In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gewebekultur ist ein wertvolles Werkzeug, um viele Aspekte der Zellfunktion zu untersuchen, von der normalen Entwicklung für Krankheiten. Herkömmliche Zellkulturverfahren beruhen auf der Fähigkeit von Zellen, entweder an einem festen Substrat einer Gewebekulturschale befestigen oder in Suspension in einem flüssigen Medium wachsen. Mehrere wurden unsterbliche Zelllinien erstellt und aufgewachsen mit solchen Ansätzen, aber diese Methoden häufig scheitern, wenn Primärzellen brauchen, um ex vivo kultiviert werden. Ein solches Versagen ist das Fehlen von geeigneten extrazellulären Matrixkomponenten des Gewebemikroumgebung von den Standardsystemen, bei denen Gewebekultur-Plastik ist als Oberfläche für Zellwachstum eingesetzt zurückzuführen. Extrazelluläre Matrix ist ein integraler Bestandteil der Gewebemikroumgebung und die Präsenz von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen, wie Zellpolarisation, das Überleben und die Proliferation ist. Hier präsentieren wir eine 3-dimensionale Gewebekultur-Methode, bei der primären Knochenmark-cells sind in der extrazellulären Matrix formuliert, um die Mikroumgebung des menschlichen Knochen (RBM-System) rekapitulieren gewachsen. Eingebettet in der extrazellulären Matrix werden die Zellen mit Nährstoffen durch das Medium, ergänzt mit Humanplasma zugeführt wird, wodurch ein umfassendes System, bei dem das Überleben der Zelle und die Proliferation kann für bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden, während die zelluläre Zusammensetzung des primären Gewebes. Mit der rBM System haben wir erfolgreich primäre Knochenmarkszellen von normalen Spendern und Patienten mit Amyloidose und verschiedenen hämatologischen Malignomen gewachsen. Die rBM System ermöglicht direkte, in-Matrix Echtzeit-Visualisierung des Zellverhaltens und Bewertung von präklinischen Wirksamkeit neuer Therapeutika. Darüber hinaus können Zellen aus dem rBM isoliert und anschließend zur in vivo-Transplantation, Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Nukleinsäure-und Proteinanalyse. Zusammengenommen stellt die rBM Verfahren ein zuverlässiges System für das Wachstum von primären Knochen marrow Zellen unter physiologischen Bedingungen.
Einleitung
Gewebekultur wurde entwickelt, um das Verhalten der Zelle in einer kontrollierten Umgebung zu studieren, um die Variabilität zu minimieren, wenn systemische Vergleich verschiedener Prozesse in intakten Organismen. Diese Methode wurde erstmals im Jahr 1900 1,2 festgelegt und bezieht sich auf eine Technik, bei der Gewebe-Explantate wurden in eine Glasschale kultiviert ex vivo. In der Mitte der 1900er Jahre wurde das System angepasst, um verstreuten Zellen eher als Fragmente intakter Gewebe wachsen, und die Begriffe "Gewebekultur" und "Zellkultur" wurde zum Synonym für drei. Bei solchen herkömmlichen Zellkultursystemen Zellen auf der Oberf....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Advance-Vorbereitung
- Halten sterilen serologischen Pipetten und Pipettenspitzen bei 4 ° C
Fehlerbehebung: Matrigel Gele bei Raumtemperatur (RT), mit kaltem Pipetten und Tipps werden Matrigel geliert während der Kultur-Setup verhindern. - Tauen Sie eine Flasche Matrigel bei 4 ° C über Nacht.
2. Vorbereitung der Reagenzien
- Vorbereitung von Fibronektin-Stammlösung: Machen Sie eine 1 mg / ml Stammlösung von Fibronektin durch Auflösen von 100 mg humanem Fibronektin in 100 ml destilliertem Wasser. Sobald die Fibronektin gelöst hat, Sterilfilter, aliquote, und bei 4 ° C bis zu 6 Mona....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Da primäre Knochenmarkszellen nicht, unter Standard-Zellkulturbedingungen vermehren, wurde die rBM System geschaffen, um genau imitieren die Knochen-Mikroumgebung, die Bereitstellung eines Systems zur Kultur und zu erweitern BM Zellen ex vivo. Die Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix BM, Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und 21 wurden in rBM Matrix eingebaut, um die strukturelle Gerüst des 3-D-Kultur bereitzustellen. Endosteum, die Schnittstelle zwischen dem Knochen und dem BM, rei.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die rBM Modell bietet ein umfassendes System, in dem zellulären Zusammensetzung des BM wird ex vivo für bis zu 30 Tage gehalten. BM-Zellen in rBM Selbst Schichtung nach ihrer Funktion eng imitiert die BM-Architektur in vivo gefunden gewachsen. Außerdem ist das erste System, das für die Expansion des multiplen Myeloms Klon 8 ermöglicht. Die wichtigsten Schritte für die Gewährleistung der robuste Wachstum der BM-Zellen und den Gesamterfolg der Kultur sind: 1), um eine gesunde Population der BM.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award der American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53), an die Purdue University Center for Cancer finanziert Forschung, und die kanadischen Institutes of Health Research und dem Alberta Cancer Research Initiatives Vorstand Programm. MP wurde von der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Internship Program unterstützt (R25CA128770; PI: D. Teegarden) durch die Onkologische Sciences Center und dem Discovery-Learning Research Center an der Purdue University, verab....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CellTrace CFSE-Proliferationskit für die Durchflusszytometrie | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronektin aus menschlichem Plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel-Basalmembranmatrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rattenschwanzkollagen Typ I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I von Millipore polimerisiert mit diesem Protokoll nicht richtig |
| VECTASHIELD Eindeckmedium für Fluoreszenz (reguläres Set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX Tabletten | Sigma-Aldrich | F4648 | Für TRAP-Färbung |
| SigmaFast BCIP/NBT Tabletten | Sigma-Aldrich | B5655 | Für alkalische Phosphatase-Färbung |
| Zeiss konfokales Mikroskop LSM 510 | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 Software | Carl Zeiss | Bildanalysesoftware für die konfokale Analyse | |
| Zeiss Axiovert 200M Inversmikroskop | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph Software | Molekulare Bauelemente | Bildanalysesoftware für Axiovert 200M | |
| FACSort Durchflusszytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro Software | BD Biosciences | Software für die Analyse von Durchflusszytometrie-Daten |
Referenzen
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
