Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Zusammenfassung

Drosophila ist berühmt für seine leistungsstarken genetischen Manipulation, aber nicht für die Eignung der eingehenden biochemischen Analyse. Hier präsentieren wir eine TAP-basierte Verfahren, um Interaktionspartner eines Proteins von Interesse aus dem Fliegenhirn zu identifizieren. Dieser Vorgang kann möglicherweise zu neue Wege der Forschung führen.

Zusammenfassung

Genetische Screens durchgeführt unter Verwendung von Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) haben zahlreiche Meilenstein Entdeckungen im Vorfeld der biologischen Wissenschaften gemacht. Jedoch wurde die Verwendung von biochemischen Screening auf die sich die Kenntnis der genetischen Analyse gewonnenen Ziel erst kürzlich entdeckt. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Proteinkomplex zu reinigen, der sich an jedem Protein von Interesse von erwachsenen Fliegenköpfe. Diese Methode nutzt die Drosophila GAL4/UAS System, um eine Köderprotein mit einem Tandem Affinity Purification (TAP)-Tag in fly Neuronen in vivo verschmolzen Ausdruck zu bringen, und dann implementiert zwei Runden der Reinigung mit einem TAP-Verfahren, ähnlich dem ursprünglich fest Hefe ^ein, um die Interaktion Protein-Komplex zu reinigen. Am Ende dieses Verfahrens wird ein Gemisch aus mehreren Protein-Komplexe erhalten wird, dessen Molekular Identitäten durch Massenspektrometrie bestimmt werden. Validierung der Kandidatenproteine ​​aus der r profitierenesource und einfache Durchführung loss-of-function-Studien in Fliegen. Ähnliche Ansätze können auf andere Flug Gewebe angewendet werden. Wir glauben, dass die Kombination von genetischen Manipulationen und proteomischen Ansatz dieser in der Flugmodellsystem birgt ein enormes Potenzial für die Bekämpfung der grundlegenden Probleme im Bereich der Neurobiologie und darüber hinaus.

Einleitung

Definieren der molekularen Signalwege und Netzwerke, die einen bestimmten biologischen Prozess zu vermitteln ist eines der obersten Ziele der biomedizinischen Forschung. Fly Genetiker haben massiv auf zukunfts Genetik abhängig, vor allem Modifikator genetischen Bildschirme (beide Enhancer und Suppressor-Screens), um Faktoren, die zusammenarbeiten, parallel, oder stromaufwärts oder stromabwärts eines Gens von Interesse zu identifizieren. , Vorwärts Genetik Bildschirme oft scheitern jedoch zu wesentlichen Gene zu identifizieren, die, wenn mutiert, verursachen Letalität in frühen Entwicklungsstadien, oder Gene mit funktionellen Redundanz und Entschädigung, deren Funktio....

Protokoll

1. Generieren UAS-TAP-markierten Transgene Fliegen

1. Generieren pUAST-TAP-markierten DNA-Konstrukte.
   1. Entscheiden Sie, welche Seite (N-oder C-Terminus) der Köder-Protein die TAP-Tag sollte die fusioniert werden sollen, aufgrund der Struktur / Funktion des Proteins. Siehe Diskussion für weitere Details.
   2. Subklonierung der cDNA-codierenden Region des Gens von Interesse in die multiple Klonierungsstellen (MCS) der pUAST NTAP-oder pUAST CTAP-Vektoren, um N-oder C-terminalen-markierten UAS-TAP-Transgene zu erzeugen sind. Siehe Abbildung 1 für detaillierte Karten und nutzbar Restriktionsstellen und Leserahmen.
2. ....

Ergebnisse

Hier zeigen wir unsere Anstrengungen bei der Identifizierung von Highwire-interagierenden Proteinen im Fliegenhirn. Highwire (Hiw) und seine Wirbeltieren und wirbellosen Homologen sind riesig Ubiquitin-Ligasen, die die Entwicklung und Reparatur des Nervensystems ¹⁴ zu regeln. Sie teilen sich eine Reihe von hoch konservierten funktionellen Domänen. Allerdings sind ihre molekularen Aktionen nicht ganz klar. Arbeiten im Schnecken getan, Fliegen und Maus führte zu der aktuellen Arbeitsmodell, dass Hiw Funktionen .......

Diskussion

Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Methode bietet eine Dual-Reinigungsprotokoll, das die Isolierung und Anreicherung von Proteinkomplexen durch zwei unabhängige Affinität Reinigungsschritte ermöglicht. Das Design des TAP-Tag nicht zu dem, was in diesem Protokoll Beispiel beschränkt, andere Proteinbindungsdomänen und Motive auch anwendbar, wenn Pufferbedingungen entsprechend angepasst. Ein gutes Beispiel für andere TAP-Tags ist die GS-TAP-Tag, eine Kombination aus einem G-Protein und einem Streptavidin-Bindungsmotiv, von G.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
U.S.A. Standard-Reagenzsieb Nr. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. Standard-Reagenzsieb Nr. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG Sepharosekügelchen	Pharmacia	17-0969-01
Econo-Säule 0,7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-Säule 0,5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin-Kügelchen	Stratagene	214303
Coors Mörser und Stößel	CoorsTek	60311
AcTEV-Protease	Invitrogen	12575-015
Protease-Inhibitor-Cocktail	Roche	11836153001
Protease-Inhibitor-Mix	Sigma	P8340