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Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

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DOI:

10.3791/50951

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19. September 2013

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1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird ein Verfahren, um dendritische Zellen (DC) und Epithelzellen (TEC) von dem menschlichen Thymus isolieren. DC und TEC sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen (APC)-Typen in einem normalen Thymus gefunden, und es ist bekannt, dass sie unterschiedliche Rollen während Thymus-Auswahl zu spielen. Diese Zellen werden in unterschiedlichen Mikroumgebungen im Thymus lokalisiert und jeweils APC Typ macht nur einen geringen Population von Zellen. Die Biologie dieser Zelltypen weiter zu verstehen, ist die Charakterisierung dieser Zellpopulationen sehr wünschenswert, aber wegen ihrer niedrigen Frequenz, die Isolierung von jeder dieser Zelltypen erfordert ein effizientes und reproduzierbares Verfahren. Dieses Protokoll Details eine Methode für die Charakterisierung von verschiedenen zellulären Eigenschaften Zellen zu erhalten. Thymusgewebes mechanisch aufgeschlossen und nach verschiedenen Schritten des enzymatischen Verdau wird das erhaltene Zellsuspension mit einem Zentrifugationsschritt Percoll-Dichte angereichert. Für die Isolierung von myeloischen DC (CD11c <sup> +)-Zellen von geringer Dichte Fraktion (LDF) durch magnetische Zellsortierung immunoselected. Anreicherung von TEC Populationen (mTEC, cTEC) durch Verarmung der hämatopoetischen (CD45 hallo)-Zellen von geringer Dichte Percoll Zellfraktion wodurch ihre anschließende Trennung mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung spezifischer Zellmarker erreicht. Für verschiedene Downstream-Anwendungen können die isolierten Zellen verwendet werden.

Einleitung

Der Thymus ist das Organ, in dem T-Zell-Entwicklung auftritt. Seine relative und absolute Größe mit dem Alter abnimmt, wenn sie teil sukzessive durch Fett ersetzt, obwohl Thymusaktivität noch im Alter festgestellt werden. Seine Bedeutung für die Immunantwort wurde in den frühen 1960er Jahren ein demonstriert.

Die T-Zell-Repertoire ist durch die Wechselwirkung der T-Zell-Rezeptoren, die mit Peptid-MHC-Komplexe auf unterschiedliche Arten von Thymus-APC, die das Überleben oder Tod Signale zu entwickelnden T-Zellen, was zu einer funktionellen und weitgehend selbst tolerant T-Zell-Repertoire 2 vorzusehen geformt.

Etwa 98% der Zellen im menschlichen Thymus-T-Zellen entwickeln sich als Thymozyten bezeichnet. Die restlichen 2% bestehen aus einer Reihe von verschiedenen Zelltypen, einschließlich einer Vielzahl von TEC (kortikalen Mark, subkapsuläre), myeloide und plasmazytoiden DC (MDC, PDC), Makrophagen, B-Zellen reifen Umlauf-T-Zellen, Granulozyten, fibroblasts, Endothelzellen und Epithelzellen seltenen Zellen mit einem Expressions Phänotyp ähnlich derjenigen Zellen aus anderen Geweben, wie Muskel, Nervenzellen und respiratorischen Epithels (Abbildung 1). Davon TEC und DC sind die wichtigsten Arten von APC in einem normalen Thymus gefunden. In den letzten Jahren ist die Reinigung dieser APC-Typen für Kultur und molekularen Charakterisierung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz, Isolierung jeder dieser Zelltypen für eine detaillierte Analyse erfordert eine effiziente, reproduzierbare und kostengünstiges Verfahren. Die hier vorgestellte Methode ist eine Modifikation von bisher veröffentlichten Studien 3,4.

Wie bei jedem anderen Gewebe können Zellgewinnung aus dem Thymus von enzymatisch Disaggregation der Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionsnetzwerke, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten, erreicht werden. Es gibt bestimmte Parameter, wie gut Dissoziation Effizienz, Zellausbeute, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Aufrechterhaltung des Zell surface Marker, die von entscheidender Bedeutung sind, und müssen für die erfolgreiche Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen optimiert werden.

In diesem Protokoll wird Trennung von DC und TEC Teilmengen, indem eine Einzelzell-Suspension aus dem Gewebe durch mechanische Zerstörung und enzymatischen Verdau durchgeführt. Wir verwenden Collagenase aus Clostridium histolyticum A, die ein ausgewogenes Verhältnis von verschiedenen Enzymaktivitäten hat, um die native Kollagen, die das Gewebe zusammenhält brechen. DNase I in der Enzymlösung enthalten, um die Zellaggregation durch freie DNA von toten Zellen zu reduzieren (Thymozyten sind sehr empfindlich). Wir bieten auch einen alternativen Ansatz zu den typischen enzymatische Verdauung Gewebe mit mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt. Die Einzelzellsuspension wird dann in einer einzigen Percoll-Dichte-Zentrifugation zur Anreicherung der Fraktion mit niedriger Dichte (LDF) von Zellen unterzogen. Von diesem Teil der Zellen kann durch Färbung DC f isoliert werdenoder DC-Oberflächenmarker (dh CD11c +) und unter Verwendung magnetische Trennung oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Gegensatz zu den lymphoiden Zellen, die große Mehrheit der Zellen in der Thymusdrüse, nicht TEC nicht exprimieren CD45 auf hohem Niveau, jedoch sind positiv für das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM. cTEC aus Mark TEC durch den Ausdruck eines noch nicht definierten Antigen durch die CDR-2 (kortikale dendritischen Retikulozyten-2)-Antikörper 4,5 und etwas niedriger EpCAM-Expression erkannt unterschieden werden. Der Differenz Co-Expression von EpCAM und CDR2 ermöglicht die effiziente Isolierung dieser TEC Teilmengen über Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung 6.

Die hier vorgestellte Protokoll ist für den menschlichen Thymus-Gewebe optimiert. Die Dauer des Verfahrens hängt von der Menge des Gewebes und der Fähigkeit der Versuchs sowie der Geschwindigkeit des Zellsortierer, wenn FACS-Sortierung verwendet. Normalerweise kann das Protokoll für die Isolierung von DC in 5 abgeschlossen-6 H und für die Isolierung von TEC in 8-10 Std. Die Trennung von DC-und TEC Teilmengen aus Thymus-Gewebe ist an der Zeit empfindlich. Je schneller die Isolierungsverfahren, die besser der Zustand der Zellen. Schließlich können die isolierten Zellen für weitere Untersuchungen, wie Vergleichsstudien von mRNA und Proteinexpression, PCR-Experimente, Proteinisolierung, molekularen Charakterisierung (dh Transkriptom, Mikro-RNA-Analyse) als auch Zellkultur 6 verwendet werden.

Ethikerklärung

Um in der Lage, mit der menschlichen Thymusgewebe arbeiten muss der Forscher der Zustimmung der lokalen Ethikkommission oder zuständigen Behörden sowie eine fundierte schriftliche Zustimmung der Spender (oder in der Regel seine Eltern, zu erhalten, da Gewebe wird in der Regel von minderjährigen erhalten Kinder). Darüber hinaus sollten alle menschlichen Gewebe als potenziell infektiös und sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, wie die Arbeit mit Handschuhen, etc. behandelt werden.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Werkzeuge, Enzym-Lösungen und Puffer

Führen Sie die folgenden Schritte präparative vor Beginn des Protokolls.

  1. Werkzeuge
    Sauber, trocken und Autoklaven werden die folgenden Tools und halten sie in einer sterilen Verpackung bis zur Verwendung.
    1. Kleine scharfe Schere entweder mit gebogenen oder geraden Tipps zum Schneiden des Thymus Gewebe. Kleine gebogenen Pinzette mit geriffelten Spitzen für die Behandlung des Gewebes.
    2. 50 ml Oak Ridge Zentrifugenröhrchen, PC, für den Zentrifugationsschritt Percoll-Dichte.
  2. Enzymlösungen
    Bereiten Sie die Collagenase / DNase-I-Enzym mischen (2 mg Collagenase / ml und 0,1 mg DNase I / ml) wie folgt:
    1. Man löst 500 mg des lyophilisierten Collagenase A (Roche) in 250 ml RPMI 1640 einfarbigen (FCS), um eine 2 mg / ml Collagenase-Lösung zu erhalten. Collagenase ist ziemlich schwer zu lösen, so empfiehlt es sich, einige Zeit auf einem Rollenschüttler bei RT verlassen.
    2. Lösen Sie 100 mg DNase I (Roche) in10 ml steriles destilliertes Wasser. 2,5 ml-Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Fügen Sie 2,5 ml der 10 mg DNase I-Lösung in der 2 mg Collagenase eine Lösung.
    3. Sterilfilter der Collagenase / DNase-Mix mit einem Stericup Filtereinheit (0,22 um). Speicher in 10-20 ml-Aliquoten bei -20 ° C bis zur Verwendung.
  3. Puffer und Lösungen
    1. 1,5 M NaCl Lager Lösung: NaCl in destilliertem sterilem Wasser zu einer endgültigen Konzentration von 1,5 M. Die Lösung wird durch einen 0,22 um Filter und Speicher bei RT.
    2. 10x MACS Puffer: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-frei), enthaltend 5% BSA und 20 mM EDTA. Sterilfilter die Lösung mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C Vor der Verwendung bereiten eine 1x-Lösung durch Verdünnen des 10fach in kaltem sterilem 1x PBS 1x.
    3. FACS-Puffer: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-frei), enthaltend 1% BSA und 0,02% NaN 3.
    4. FACS-Puffer für Zellsortierung: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-frei), enthaltend 2% BSA. Sterilisieren mit einem 0,22 um Spritzenfilter und lagern bei 4 ° C

2. Präparation des Gewebes

Die Verarbeitung der Gewebe sollte mit sterilen Reagenzien und Arbeit in einer Sterilbank durchgeführt werden. Bevor das Verfahren beginnt, bereiten die folgenden Reagenzien und Geräte:

    1. Wärmen Sie die folgenden auf RT: RPMI 1640 Komplettmedium (RPMI 1640, 10% Fetales Kälberserum, 1% Pen / Strep), RPMI 1640 schlicht, Ca 2 + / Mg 2 +-freiem PBS und 2x Collagenase / DNase Enzymlösung.
    2. Warm Wärmebrutschrank mit Dreheinheit auf 37 ° C und kühlen Festwinkelrotor Zentrifuge auf 4 ° C
    3. Bereiten Sie eine Box mit Eis.

Hinweis: Die Dauer dieses Schritts ist abhängig vom Zustand und der Größe des Gewebes. Etwa 20-30 min ist ausreichend Zeit für eine mittelgroße Stück ti benötigtUSGABE in gutem Zustand (~ 5 cm in der Breite).

  1. Zeigen Gewebe in einer Petrischale mit sterilem PBS und abspülen Restblut.
    1. In frischem PBS, um Gewebe von Trocknung und mit Pinzette und Schere reinigen das Gewebe von Blutgerinnseln, Binde-und Fettgewebe und einer Komponente, die nicht gesund aussieht verhindern.
    2. Achten Sie darauf, nekrotischen Gewebes, die die Menge von Schutt erhöhen zu entfernen.
    3. Nach der Reinigung, wiegen Gewebe als Referenz.
    4. Schneiden Sie das Gewebe in ca. 1 cm 3 Stücke / Blöcke. Fügen Sie genug PBS, um das Gewebe zu decken.

Anmerkung: Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sollte Gewebe in Stücke von einheitlicher Größe geschnitten werden.

  1. Mit dem Rücken einer sterilen Spritze (10-20 ml) gelten Druck (nicht zu kräftig oder längerer) auf die Thymus-Gewebestücke. Dieses Verfahren wird den Großteil der Thymozyten zu entfernen, damit die Gewebevolumen zu reduzieren, um später verdaut werden. Führen Sie diesen Schritt auf Eis und arbeiten schnell.
  2. Die Lösung wird sichtbar trübe werden als Thymozyten freigegeben werden. Rühren Sie die Schale vorsichtig und dann mit Hilfe einer 5 ml Pipette oder einem Glassauger entfernen Sie den Überstand, der die Thymozyten kümmert sich nicht um die Gewebestücke versehentlich abzusaugen.

Tipp: Eine sterile Zellkulturschaber können alle Gewebestücke auf einer Seite der Schale zu konzentrieren, dann kippen die Schale (45 °-Winkel) und saugen Sie den Überstand werden. Ersetzen mit frischem PBS und wiederholen Sie den Vorgang, bis der Überstand ist relativ transparent. Führen letzten Waschen mit RPMI Ebene.

  1. Mince Gewebestücke mit einer scharfen Schere (so fein wie möglich, sollte zumindest Fragmente 2-4 mm sein). Die Fragmente sollte klein genug, um eine 5-ml-Pipette einzugeben.

3. Herstellung von Einzelzellsuspension von Thymus Tissue

HierZwei alternative Ansätze für diesen Schritt beschrieben. Der erste Ansatz beschreibt eine typische enzymatische Verdauung Gewebe (Abschnitt 3.1), während die zweite besteht aus mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator (Abschnitt 3.2) unterstützt.

Dieses Protokoll ist für die Verarbeitung von Gewebeproben mit einem Gewicht von 5 g optimiert. Für größere oder kleinere Gewebeproben, passen Enzymmengen.

3.1 Typische enzymatische Verdauung Gewebe, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten

  1. Zeigen püriert Gewebe in 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Collagenase / DNase-Lösung pro 5 g Gewebe. In RPMI schlicht um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.

Hinweis: In einem 50-ml-Röhrchen verdauen bis 10 g Gewebe. Stellen Enzym Volumen entsprechend.

  1. Inkubieren des Gewebes Suspension für 40 min bei 37 ° C unter langsamer Rotation in einem thermischen Inkubator.

Hinweis: die Inkubationsschritte können entweder in einem thermischen Inkubator mit einer Dreheinheit oder in einem 37 ° C Inkubator mit einer Bakterienschüttler durchgeführt werden.

  1. Die Enzymlösung wird trüb wie Zellen werden in der Veröffentlichung. Am Ende der Verdauung, Zentrifugenröhrchen bei 110 x g für 2 min, um Gewebefragmente zu sedimentieren.
  2. Sammeln Stand aus diesem Verdauung Runde. Pellet die Zellsuspension für 10 min bei 400 x g. Absaugen des Überstandes und Resuspension Zellen in 10-50 ml RPMI Komplett abhängig von der Größe des Zellpellets.
  3. Halten Zellsuspension in 37 ° C-Inkubator mit dem Deckel lose.
  4. Wenn größere Zellzahlen erwünscht sind, kann der Schritt zur Digestion mit den restlichen Gewebestücke wiederholt werden und der erste und der zweite verdauen gepoolt. Auch wenn TEC sollten isoliert werden zwei Runden Verdaus durchgeführt werden sollte.
  5. Ein Aliquot der Zellsuspension in Trypanblau (1:10-1:100) und zählen lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer.
  6. Halten Zellen bei 37 ° C in den Brutschrank, bis bereit, auf die Percoll Dichte-Zentrifugation (Abschnitt 4) fort. Nachfolgende Trennung von DC-Untergruppen (Abschnitt 5) wird aus diesen Zellen durchgeführt werden.

Hinweis: Thymus-Gewebe können in ihrer Zusammensetzung variieren, insbesondere mit dem Alter, die die Verdauung und die Effizienz der Erzeugung einer Einzelzellsuspension beeinflußt.

  1. Für die anschließende Isolierung von Thymus-Epithelzellen (TEC) eine dritte Runde der enzymatische Verdauung benötigt wird. Resuspendieren Gewebereste in 10 ml frischem Collagenase / DNase-Lösung plus 10 ml RPMI schlicht und fügen Trypsin / EDTA (1:50 von 2,5% Aktien) in der Lösung.
  2. Inkubieren bei 37 ° C für 40 min unter leichtem Rotation. Während der letzten 10 - 15 min der Inkubation hinzugefügt FCS (1:5), um die Aktivität von Trypsin zu neutralisieren.
  3. Zentrifugieren bei 110 × g für 2 min bei RT, um die Gewebestücke zu sedimentieren.

Hinweis: Das Gewebe kann nicht vollständig nach diesen drei Runden Aufschlüsse verdaut werden. Alter und Allgemeinzustand des Gewebes gibt zwei Parameter, die die Dissoziation Effizienz des Thymus Gewebe zu beeinflussen.

  1. Sammeln Sie die Zellüberstand und entsorgen Sie die Gewebefragmente sedimentiert.
  2. Zentrifugieren des Zellüberstands bei 400 g für 10 min. Absaugen des Überstandes und resuspendieren Zellpellet in RPMI komplett.

Tipp: Die Zellpellets sind sehr locker, so achten Sie bei Verwerfen / Absaugen Stand.

  1. Graf lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer. Legen Sie die Zellen in einer 37 ° C-Inkubator, bis Sie fortfahren, um die Trennung (Abschnitt 4) PERCOLL. Nachfolgende Voranreicherung von TEC-Zellen durch Depletion von CD45 hallo Zellen aus diesen Zellen (Abschnitt 6) durchgeführt werden.

3.2 Mechanische und enzymatische Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt

Das Gewebe Dissociator nähern sich die Gewebe Verdauung Schritte können bis zur Hälfte der Zeit mit dem oben (Abschnitt 3.1) beschriebenen Ansatz erforderlich, reduziert werden. Das folgende Protokoll ist eine modifizierte Version, die zur Maus Thymusgewebes zur Isolierung von TEC 7,8 dissoziieren.

  1. Übertragungs 5 ​​g zerkleinerte Gewebe Stücke (Schritt 2.5) in eine C-Rohr, das 10 ml Collagenase / DNase-Lösung.
  2. Passen C-Rohr auf das Gewebe Dissoziator und Run-Programm m_spleen_02 (10 sec). Wiederholen Sie dieses Programm 4-5x (40-50 s).
  3. Inkubieren mit leichter Rotation für 20 min bei 37 ° C.
  4. Zentrifugieren bei 110 × g für 2 min bei RT.
  5. Sammeln Überstand und gehen Sie wie in Schritt 3.1.4. 10 ml frisch Collagenase / DNase-Lösung.
  6. Passen C-Rohr auf das Gewebe Dissoziator und Run-Programm m_spleen_01 (56 sec).
  7. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min unter leichtem Rotation.
  8. Zentrifugieren bei 110 × g für 2 min bei RT.
  9. Kol.T-Zell-Überstand und die Zellsuspension pelle für 10 min bei 400 x g. Gehen Sie wie in Schritt 3.1.4.
  10. Wie in 3.1.9 beschrieben, eine dritte Runde der Verdauung ist für die anschließende Isolierung von Thymus-Epithelzellen (TEC) benötigt. Dazu resuspendieren Gewebereste in 10 ml frischem Collagenase / DNase-Lösung sowie Trypsin / EDTA (1:50 Verdünnung der Lager 2,5%)
  11. Inkubieren bei 37 ° C für weitere 20 min unter leichtem Rotation. In FCS (1:5) und Inkubation für weitere 10 min.

Hinweis: Mit diesem Ansatz nach diesem letzten Schritt der Verdauung wird das Gewebe in der Regel vollständig dissoziiert und keine unverdauten Gewebefragmente eingehalten werden.

  1. Gehen Sie wie in den Schritten 3.1.11-3.1.14.

4. Anreicherung von Zellen unter Verwendung von LDF Percoll-Dichte Trennung

Nach der enzymatischen Verdauung des Gewebes werden die Gesamt Thymus Einzelzellsuspensionen auf eine einzige Percoll-Dichte unterworfen centrifugatIonen Schritt für die LDF Zellen anzureichern. Die LDF von Zellen ist sehr für APC bereichert. DC-und TEC werden in diesem Teil der Zellen nachgewiesen.

  1. Benutzen Sie aus der 1. und 2. für MDC-Isolierung verdaut erhaltene Zellsuspension (gepoolte Zellen, siehe Schritt 3.1.8) oder 3. Digest (für TEC Isolierung) (3.1.14). Centrifuge Einzelzellsuspension von jedem Schritt der Verdauung bei 400 g für 10 min erhalten.
  2. Bereiten Sie eine Percoll-Lösung mit einer endgültigen Dichte von 1,07 g / ml während dieser Waschschritt (siehe Beispiel unten in der Tabelle).
    Herstellung der Percoll-Lösung auf eine Enddichte von 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
    Rohrnummer 1 2 3 4
    Das unverwässerte Percoll (ρ = 1,130) (ml) 2,96 5,92 8,88 11.84
    1,5 M NaCl (ml) 0,6 1,20 1.8 2.4
    destilliertes H 2 O (ml) 2,44 4,88 7,32 9,76
    Volumen der letzten Arbeitsverdünnung 6 ml 12 ml 18 ml 24 ml
  3. Die Anzahl der Percoll Rohre hängt von den Zellzahlen in den Schritten 3.1.8 und / oder 3.1.14 bestimmt. Kombinieren Sie die sterile Lösungen und gründlich mischen. Für eine optimale Isolation, können 0,6-1 x 10 9 Zellen pro Röhrchen Percoll geladen werden. Kombinieren Sie die sterile Lösungen und gründlich mischen.

Tipp: Percoll ist lichtempfindlich und außerdem sollte es kalt gehalten werden. Vorbereitung der ersten Mischung, die das NaCl und H 2 O (RT) und unverdünnt Percoll zuletzt, kurz vor dem Resuspendieren der Zellen in der Percoll-Lösung.

Zelt "> Hinweis: Percoll-Dichte kann zwischen verschiedenen Lieferanten und Chargen variieren Ist die Dichte der unverdünnten Percoll-Lösung nicht gleich 1,130 g / ml, verwenden Sie die vom Hersteller gelieferten Anweisungen, um die genauen Beträge der Percoll und H 2 O berechnen erforderlich, um eine endgültige Dichte von 1,07 g / ml erhalten.

  1. Resuspendieren bis zu 1 x 10 9 Zellen in 6 ml der zubereiteten Percoll-Lösung (ρ = 1,07), mischen ausreichend, um eine homogene Suspension zu erhalten, und in ein 50 ml Oak Ridge Polycarbonat Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen.
  2. Schicht sorgfältig mit 30 ml RPMI-Voll pro Röhrchen mit einer Pipette auf der Oberseite der Percoll-Lösung / Zellsuspension. Legen Sie das Medium langsam, so dass es auf der Oberseite der Suspension bleibt und kümmern sich nicht um die Schicht zu stören.
  3. Wiegen Sie die Rohre, um sicherzustellen, dass sie gleiche Gewichte, so dass sie während der Zentrifugation ausgeglichen sind. Wenn sie es nicht sind, sorgfältig Medium mehr hinzufügen, um die leichtere Rohr (unter sterile Bedingungen).
  4. Sorgfältig die Rohre zu einer vorgekühlten Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor, und Spin-Transfer bei 3.500 × g für 35 min bei 4 ° C mit der Bremse aus. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur in der Zentrifuge nicht höher als 4 ° C.
  5. Röhren entfernen aus der Zentrifuge und sorgfältig sammeln die angereicherte APC, an der Interphase zwischen Percoll und Medium (Low-Density-Fraktion) gefunden von jedem Rohr mit einer sterilen Pasteur-Pipette. Übertragungszellen in einem 50 ml Röhrchen mit kaltem RPMI komplett. Füllen Sie das Rohr, um das restliche verdünnte Percoll.
  6. Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 300 × g bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Waschen wiederholen.
  7. Zellpellet in mittleren und bestimmen die Zellzahl (unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer). Nach unserer Erfahrung ist der Prozentsatz der LDF-Zellen etwa 2-20% des nach Enzymspaltung gewonnenen Gesamt-Einzelzellsuspension. Eine typische yield von Low-Density-angereicherten Zellen (Thymus von einem jungen, Bereich 1 Tag-2 Jahre) ist 1x10 8 Zellen pro 1 x 10 9, was einer 10% der gesamten Einzelzellsuspension Zellen.

Hinweis: In dieser Phase können Sie beobachten, dass Zellen in der Suspension aggregiert (vor allem mit Proben von Kindern älterer Alter). Zellklumpen sind Anzeichen von Zelltod und das Ergebnis aus der Auflösung von DNA aus den sterbenden Zellen, die Zellen zusammenkleben können. In einem solchen Fall fügen DNase I in der Probe (50 ug / ml) inkubiert und es bis zu 20 min bei RT (sanft invertiert alle 5 min), um die freie DNA-Molekülen verdauen.

5. Isolierung von Thymic mDC

APC nach Anreicherung (über Percoll-Trennung), MDC effizient von der LDF nach der ersten und zweiten Runde der enzymatischen Verdaus isoliert werden. Das folgende Protokoll ist eine modifizierte Version des magnetischen Zelltrennung zur Isolierung von MDC (CD11c +).

  1. Zentrifuge APC angereicherten Zellen aus der aus den gepoolten ersten und zweiten enzymatischen Abbau bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren Zellpellet in 100 &mgr; l MACS-Puffer erhalten pro 10 7 Zellen Einzelzellsuspension isoliert.
  2. In 5 ul der CD11c-PE Antikörper pro 10 7 Zellen.

Hinweis: Titration Experimente sind für optimale Ergebnisse empfohlen.

  1. Gut mischen und die Proben für 15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
  2. Waschen der Zellen durch Zugabe von 1-2 ml von MACS-Puffer pro 10 7 Zellen und Zentrifugation bei 300 × g für 10 min.
  3. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren bis zu 10 7-Zellen in 80 ul MACS-Puffer.
  4. In 20 ul Anti-PE-Microbeads pro 10 7 Zellen.
  5. Gut mischen (nicht vortexen) und Inkubation für 15 min bei 4 ° C vor Licht geschützt.
  6. Wiederholen Sie, wie in Schritt 5.4.
  7. Resuspendieren bis 10 8 Zellen in 500 &mgr; l Puffer.
  8. Ggf. Filterzellsuspension unter Verwendung eines 40 &mgr; m-Zellsieb um Schmutz und Zellaggregaten, die die Strömung der Säule verstopfen können, zu entfernen.
  9. Verwenden Sie eine Spalte LS seit Thymus Zellsuspensionen besser fließen durch die LS-Säulen. Bereiten LS Spalte folgenden Anweisungen des Herstellers. Pipette Zellsuspension langsam in der Säule vermieden Erzeugen von Blasen. Verwenden Sie eine Spalte für jeweils 1 x 10 8 Zellen.
  10. Nach den Anweisungen des Herstellers Waschkolonne. Entfernen Spalte aus Magnet und legen Sie sie in ein steriles 12 ml-Rundrohr Polypropylen. 3 ml MACS-Puffer in die Säule und Sammeln magnetisch markierten Zellen durch Einführen und fest drückt den Kolben in die Säule.
  11. Sammeln Sie die eluierte Fraktion, die die CD11c + mDC und Zentrifuge bei 400 g für 6 min.
  12. Bestimmen der Zellzahl und bestätigen Reinheit der ausgewählten Zelle populatiauf durchflusscytometrisch. Empfohlene Marker umfassen CD45, CD11c und HLA-DR.

Hinweis: CD11c + mDC kann auch unter Verwendung eines FACS-Sorter isoliert werden.

6. Anreicherung von CD45 lo / neg Zellen für die Zellsortierung von TEC

Für die Isolierung von TEC können Zellen vor, angereichert durch Depletion von CD45-Zellen mit CD45 hallo Mikrokügelchen, um durch Zellsortierung Beschleunigung ihrer Isolation.

Benutzen Sie aus dem 3. Verdauung Schritt (3.1.14) erhalten und anschließend durch Zentrifugation abgetrennt Percoll Zellsuspension.

  1. Pro 10 7 Zellen Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren Zellpellet in 80 &mgr; l MACS-Puffer.
  2. Verwenden CD45 Microbeads bei 1/3 der empfohlenen Menge (6,7 &mgr; l) pro 10 7 Zellen.

Hinweis: Durch die Verwendung einer geringeren Mengeder Mikrokügelchen wir vor, eine Bereicherung für beide Zellen CD45 und CD45 neg lo-Zellen. Titration wird für optimale Ergebnisse empfohlen.

  1. Gut mischen durch leichtes Schwenken der Röhre (Nicht Vortex Do) und Inkubation für 15 min bei 4 ° C
  2. Wasch ungebundene Mikrokügelchen durch Zugabe von 10 ml von MACS-Puffer und Zentrifuge für 10 min bei 300 × g bei 4 ° C. Absaugen des Überstandes.
  3. Resuspendieren bis 10 8 Zellen in 500 &mgr; l Puffer.
  4. Ggf. Filterzellsuspension unter Verwendung eines 70 &mgr; m-Zellsieb um Schmutz und Zellaggregaten, die die Strömung der Säule verstopfen können, zu entfernen.
  5. Verwenden Sie eine Spalte LS seit Thymus Zellsuspensionen besser fließen durch die LS-Säulen. Bereiten LS Spalte folgenden Anweisungen des Herstellers. Pipette Zellsuspension langsam in der Säule vermieden Erzeugen von Blasen. Verwenden Sie eine Spalte für alle 10 8 Zellen.
  6. Sammeln unmarkierten Zellen (Flow-Through-und Waschungen) mitdie CD45 lo / neg Zellfraktion und waschen Spalte folgenden Anweisungen des Herstellers.
  7. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren Zellpellet in sterile FACS-Puffer, um die Zellzahl zu bestimmen und zur Zellsortierung Färbung.

7. Flecken Zellen für Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

  1. Führen FcR Blockierung vor der Zellfärbung, um nicht-spezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Inkubieren Zellsuspension mit gepoolten Human-Immunglobuline Lösung für 15 min bei RT. Diese Reagenzien sind im Handel erhältlich (zB Gammunex 10% ige Lösung).
  2. Waschen der Zellen durch Zugabe von kaltem sterilen FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C.
  3. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in kaltem sterilen FACS-Puffer. Bereiten 5 Proben gemäß dem folgenden Beispiel:
    Probe Probentyp Antikörper Handy-Nummer Gesamtvolumen
    1. unbefleckt Kontrolle 1 x 10 6 50 ul
    2.scc *-Pacific Blue Kontrolle CD45-Pacific Blue 1 x 10 6 50 ul
    3. scc-APC Kontrolle CD3-APC 1 x 10 6 50 ul
    4.scc-Alexa 488 Kontrolle CD8-Alexa 488 1 x 10 6 50 ul
    5. Zellsortierung Analyten CD45-Pacific Blue
    EpCAM-APC
    CDR2-Alexa 488     		10 x 10 6 x - 50 x 10 6 500 ul
    10 × 10 6 Zellen/100 &mgr; l

    * Scc, Einzelfarbsteuerung

  4. Inkubieren Zellen mit Antikörpern für 30 min auf Eis im Dunkeln.
  5. Zweimaliges Waschen mit FACS-Puffer durch Zentrifugieren Zellen bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C.
  6. Einstellen der Zellkonzentration der Probe auf 1 × 10 7 Zellen / ml (oder der Konzentration der Zellsortiereinrichtung empfohlen) mit sterilen FACS Puffer für Zellsortierung (dh ohne NaN 3) sortiert werden.
  7. Pass Zellprobe durch eine 70 um Zell Sieb, um alle Zellklumpen, die das Durchflusszytometer während der Sortierung verstopfen können, zu entfernen.
  8. Resuspendieren Kontrollproben in 200-400 ul Puffer. Halten Röhrchen auf Eis und vor Licht geschützt.
  9. Bereiten Sammelröhrchen mit Medium.

Hinweise:

  • Führen Titration der Antikörper für eine optimale Färbung.
  • In einer Probe zum Sortieren, kann bis zu 50 x 10 6 Zellen in einem Gesamtreaktionsvolumen von gefärbten werden500 ul.
  • Färbungen der Probe in 5 ml Falcon Polystyrol-Rundbodenröhrchen sortiert werden. Die einzelnen Farbsteuerungen können in separaten Wells einer 96-Well-Platte gefärbt werden.
  • Seit TEC Teilmengen sind selten Populationen, ist es ratsam, einen weiteren positiven Marker (von Hochfrequenz) für jedes Fluorochrom verwenden, um die Bestimmung der richtigen FACS-Einstellungen zu erleichtern und um sicherzustellen, dass Sie eine angemessene Entschädigung, wenn die Wahl der Fluorochrome Ausgleich erfordert. Zellen aus der CD45 +-Fraktion mit Marker wie CD45, CD3 oder CD8 für die verschiedenen Fluorochromen gefärbt und nach Färbung ungefärbten CD45 +-Zellen zu der Probe gegeben werden.

8. Isolierung von TEC durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

(MTEC) oder EpCAM lo CDR2 + (cTEC) - TEC Teilmengen aus der CD45 lo / neg-Fraktion als EpCAM hallo CDR2 sortiert werden.

  1. Führen Sie das Beispiel with die ungefärbten Zellen und stellen Sie die Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht, um die Bevölkerung von Interesse in Waage legen. Einstellen der Spannung an jedem Detektor, so dass die Zellen sichtbar, aber in der weit linken Teil des Histogramms befinden.
  2. Führen Sie jede einzelne Probe und Bunt Entschädigung für jede Farbe ein.
  3. Nach dem Einstellen der Spannung und Ausgleich für die ungefärbten und gefärbten Einzelkontrollen führen Sie das Beispiel sortiert werden und die Verwendung Gating-Werkzeuge, um die Bevölkerung von Interesse zu definieren. Verwenden Sie eine breite vorn und Seitenstreuung Tor zur Einbeziehung aller Stromazellen Größen sorgen, während ohne Zelltrümmer.
  4. Auf den Punkt Grundstück mit CD45-Pacific Blue gegen Forward Scatter Tor auf den CD45 niedrig und CD45 neg Zellen.
  5. Wenden Sie dieses Tor zu einer EpCAM gegen CDR2 Punkt-Diagramm und bestimmen durch Gating die Bevölkerung, die sortiert werden.
  6. Nach Toren bestimmt worden sind, wählen Sie die Tore die Bevölkerung von Interesse enthält, und starten Sie die Sortierung.
  7. Die sortierten Zellen wurden gesammelt, Zentrifuge die Zellsuspension, und resuspendieren Zellen in Medium oder Puffer der Wahl je die vorgesehene Anwendung abwärts.

Anmerkung: Während des Sortiervorgangs, um die Zellen vom Kleben an den Seiten der Sammelröhre zu verhindern, kann das Rohr durch Befüllen mit 50% FCS in PBS vorbeschichtet und bei RT für 30 min inkubiert werden. Entsorgen Sie die Beschichtungslösung vor der Zugabe Sammlung Medien.

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Ergebnisse

Als Ausgangsmaterial in diesem Protokoll verwenden wir Thymusgewebe von Kindern unterziehen Korrektur kardiovaskulären Chirurgie (Abteilung für Thorax-und Kardiovaskuläre Chirurgie, Universitätsklinikum Tübingen) nach der Einwilligung und unter institutionellen Richtlinien erhalten entfernt. Dieses Material kann verworfen stark in der Größe von 2 bis 30 g oder mehr variieren. Die Anzahl von MDC und TEC Teilmengen (cTEC und mTEC), die erhalten werden, hängt von der Größe als auch vom Alter des Thymus Gewebeprobe zur Isol...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Modifikation des Protokolls durch Gotters et al 4 veröffentlicht. Kritischen Schritte in dem Protokoll sind der Zustand und die ursprüngliche Herstellung des Gewebes sowie der Percoll-Dichte-Trennung. Wir empfehlen dringend, das Gewebe so bald wie möglich nach der Entnahme zu verarbeiten. Es ist wichtig, schnell, aber gründlich zu arbeiten, wenn die Reinigung und das Schneiden des Gewebes. Während der in Schritt 2.3 beschrieben thymocyte waschen, ist es entsch...

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Offenlegungen

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Danksagungen

Wir sind dankbar, dass die Chirurgen der Klinik für Thorax-und Kardiovaskuläre Chirurgie, Universitätsklinik Tübingen für die Bereitstellung der Proben Thymus und Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) für die Bereitstellung der CDR2-Antikörper. Wir möchten auch an Hans-Jörg Bühring und Sabrina Grimm von der Sortieranlage (Universität Tübingen) danken. Diese Arbeit wurde durch den SFB 685 und der Hertie-Stiftung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien und Materialien
RPMI 1640PAAE15-842 
Dulbecco's PBSPAAH15-002 
Fötales Rinderserum-GoldPAAA15-151 
RinderserumalbuminPAAK41-001 
Kollagenase ARoche10 103 586 001 
DNase I, Grad II der Bauchspeicheldrüse bei RindernRoche10 104 159 001 
Trypsin-EDTA 10x in PBSPAAL11-001Lager conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling KitMolekulare SondenA-10235 
Anti-Human-CDR2 (gereinigt)Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Deutschlandmarkiert mit Alexa Fluor 488
Anti-Human-CD45 (Pacific Blue)Biolegend304022 
Anti-Human-EpCAM (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
Anti-Human-CD11c (PE)Miltenyi Biotec130-092-411 
Anti-PE-MikrokügelchenMiltenyi Biotec130-048-801 
Anti-CD45-Mikrokügelchen, menschlichMiltenyi Biotec130-045-801 
LS-SäulenMiltenyi Biotec130-042-401 
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237für Gewebedissoziator
Percoll (Dichte 1.130 g/ml)GE Healthcare, Life Sciences17-0891-01 
Steriles destilliertes Wasser (DNAse/RNAse frei)GIBCO10977-035&nbsp;
Gamunex 10%Tajecris-BiotherapeuticsG1200521:10 Vorverdünnung, verwenden Sie 20 & mu; l/1 x 106Zellen
0,22 μ m FilterMillex GSSLGS033SSSpritzenantrieb
Stericup FiltereinheitMilliporeSCGPU05REPumpenantrieb
50 ml PC Eichenkamm ZentrifugenröhrchenNalgene3118-005050 ml
50 ml PP konische RöhrchenBecton Dickinson352070 
12 mm x 75 mm 5 ml ReagenzgläserBecton Dickinson352058FACS Färbungen
Zellsieb 70 μ mBecton Dickinson352350 
INSTRUMENTS
Durchfluss-Zytometer-Sortierer (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson 
Sorvall Evolution R6 (Rotor)Kendro 
Rotator REAX 2Heidolph 
gentleMACS DissoziatorMiltenyi Biotec130-093 235Gewebedissoziator

Referenzen

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  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
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Schlagwörter

Zellisolationenzymatischer VerdauPercoll Dichtezentrifugationmagnetische Zellsortierungfluoreszenzaktivierte ZellsortierungNiedrigdichtefraktionZellanreicherung

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