln Sie nur die Hälfte des Mediums auf einmal.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig, ohne die Matrizenschicht zu stören. Kippen Sie die Platte und lassen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette abtropfen. Aspirieren Sie das Medium später nicht über die Matrix.

Beim Färben der Zellen. Verwenden Sie diese Technik für Lösungsänderungen. Für die Entnahme von Medien aus den Vertiefungen einer 3D-Kultur ist es sehr wichtig, dass sie von der Seite der Vertiefung entfernt werden.

Andernfalls wird die Matrix gestört und die Zellen können verloren gehen, wenn sie an der gleichen Technik festhalten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem XPBS. Fügen Sie dann jeweils einen halben Milliliter eiskalte Zellrückgewinnungslösung hinzu.

Nun, entfernen Sie die gesamte Matrixschicht zusammen mit den Zellen, indem Sie kräftig auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Sammlung jeweils gut in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis. Geben Sie dann einen weiteren halben Milliliter Rückgewinnungslösung in dieselbe Vertiefung und sammeln Sie das restliche Material.

Wirbeln Sie alle Sammlungen vor und brüten Sie sie eine Stunde lang auf Eis aus. Wirbeln Sie die Röhren während der Stunde alle 15 Minuten durch, um die Zellfreisetzung aus der Matrix zu erleichtern. Überprüfen Sie die Mischung nach einer Stunde auf sichtbare Matrixklumpen.

Es sollten keine vorhanden sein, aber wenn dies der Fall ist, geben Sie die Mischung in ein größeres Röhrchen und fügen Sie weitere zwei bis fünf Milliliter Zellwiederherstellungslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann für weitere 30 bis 60 Minuten. Regelmäßiges Vortexen und erneutes Prüfen auf das Fehlen von Matrixklumpen.

Wenn die Matrix nicht mehr verklumpt ist. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1000 U/min für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter kaltem XPBS.

Wiederholen Sie die Zentrifugation. Ersetzen Sie den Überstand durch frisches PBS und wiederholen Sie den Waschvorgang. Ein drittes Mal.

Nach der dritten PBS-Wäsche werden die Zellen in der entsprechenden Lösung für den nächsten Eingriff zurückgewonnen. Knochenmarkzellen wurden 30 Tage lang in rekonstruierter Knochenmatrix gezüchtet und periodisch durch Lichtmikroskopie bei 200-facher Vergrößerung abgebildet. Stromale Elemente wurden erstmals am fünften Tag nachgewiesen, waren aber am 14. Tag deutlich zu erkennen.

Im Laufe der Kulturperiode wanderten die Zellen durch die Matrix und aggregierten sich zu unterschiedlichen Clustern. Massen bösartiger Zellen dehnten sich im Laufe der Zeit aus, um die Zusammensetzung der stromalen Komponenten zu bewerten, die in RBM herauswachsen. Die Morphologie der Zellen am Übergang zwischen RBM und industrieller Beschichtung wurde untersucht.

Die Zellen wurden auf Fibronektin, Aktin und Zellkerne gefärbt. Es wurde gezeigt, dass es sich bei Visualisierungszellen mit stromaler Morphologie um Präsosteoblasten mit hoher alkalischer Phosphataseaktivität handelt. Sie waren in der Lage, Kalzium zu mineralisieren, wie durch die Färbung von Zarinrot bestimmt wurde: Zellen mit sichtbarem Vorhandensein von Lipidtröpfchen wurden als Adipozyten identifiziert, basierend auf positiver Färbung mit Öl.

Erythrozyten mit gelegentlichen multiplen Kernen wurden als Präs-Osteoklasten erkannt und waren positiv für tartratresistente saure Phosphatase. Nach der Isolierung von Zellen aus einer 3D-Kultur können Sie eine Vielzahl von Dingen tun. Sie können zum Beispiel die zellulären Phänotypen verschiedener Zellen untersuchen, die in der Mikroumgebung gezüchtet werden.

Sie können die Gen- und Proteinexpression untersuchen und sogar bestimmen, welche Art von Molekülen von diesen Zellen unter 3D-Bedingungen sezerniert werden.