Methodenartikel

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

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DOI:

10.3791/50950

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20. Dezember 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Cellulosomen sind Multienzymkomplexe, die für die Verdauung von Zellulose entwickelt wurden. AFM-basiertes SMFS wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften und die Faltungskonfiguration von Cellulosom-assoziierten Proteinanordnungen zu untersuchen. Wir präsentieren einen vollständigen Workflow für die Immobilisierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Proteinen, um die Wechselwirkungen einzelner Rezeptor-Liganden-Komplexe zu untersuchen, die an der Assemblierung von Cellulosomen beteiligt sind.

Zusammenfassung

Cellulosomen sind diskrete Multienzymkomplexe, die von einer Untergruppe anaerober Bakterien und Pilze zur Verdauung lignozellulosehaltiger Substrate verwendet werden. Die Assemblierung der Enzyme an das nichtkatalytische Gerüstprotein wird durch Wechselwirkungen zwischen einer Familie verwandter Rezeptor-Liganden-Paare gesteuert, die interagierende Cohesin- und Dockerin-Module umfassen. Die extrem starke Bindung zwischen Kohäsin- und Dockerin-Modulen führt zu Dissoziationskonstanten im niedrigen pikomolaren bis nanomolaren Bereich, was genaue Off-Rate-Messungen mit herkömmlichen Bulk-Methoden erschweren kann. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) mit dem Rasterkraftmikroskop misst die Reaktion einzelner Biomoleküle auf Kraft und ist im Gegensatz zu anderen Einzelmolekül-Manipulationsmethoden (z. B. optische Pinzette) optimal für die Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit hoher Affinität, da sie den hohen Kraftbereich (>120 pN) untersuchen kann. Hier stellen wir unser vollständiges Protokoll zur Untersuchung zellulosomaler Proteinanordnungen auf Einzelmolekülebene vor. Unter Verwendung einer Proteintopologie, die vom nativen Cellulosom abgeleitet ist, arbeiteten wir mit Enzym-Dockerin- und Kohlenhydrat-Bindungsmodul-Cohesin (CBM-Cohesin)-Fusionsproteinen, die jeweils eine zugängliche freie Thiolgruppe an einem manipulierten Cysteinrest aufwiesen. Wir stellen unser ortsspezifisches Oberflächenimmobilisierungsprotokoll vor, zusammen mit unserem Mess- und Datenanalyseverfahren zur Ermittlung detaillierter Bindungsparameter für den hochaffinen Komplex. Wir zeigen, wie man die Entfaltungskräfte einzelner Subdomänen, komplexe Bruchkräfte, kinetische Off-Raten und potenzielle Breiten der Bindungsvertiefung quantifizieren kann. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methoden bei der Charakterisierung der Cohesin-Dockerin-Wechselwirkung, die für die Assemblierung von zellulolytischen Komplexen mit mehreren Domänen verantwortlich ist, wird weiter beschrieben.

Einleitung

Cellulosomen sind große Multienzymkomplexe, die auf der Oberfläche von anaeroben zellulolytischen Bakterien (z.B. C. thermocellum) dargestellt werden und sich entwickelt haben, um pflanzliche Zellwandlignocellulose effizient in lösliche Oligosaccharide zu depolymerisieren1. Ein zentrales Merkmal von Cellulosomen ist die hochaffine Kohäsin-Dockerin-Wechselwirkung. Im prominentesten Paradigma ist ein hochkonserviertes 60-75 Aminosäuren Typ I Dockerin-Modul am C-terminalen Ende der verschiedenen bakteriellen Enzyme dargestellt. Das Dockerin-Modul steuert die Assemblierung synergistischer Kombinationen von Enzymen auf das nichtkatalytische Gerüstprotein ("Scaffoldin"), das ein Polyprotein von Cohesin-Domänen umfasst, die spezifisch für das Typ-I-Dockerin-Modul sind. Auf höheren Ebenen kann die Zellulosomenarchitektur sehr komplex werden, da sie alternative Kohäsin- und Dockerinpaare (z. B. Typ II, Typ III) enthält, die die Strukturen an der Zelloberfläche verankern und den Zusammenbau von verzweigten Strukturen mit mehreren Gerüsten ermöglichen2. Die verschiedenen Cohesin-Dockerin-Typen weisen trotz verwandter Strukturen unterschiedliche Bindungsspezifitäten auf, die die Kreuzreaktivität mit unbeabsichtigten Gerüsten oder Komponenten anderer Cellulosom-produzierender Bakterienarten unterdrücken. Während bioinformatische Ansätze erfolgreich Tausende von einzigartigen zellulosomalen Komponenten auf genetischer Ebene identifiziert haben, sind vergleichsweise wenige Proteinstrukturen bekannt, und die Mechanismen, die bei der Bestimmung der Cohesin-Dockerin-Spezifität am Werk sind, bleiben ein aktives Gebiet der strukturbiologischen Forschung.

Seit der Erfindung des Rasterkraftmikroskops (AFM) durch Binnig et al.3 wurden verschiedene AFM-Betriebsmodi entwickelt und kontinuierlich verbessert, darunter die berührungslose Bildgebung, die Oszillationsmodus-Bildgebung4 und die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS)5,6. SMFS hat sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, um einzelne Proteine7-11, Nukleinsäuren12-15 und synthetische Polymere16-19 direkt zu untersuchen. In einem typischen SMFS-Experiment zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Bindung20,21 wird eine AFM-Cantileverspitze mit einem der Bindungspartner modifiziert, während eine flache Glasoberfläche mit dem komplementären Bindungspartner modifiziert wird. Der modifizierte Ausleger wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass sich die Partner binden können. Anschließend wird die Basis des Auslegers mit konstanter Geschwindigkeit zurückgezogen und die Kraft mit dem optischen Hebelauslenkungsverfahren gemessen. Die resultierenden Kraft-Weg-Datenspuren weisen sägezahnartige Spitzen auf, wenn eine Bindung hergestellt wurde. In Fällen, in denen die Bindungspartner mit mehreren Proteindomänen fusioniert sind, kann jeder Peak in der Kraft-Weg-Kurve mit der Entfaltung einer einzelnen Proteindomäne oder gefalteten Subdomäne korreliert werden, während der letzte Peak einem Bruch der Proteinbindungsgrenzfläche entspricht. Die spezifischen Positionen der kraftresistenten Elemente können als Fingerabdruck verwendet werden, um die verschiedenen Proteindomänen zu identifizieren, die von Interesse sind. Mit dieser Methode können wichtige Aminosäuren abgefragt werden, die an der Proteinfaltung und -stabilisierung beteiligt sind. In der Literatur wurden viele Modelle beschrieben, um das charakteristische Kraftausdehnungsverhalten zu behandeln, das in SMFS-Experimenten beobachtet wurde. Zu den am häufigsten verwendeten Modellen gehören die freigelenkige Kette (FJC) Modell22, die schneckenartige Kette (WLC) Modell18,23-25 und die frei rotierende Kette (FRC) Modell25,26.

In unserer vorherigen Arbeit11 haben wir Einzelmolekül-Kraftspektroskopie verwendet, um die Wechselwirkung von Cohesin- und Dockerin-Modulen zu untersuchen. In dieser Arbeit stellen wir ein experimentelles Protokoll für die Funktionalisierung von Glasoberflächen und Cantilevern mit Enzym-Dockerin- und CBM-Cohesin-Proteinkonstrukten vor. Außerdem stellen wir ein AFM-basiertes SMFS-Protokoll vor, das Datenerfassungs- und Analyseverfahren umfasst. Das beschriebene Protokoll kann leicht auf andere molekulare Systeme verallgemeinert werden und sollte sich als besonders nützlich für Forscher erweisen, die an hochaffinen Rezeptorligandenpaaren interessiert sind.

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Protokoll

Ein Schema der in dieser Arbeit verwendeten Zuggeometrie zur Untersuchung der Kohäsion-Dockering-Interaktion ist in Abbildung 1A dargestellt. Das hier beschriebene Proteinimmobilisierungsprotokoll für die Funktionalisierung von Cantilever und Deckglas ist eine modifizierte Version des zuvor veröffentlichten Verfahrens27. Die Proteine wurden mittels herkömmlicher Methoden aus Plasmidvektoren in E. coli exprimiert. Die Proteine wurden so konstruiert, dass sie eine wasserzugängliche Thiolgruppe aufwiesen, die in Kombination mit Maleimidchemie verwendet wurde, um das Protein über eine stabile Thioetherbindung an die Oberfläche des Deckglases und des Cantilevers zu koppeln. Die eingefügten Cysteinreste in beiden Fusionsproteinen, CBM-Kohäsion und Xylanase-Dockering, befanden sich auf der Seite des N-Terminus, abseits der Bindungsstelle zwischen Kohäsion und Dockering11. Eine detaillierte Übersicht über die bei der Proteinimmobilisierung verwendeten chemischen Bindungen zeigt Abbildung 1B.

1. Probenvorbereitung

  1. Puffer
    1. Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium (TBS) herstellen: 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
    2. Natriumboratpuffer herstellen: 50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      Das Fließdiagramm, das die Schritte der Probenvorbereitung zeigt, ist in Abbildung 2 dargestellt.
      Beim Umgang mit Cantilevern und Deckgläsern werden selbstverriegelnde Pinzetten empfohlen.
  2. Aminosilanisierung von Deckgläsern (ca. 1,5 Std.)
    1. Deckglas (24 mm Durchmesser, 0,5 mm Dicke) in einen PTFE-Halter geben.
    2. Deckglas 15 min im Ultraschallbad in einem Gemisch aus Ethanol und ultrareinem Wasser (1:1, v/v) behandeln.
    3. Deckglas mit ultrareinem Wasser spülen.
    4. Deckglas 30 min in Piranhalösung (1:1 H2SO4 (konzentriert) : H2O2 (30 %) (v/v)) legen, anschließend gründlich mit ultrareinem Wasser spülen. Das Deckglas unter einem sanften N2-Strom trocknen. Vorsicht: Piranhalösung ist äußerst ätzend. Augen- und Hautschutz sind erforderlich.
    5. Deckglas in eine Mischung aus Ethanol, ultrareinem Wasser und 3-Aminopropyl-dimethyl-ethoxysilan (45:5:1, v/v) eintauchen. 60 min auf einem Schüttler bei Raumtemperatur (ca. 50 U/min) belassen.
    6. Deckglas nacheinander in Ethanol und ultrareinem Wasser (je 2×) spülen. Deckglas unter einem sanften N2-Strom trocknen.
    7. Deckglas im Ofen backen (80 °C für 30 min).
    8. Die silanisierten Deckgläser können bis zu 6 Wochen unter Argon gelagert werden.
  3. Aminosilanisierung von Cantilevern (ca. 1,5 Std.)
    HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll zur Tip-Funktionalisierung eignet sich für Silizium-Cantilever-Spitzen.
    1. Cantilever auf einen sauberen Objektträger legen. 15 min mit UV-Ozon behandeln.
    2. Cantilever 3 min in einer Mischung aus Ethanol und 3-Aminopropyl-dimethyl-ethoxysilan (1:1, v/v) mit einer katalytischen Menge (0,25 %, v/v) ultrareinem Wasser eintauchen.
    3. Cantilever nacheinander jeweils 60 Sekunden unter leichtem Rühren in Bechern mit Toluol, Ethanol und ultrareinem Wasser spülen. Zwischendurch die Cantilever vorsichtig auf Filterpapier trocknen.
    4. Die Cantilever auf einen sauberen Objektträger legen und backen (80 °C für 30 min).
  4. Reduktion von Protein-Disulfidbrücken (ca. 3 Std.)
    Alle Lösungen sollten so hergestellt werden, dass pro Cantilever ca. 30 µl verdünntes Protein und pro Deckglas ca. 20 µl verdünntes Protein erhalten werden. Die Proteinpuffer sollten mit dem Disulfid-reduzierenden Gel Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) im Verhältnis 1:2 (v/v) gemischt werden.
    1. TCEP-Disulfid-reduzierende Kügelchen in Mikroröhrchen portionieren. Es wird empfohlen, Mikropipettenspitzen mit einer Schere abzuschneiden, um den Durchmesser der Öffnung beim Pipettieren der TCEP-Kügelchensuspension zu vergrößern.
    2. TCEP-Kügelchensuspension mit 1 ml TBS-Puffer spülen und 3 min bei 850 rcf zentrifugieren.
    3. Den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette entfernen und verwerfen.
    4. Die Schritte 1.4.2–1.4.3 zweimal wiederholen.
    5. Konzentrierte Proteinpuffer (1–10 mg/ml) zu den TCEP-Kügelchen geben (1:2 Protein : TCEP-Kügelchensuspension, v/v) und vorsichtig mit der Mikropipettenspitze verrühren. Luftblasen vermeiden.
    6. Die Mischung aus Protein und TCEP-Kügelchensuspension 2,5 Stunden auf einem Rotator belassen.
  5. PEGylierung von Deckgläsern und Cantilevern (ca. 1,5 Std.)
    1. Vor der Modifikation mit NHS-PEG-Maleimid-Linkern die aminosilanisierten Cantilever und Deckgläser 45 min in Natriumboratpuffer (pH 8,5) einlegen, um die primären Aminogruppen an der Oberfläche zu deprotonieren.
    2. Sicherstellen, dass das NHS-PEG-Maleimid-Pulver vor dem Öffnen des Verschlusses und dem Abwiegen der benötigten Menge für eine 25 mM-Lösung auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Nicht verwendeten NHS-PEG-Maleimid bei -20 °C unter Argon lagern. Pro Cantilever werden ca. 30 µl Polymerlösung benötigt, pro zwei zusammengelegte Deckgläser (Sandwich) ca. 90 µl.
    3. Nach dem Abwiegen des 5 kDa NHS-PEG-Maleimids Natriumboratpuffer hinzufügen und vortexen, um eine 25 mM-Lösung zu erhalten.
      Hinweis: Die Lösung sollte aufgrund der extrem kurzen Halbwertszeit von NHS bei pH 8,5 so schnell wie möglich verwendet werden. Vortexen und Übertragen der Flüssigkeit auf die Cantilever/Deckgläser sollte innerhalb von 1–2 min abgeschlossen sein.
    4. Cantilever in 30 µl-Tropfen der NHS-PEG-Maleimid-Lösung in einer Petrischale inkubieren. Bei Deckgläsern 90 µl der NHS-PEG-Maleimid-Lösung auf ein einzelnes Deckglas geben und ein zweites Deckglas darauflegen, sodass ein Sandwich mit der NHS-PEG-Maleimid-Lösung in der Mitte entsteht.
    5. Die Cantilever und Deckgläser mit der NHS-PEG-Maleimid-Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer wassergesättigten Atmosphäre inkubieren.
  6. Protein-Konjugation (ca. 2 Std.)
    Wichtig: Die Exposition der PEGylierten Cantilever und Deckgläser gegenüber Luft sollte minimiert werden.
    1. TCEP-Kügelchen/ reduzierte Proteinpuffer 1 min bei 100 rcf zentrifugieren und den Überstand sammeln.
    2. Die Proteinpuffer mit TBS verdünnen. Ziel ist eine Proteinkonzentration im Bereich von 0,5–2 mg/ml während der Oberflächenkonjugation. Die reduzierten und verdünnten Proteinpuffer einige Minuten beiseitestellen, während die Cantilever und Deckgläser gespült werden.
    3. Cantilever und Deckgläser nacheinander in drei Bechern mit ultrareinem Wasser spülen.
    4. Restliche Flüssigkeit vorsichtig von den Deckgläsern entfernen, indem man die Ränder unter einem sanften N2-Strom leicht auf Filterpapier aufsetzt. Restliche Flüssigkeit von den Cantilevern entfernen, indem man sie vorsichtig auf Filterpapier aufsetzt. Die verdünnte Proteinpufferlösung sofort auftragen.
    5. Deckgläser in einer geeigneten Probenhalterung montieren, die mit dem AFM-Gerät kompatibel ist.
    6. PEGylierte Deckgläser und Cantilever mit den jeweiligen verdünnten Proteinpuffern 1–2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Cantilever nacheinander in drei Bechern mit TBS spülen, um nicht gebundene Proteine zu entfernen. Deckgläser mindestens 10-mal mit TBS spülen.
    8. Cantilever und Deckgläser vor der Messung in TBS lagern.

2. Datenerfassung

In dieser Arbeit wurde ein speziell angefertigtes AFM28 verwendet, das über einen MFP-3D-AFM-Controller von Asylum Research und eine benutzerdefinierte Igor-Pro-Software gesteuert wird. Die Hebelarmauslenkung wird mittels der optischen Strahlauslenkungsmethode29 gemessen. Die hier beschriebenen Protokolle zur Probenvorbereitung und Datenanalyse sind unabhängig vom genauen verwendeten AFM-Modell anwendbar. Das AFM-Modell sollte jedoch für Messungen in Flüssigkeiten geeignet sein und einen zugänglichen Geschwindigkeitsbereich des z-Piezoelements von etwa 200–5.000 nm/s unterstützen.

  1. Befestigen Sie den funktionalisierten Cantilever und die Glasoberfläche am AFM. Während des gesamten Vorgangs sollte die Oberfläche stets mit Puffer bedeckt bleiben. Beim Einbau des Cantilevers minimieren Sie die Belüftung. Nach korrekter Justierung des Laserstrahls lassen Sie das System mindestens 30 Minuten lang equilibrieren, um Drifteffekte zu reduzieren, und stellen Sie gegebenenfalls nach.
  2. Aufzeichnen eines thermischen Rauschspektrums mit dem Cantilever weit entfernt von der Oberfläche, d. h. in Abwesenheit von Dämpfungseffekten.
  3. Verwenden Sie eine möglichst schonende Methode wie den akustischen Ansatz, um die Oberfläche zu finden, ohne die Cantileverspitze vor der Messung zu beschädigen. Falls möglich, nähern Sie sich manuell der Oberfläche mit dem Cantilever und verwenden Sie Kopfhörer, um das thermische Rauschen am Rohablenksignal der AFM-Steuerung zu hören. Sobald sich der Cantilever der Oberfläche nähert, ist eine deutliche Klangänderung hörbar.
    Hinweis: Die Cantileverspitze sollte sich nun innerhalb von 2–5 µm zur Oberfläche befinden. Die Art der Klangänderung hängt vom verwendeten Cantilever ab. Die Resonanzfrequenz des in dieser Arbeit verwendeten Cantilevers beträgt in Wasser etwa 25 kHz, oberhalb des menschlichen Hörbereichs. Aufgrund von Dämpfungseffekten in der Nähe der Oberfläche verschiebt sich die Resonanz in tiefere Frequenzen, wodurch die Cantileverresonanz in den hörbaren Bereich gelangt. Daher wird ein scheinbarer Anstieg der Frequenz und Schallintensität wahrgenommen.
    Falls kein Audioausgang des Ablenksignals verfügbar ist, kann die Oberfläche mit dem z-Piezo angenähert werden, während eine aktive Rückkopplung auf das Ablenksignal aktiviert ist. Sobald das Ablenksignal aufgrund der Eindrückung der Oberfläche um einen definierten Betrag ansteigt, wird der Ansatzvorgang gestoppt.
  4. Bestimmen Sie die inverse optische Hebel-Sensitivität (InvOLS), die die Spitzendurchbiegungsstrecke (in nm) pro Volt Ablenksignal darstellt. Führen Sie dies durch Eindrücken der Oberfläche mit der Cantileverspitze durch. Es wird eine Ablenk-Setpoint-Spannung empfohlen, die einer Durchbiegung der Cantileverspitze von etwa 3 nm entspricht.
  5. Bestimmen Sie die Federkonstante des Cantilevers, indem Sie eine Antwortfunktion eines einfachen harmonischen Oszillators an das thermische Rauschspektrum anpassen, gemäß dem Gleichverteilungssatz30,31.
  6. Initialisieren Sie eine experimentelle Routine. Für diese Arbeit wurden folgende Messparameter verwendet: Annäherungsgeschwindigkeit: 3.000 nm/s; Eindrückkraft: 180 pN; Kontaktzeit auf der Oberfläche: 10 ms; Rückzugsgeschwindigkeiten: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/s mit Abtastraten von jeweils 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz; Rückzugstrecke: 500 nm.
    Hinweis: Die Abtastrate sollte nicht höher als 10 Punkte/nm eingestellt werden, um eine Überabtastung zu vermeiden und die Datengröße überschaubar zu halten.
  7. Nach jeder Kraft-Abstands-Kurve aktivieren Sie die x- und y-Piezostufen, um bei jeder Kraft-Abstands-Kurve eine neue Oberflächenposition der Cantileverspitze auszusetzen. Diese Technik ermöglicht es, während Langzeitmessungen einen größeren Bereich der Deckglasoberfläche abzutasten.
  8. Verwenden Sie eine periodische Neunullung der Ablenkstufe (d. h. Photodiodenposition) und der Höhe des z-Piezo-Gehäuses während Langzeitmessungen, falls das Ablenksignal aus dem Messbereich driftet oder der Kontakt zur Oberfläche verloren geht.
  9. Nach Abschluss der Messreihe führen Sie eine weitere InvOLS-Messung mit einer deutlich höheren Eindrückkraft durch als zuvor, um einen präziseren InvOLS-Wert zu erhalten.
  10. Aufzeichnen eines weiteren thermischen Rauschspektrums weit entfernt von der Oberfläche. Bestimmen Sie die Federkonstante am Ende der experimentellen Messreihe.

3. Datenanalyse

Das Flussdiagramm in Abbildung 3 veranschaulicht den Prozess der Datenanalyse. Führen Sie alle Datenmanipulationen mit einem geeigneten Softwarepaket wie Igor Pro oder MATLAB durch. Wandeln Sie zunächst das Rohsignal des Detektors in Kraft-Einheiten um und korrigieren Sie Offset und Drift. Verwenden Sie anschließend Modelle der Biopolymerelastizität, um Energiebarrieren in den Entfaltungsprozessen zu lokalisieren und Protein-Subdomänen zu identifizieren. Schließlich werden kinetische und energetische Parameter der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung bestimmt.

  1. Umwandlung von Einheiten und Datenkorrekturen
    1. Multiplizieren Sie das Rohablenkungssignal (Volt) mit dem InvOLS (nm/Volt) und der Federkonstante (pN/nm), um die Detektorspannung in KraftEinheiten umzuwandeln.
    2. Korrigieren Sie die Daten so, dass der ungebelastete Konsolarm einen Kraftwert von null pN aufweist, indem Sie zunächst die Kraftwerte der letzten 10 % der Kraft-Abstand-Kurve (die am weitesten von der Oberfläche entfernt aufgezeichnet wurden) mitteln und anschließend diesen Mittelwert von allen Kraftwerten der Datenspur subtrahieren.
    3. Verschieben Sie jede Spur in x-Richtung so, dass der erste Schnittpunkt mit der Distanzachse bei einem Abstand von 0 nm liegt.
    4. Der InvOLS hängt von der Position des Laserflecks auf dem Cantilever ab. Selbst geringe Driftmengen im optischen Auslesesystem können bemerkbare Änderungen des InvOLS verursachen, wenn die Fläche des Cantilevers mit der Größe des Laserflecks vergleichbar ist. Korrigieren Sie dies durch Analyse des Rauschens des Ablenkungssignals bei Nullkraft. Unter der Annahme konstanter Umgebungsbedingungen ist das Rauschen des Ablenkungssignals direkt proportional zum InvOLS.
      1. Messen Sie den quadratischen Mittelwert (RMS) der Auslenkung (Rauschpegel unter Nullkraft) der letzten 10 % jeder Kraft-Abstands-Kurve.
      2. Tragen Sie das Rauschen gegen die Kurvennummer auf und wenden Sie eine geeignete Anpassungsfunktion an. Typischerweise eine exponentielle Anpassung in der Form von Exponential decay formula, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), mathematical representation. eignet sich am besten, wobei N das Rauschen, ni die Kurvennummer und N0 sowie k Fit-Parameter sind. Für bestimmte Datensätze kann auch eine lineare Anpassung geeignet sein.
      3. Bestimmen Sie einen Skalierungsfaktor (SF) für jede Kurve:

        Gleichung 1:
        static equilibrium equation; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); mathematical formula
        wobei ni die Kurvenzahl, nf die endgültige Kurvenzahl und C eine Offset-Konstante ist.
      4. Teilen Sie anschließend alle Kraftwerte jeder einzelnen Kurve durch den Skalierungsfaktor. Dieses Verfahren skaliert jede Kurve um das Verhältnis des RMS-Rauschwertes der aktuellen Kurve zum RMS-Rauschwert der endgültigen Spur, die unmittelbar vor der InvOLS-Messung aufgezeichnet wurde.
      5. Führen Sie eine Biegekorrektur durch, um die Distanzachse (z) in die molekulare Extension (z*) umzuwandeln. Dies berücksichtigt die Biegung des Cantilevers unter Kraft, wodurch der Abstand zwischen Cantilever-Spitze und Probe von dem durch die Position des z-Piezo-Sensors gemeldeten Wert verkürzt wird.

        Gleichung 2:
        Static equilibrium equation, z* = z - F/k, formula; physics calculations, force analysis
        Wo z ist die gemessene Position des Z-Sensors, F die auf dem Cantilever wirkende Kraft und k die Federkonstante
  2. Analyse der Konturlänge
    Die Konturlänge eines Proteins ist die maximal gestreckte Länge der Polypeptidkette. Der Faltungszustand eines Proteins bezieht sich auf seine Geometrie und die Abstandsentfernung von Ende zu Ende, die durch die sekundäre und tertiäre Struktur bestimmt ist. Die Konturlänge eines Proteins steht in direktem Zusammenhang mit seinem Faltungszustand.9,25,32. Die Position spezifischer Brüche in Kraft-Dehnungs-Kurven variiert stark aufgrund der Polydispersität der PEG-Linker sowie externer Parameter wie Temperatur, Puffereigenschaften und Belastungsgeschwindigkeiten. Dies erschwert die direkte Datenanalyse, kann jedoch überwunden werden, indem die Kraft-Dehnungs-Daten in den Konturlängenraum transformiert werden. Diese Technik ermöglicht die Mittelung über sehr große Datensätze und erlaubt den Einsatz automatischer Mustererkennung zur Identifizierung charakteristischer Entfaltungsereignisse. Es ist daher möglich, individuelle Kraft-Kurven je nach Art der beobachteten Wechselwirkung zu sortieren. Das folgende bereits beschriebene Verfahren25 wird verwendet, um Kraft-Dehnungs-Daten in den Konturlängenraum zu transformieren.
    1. Lösen des WLC-Modells (Gleichung 3)23 für die Konturlänge L bei einer festen Biegesteifigkeit p ergibt Gleichung 4, die die Konturlänge liefert L(x,u). Hier, x ist die Distanz und u = F · p / kBT, wobei kB ist die Boltzmann-Konstante und T ist die Temperatur. Nur reelle Lösungen können berücksichtigt werden. Weitere Nebenbedingungen sind x, F>0, L>0, x>0;

      Gleichung 3:
      Force-extension formula, F(x,L), polymer physics equation, illustrates entropic elasticity.

      Gleichung 4:
      Static equilibrium, L(x,u), complex formula, educational diagram, analytical expression interpretation.
      wobei,
      Polynomial function \( g(u) \) equation, mathematical analysis, symbolic computation.
    2. Tragen Sie die transformierten Datenpunkte in einem Kraft-zu-Konturlängen-Diagramm auf. Wenden Sie eine Kraftschwelle von etwa 10 pN an, um Rauschen auszuschließen. Unspezifische Wechselwirkungen können durch Anwendung eines Langpass-Längenfilters ausgeschlossen werden. Erstellen Sie ein Histogramm der Konturlängen.
    3. Kreuzkorrelieren33 die erhaltenen Histogramme mit einem Vorlagen-Histogramm und verschieben Sie diese entlang der x-Achse, um die Polydispersität von PEG zu korrigieren. Verwenden Sie die resultierenden Korrelationswerte, um die Ähnlichkeit einzelner Datenspuren zu bewerten. Auf diese Weise können Datenspuren in vordefinierte Klassen eingeteilt werden, um die weitere Analyse zu vereinfachen.
    4. Verwenden Sie eine ähnliche Technik, um durch Autokorrelation sich wiederholende Merkmale in einer einzelnen Spur zu finden, z. B. für das Entfalten mehrerer Ig-Domänen
    5. Sortieren Sie die Spuren manuell, um andere Entfaltungsereignisse zu untersuchen.
  3. Analyse der Belastungsgeschwindigkeit
    Extrahieren Sie kinetische und energetische Informationen über die Dissoziation von Rezeptor-Ligand-Komplexen, indem Sie geeignete Modelle auf das Kraftspektrum anwenden. das heißt die Risskraft-zu-ln(Ladegeschwindigkeit)-Auftragung
    1. Bestimmen Sie für eine gegebene Zuggeschwindigkeit die Bruchkraft und die Belastungsgeschwindigkeit für die relevanten Bruchereignisse:
      1. Führen Sie eine Geradenanpassung an die Kraft-Zeit-Kurve in der Nähe des gewünschten Bruchereignisses durch. Bestimmen Sie die Belastungsgeschwindigkeit aus der Steigung der an den Peak angepassten Geraden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Kurve, die das gewünschte Bruchereignis zeigt.
      2. Bestimmen Sie die wahrscheinlichste Bruchkraft, indem Sie eine Gauß-Anpassung an ein Histogramm der Bruchkräfte anwenden. Andere Anpassungsfunktionen sind möglich.
      3. Bestimmen Sie die wahrscheinlichste Belastungsgeschwindigkeit.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3.1 bis 3.3.3.3 für alle Zuggeschwindigkeiten.
    3. Tragen Sie die wahrscheinlichsten Rupturkräfte gegen den natürlichen Logarithmus der wahrscheinlichsten Ladegeschwindigkeiten auf, um das Kraftspektrum zu erhalten.
    4. Wenden Sie ein geeignetes theoretisches Modell auf das Kraftspektrum an, um kinetische und energetische Parameter zu extrahieren (Abbildung 4C). In vielen Fällen das lineare Bell-Evans-Modell20,34 können verwendet werden und liefern gute Schätzungen für koff, die Dissoziationsrate in Abwesenheit von Kraft, und Dx der Abstand zum Übergangszustand entlang der Reaktionskoordinate, wie in Gleichung 5 dargestellt.

      Gleichung 5:
      static force equation ⟨F⟩, k_B T/Δx, formula analysis for thermal fluctuation experiments

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Ergebnisse

Wir verwendeten das beschriebene Verfahren, um ein Typ-I-Cohesin-Dockerin-Paar aus C. thermocellum zu untersuchen. Nach erfolgreichem Binden des Cohesin-Dockerin-Paares zeigten die aufgezeichneten Kraft-Abstands-Kurven charakteristische Peak-Muster. Eine typische Kurve ist in Abbildung 4a dargestellt. Jeder Peak in der Kurve repräsentiert das Entfalten einer Proteinsubdomäne, wobei der letzte Peak der Dissoziation des Rezeptor-Ligand-Komplexes entspricht.

Für den in d...

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Diskussion

Um aussagekräftige Daten aus Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Experimenten zu erhalten, ist es entscheidend, gut definierte und reproduzierbare Zuggeometrien zu erreichen. Das hier verwendete Protokoll führt zu einer ortsspezifischen Immobilisierung von Proteinkomplexen in einer definierten Zuggeometrie.

Die in dieser Studie verwendeten Ausleger wurden aufgrund ihrer Kraftempfindlichkeit und hohen Resonanzfrequenz im Wasser ausgewählt. Darüber hinaus ist die kleine Spitzenkrümmung von ca. 10 n...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Hermann Gaub für die Finanzierung durch ein Advanced Grant des Europäischen Forschungsrats. Michael A. Nash bedankt sich dankbar für die Finanzierung durch das Branco Weiss Fellowship-Programm von Society in Science. Die Autoren danken Edward A. Bayer, Yoav Barak und Daniel B. Fried vom Weizmann Institute of Science für die großzügige Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Proteine. Die Autoren danken Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner und Stefan W. Stahl für die hilfreichen Gespräche.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-AminopropyldimethylethoxysilanABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimidRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP Disulfid ReduktionsgelThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
BioLever Mini-Siliziumnitrid-AuslegerOlympusBL-AC40TS-C2Weiche Chargen
XYZ Piezoelektrische AktuatorenPhysik Instrumente GmbH
Infrarot " breites Spektrum" IR-LaserSuperlum
MFP-3D AFM ControllerAsylum Research
Igor Pro 6.31WavemetricsDatenerfassung und -analyse
Natriumchlorid
Calciumchlorid
pH-Messgerät
Natriumborat
Pinzette
DeckgläserThermo Scientific, Menzel-Glä ser24 mm Durchmesser, 0,5 mm Dicke
PTFE-Probenhalternach Maß
Sonicator-Bad
Ethanolanalytische Reinheit
Schwefelsäure (konzentriert)analytische Reinheit
Wasserstoffperoxid (30%)analytische Reinheit
Orbitalschüttler
Toluolanalytische Reinheit
Filterpapier
Objektträger Objektträger
Mikroröhrchen
Mikropipetten
Zentrifugegeeignet für Mikroröhrchen
Rotator
Petrischalen
Becher
Optisches Mikroskop

Referenzen

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