Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Summary

Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.

Abstract

Lipidtröpfchen dynamischen Organellen, die in den meisten eukaryotischen und prokaryotischen Zellen bestimmte gefunden werden können. Strukturell die Tröpfchen bestehen aus einem Kern aus neutralen Lipiden durch eine Phospholipid-Monolayer umgeben. Eine der nützlichsten Techniken zur Bestimmung der zellulären Funktionen von Tröpfchen wurde Proteom Identifizierung von gebundenen Proteinen, die zusammen mit den Tröpfchen, die isoliert werden können. Hier werden zwei Methoden beschrieben, um Lipidtröpfchen und ihre gebundenen Proteine ​​aus zwei weit reich Eukaryoten zu isolieren: Die Kernspaltung Hefe und menschlichen Plazenta villous Zellen. Obwohl beide Techniken haben Unterschiede, die wichtigste Methode - Dichtegradientenzentrifugation - wird von beiden Präparaten geteilt. Dies zeigt die breite Anwendbarkeit der vorgestellten Tröpfchenisolationstechniken.

Im ersten Protokoll werden in Hefezellen-Sphäroplasten durch enzymatischen Verdau der Zellwände umgewandelt. Die daraus resultierenden Spheroplasten werden dann gently lysiert in einem locker sitz Homogenisator. Ficoll ist mit dem Lysat zugegeben, um einen Dichtegradienten zu schaffen, und das Gemisch wird dreimal zentrifugiert. Nach dem ersten Durchlauf werden die Lipidtröpfchen auf die weiß gefärbte Schwimmschicht der Zentrifugenröhrchen zusammen mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER), der Plasmamembran und Vakuolen lokalisiert. Zwei aufeinanderfolgende Drehungen verwendet werden, um diese drei Organellen zu entfernen. Das Ergebnis ist eine Schicht, die nur Tröpfchen und die gebundenen Proteine ​​hat.

Im zweiten Protokoll werden plazentaren Zotten-Zellen aus menschlichen Plazenten Zeit durch enzymatischen Verdau mit Trypsin und DNase I. Die Zellen werden in einem locker sitzenden Homogenisator isoliert. Low-Speed-und mittelschnell Zentrifugationsschritte werden verwendet, um aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer, Zellkerne, Mitochondrien und zu entfernen. Sucrose wird zu dem Homogenat zugegeben, um einen Dichtegradienten liefern und die Mischung wird zentrifugiert, um die Lipidtröpfchen von der anderen zu trennen cellular Fraktionen.

Die Reinheit der Lipidtröpfchen in beiden Protokollen wird durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Tröpfchen Fraktionen aus beiden Preps sind geeignet für die anschließende Proteom-und der Lipid-Analyse.

Introduction

Cellular Lipidtröpfchen sind dynamische Organellen, die mehrere Funktionen in Zellen dienen. Sie sind lager Hubs für neutrale Lipide, die in Energie umgewandelt oder Phospholipid-Synthese verwendet werden können. Die Tropfen spielen eine zentrale Rolle in physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich Atherosklerose, Fettleibigkeit und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen, Infektionskrankheiten und auch ^1,2. Darüber hinaus sind sie faszinierende Quellen für die Biodiesel-Kraftstoffen.

Viele Informationen über die Rolle der zellulären Lipidtröpfchen wurde von Proteom-und der Lipid-Analyse von Tröpfchen aus weitreichenden Organismen gereinigt ³ erhalten. Diese Organismen sind Bakterien, ^4,5, Hefe ^6-11 enthalten, pflanzen ^12,13, Nematoden ^{14, 15,16} und fliegt. Angesichts des Interesses in der Rolle von Fetttröpfchen in der menschlichen Stoffwechselerkrankungen, haben auch Tröpfchen von kultivierten tierischen Zellen und eine isoliertenimal Gewebe. Kultivierte Zelllinien 3T3-L1 Adipozyten ^17, chinesische Hamster-Eierstock (CHO)-K2-Zellen ^18, die menschliche hepatocyes ^19,20 und epithelialen Zelllinien ²¹ enthalten. Tierische Gewebe, aus dem Tröpfchen isoliert wurden, Maus Skelettmuskel ^22, Leber ²³ und ²³ Milchdrüsen enthalten. Wie oben erwähnt, ist das Ziel der meisten Tröpfchen Isolationsstudien zur Proteom-Analyse der Faktoren gebunden und der Lipid-Analyse auf die neutrale Phospholipide und auszuführen.

Seit neutralen Lipiden - die zahlreichen Komponenten von Lipidtröpfchen - sind weniger dicht als die meisten anderen zellulären Materialien, Isolierung von Tröpfchen hat traditionell durchgeführt unter Verwendung von Dichtegradientenzentrifugation. Diese Technik ist das Herzstück der beiden Preps hier vorgestellt. Zurück Techniken ^6,24 kombiniert und in eine visuelle Darstellung der Isolierung von Tröpfchen aus kultivierten Zellen Spalthefe geändertnoncultured und menschliche Zellen aus Plazentagewebe erhalten. Ziel ist es, die breite Anwendbarkeit dieser Technik, indem Sie zwei sehr unterschiedliche Zelltypen als Ausgangspunkte für die Tröpfchen Isolation zu zeigen. Diese Technik sollte nützlich für diejenigen, die Tröpfchen von den meisten Organismen zu isolieren.

Protokoll 1 beschreibt die Isolierung von Lipidtröpfchen von der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, die als Modell für die Beobachtung der Tropfenbildung während der eukaryotischen Zellteilung ²⁵ verwendet wurde. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurde ausgiebig als Modellorganismus für das Studium der Biologie Fetttröpfchen verwendet. Protokoll 1 ist auf beiden Organismen und Unterschiede in den Zubereitungen sind hervorgehoben.

Protokoll 2 beschreibt die Isolierung von Lipidtröpfchen aus Plazentazellen Villi, die wiederum aus menschlichen Plazenten Ausdruck erhalten werden. DieSammlung von Zeit Plazenten bietet eine einzigartige Gelegenheit, um sicher und ethisch zu erhalten 200-250 g leicht verfügbar menschlichen Gewebe ^26, die eine erhebliche Anzahl von Lipidtröpfchen enthält. Dies steht im Gegensatz zu den meisten Lipidtröpfchen Isolierung Arbeit in höheren Eukaryonten, wo die Tropfen stammen aus kultivierten Zellen. In diesen Studien werden Fettsäuren häufig zu der Kultur zugegeben, um die Synthese von Neutrallipiden und somit das Wachstum der Tröpfchen zu fördern. Dies steht im Gegensatz zu der Arbeit hier wo Lipidtröpfchen unter nativen Bedingungen in Plazentagewebe gebildet.

Die Reinheiten der Lipidtröpfchen Fraktionen durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Organellen Marker-Antikörper bestimmt. Diese beiden Protokolle werden Lipidtröpfchen Fraktionen, die sich für nachfolgende Proteom-und der Lipid-Analyse sind zu erhalten.

Protocol

1. Trenn Lipid Droplets aus (Fission) Hefezellen

Isolation von Tröpfchen aus der beliebten Modellorganismus Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist fast identisch mit dem folgenden Protokoll ^6. Unterschiede in den Vorbereitungen zur Kenntnis genommen.

1. Wachsende Hefezellen

1. Bereiten Sie die Medien. Kombinieren Sie 36 g Pulver pro Liter YE5S dH ₂ O in Glasflaschen oder Kulturflaschen. Etwa 2 l Medien benötigt werden. Autoklavieren der Medien bei 121 ° C für 20 min. Ermöglichen, dass die Medien auf Raumtemperatur abkühlen. Für S. cerevisiae ersetzen YE5S mit YPD.
2. Platzieren 10-20 ml der gekühlten YE5S Medium in einem 250 ml-Kulturkolben unter Verwendung von sterilen Techniken. Inokulieren, die Medien mit einer kleinen Menge der Hefezellen von einer Agarplatte mit einem sterilen Holzstäbchen oder gleichwertig. Ließ die Zellen wachsen, um die gewünschte optische Dichte bei 30 ° C. Messung der optischen Dichte bei einerWellenlänge von 595 nm mit einem Spektralphotometer.
3. Die restlichen Medien in den 2,8-l-Flaschen. Verwenden Sie nicht mehr als 1 L Medium pro 2,8-l-Flasche auf richtige Mischung während des Zellwachstums im Schüttelinkubator gewährleisten. Die endgültige Ausbeute an nassen Zellen sollten etwa 10 g in der Lage sein, genügend Lipidtröpfchen für Proteomik und der Lipid-Analyse zu erwerben.
4. Einführung der Zellen aus Schritt 1.2 in den 2,8-l-Kolben mit jeweils 1 l Medium, das in Schritt 1.1 hergestellt wurden.
5. Wachsen die Zellen auf die gewünschte Dichte bei 30 ° C
6. Stellen Sie sicher, dass die Zellen Lipidtröpfchen. Reserve 1 ml der Zellen. Die optische Dichte (OD) der Probe. In 0,1 ml einer 100 mM Stamm von BODIPY 493/503 in Ethanol pro OD von Zellen auf die Probe. Platz 3 ul der Probe zwischen einem Objektträger und einem Deckglas. Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-Filter (Fig. 1A).
7. Pelletierung der Zellen aus Schritt 4 und 1,5 bei #176; C bei 3.800 × g für 10 min. Arbeiten chargenweise in Abhängigkeit von der Kapazität der Zentrifugenröhrchen.
8. Gießen Sie die YE5S Medien und waschen Sie die Zellen mit einem Puffer von EMM + 600 mM Sorbit. Sorbitol bietet osmotischen Unterstützung.
9. Übertragen der Zellen in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen pelletieren und die Zellen bei 4 ° C bei 2.000 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiegen Sie die Nasszellen. Resuspendieren der Zellen in 2 ml (EMM + 600 mM Sorbit) Puffer pro Gramm Zellen.

2. Konvertieren Spalthefe Zellen in Spheroplasten und anschließender Lyse

1. Jeweils 1 5 mg) Hefe lytischen Enzym und 2) Hefe-Lyse Enzyme aus Trichoderma harzianum pro Gramm Nasszellen, die in Schritt 1.9 gewogen wurden. Für S. cerevisiae ergänzen diese Enzyme mit der gleichen Menge von Zymolyase.
2. Inkubieren der Zellen bei 30 ° C unter leichtem bei 100 rpm für 60 min schütteln.
3. Stellen Sie sicher, dass die Spheroplasten haben Lipid droplets. Durch Wiederholen von Schritt 1.6 (Fig. 1B).

3. Dichtegradientenzentrifugation

1. Pellet die Sphäroplasten durch Zentrifugation bei 4 ° C bei 2.000 × g für 5 min.
2. Den Überstand mit einem Kunststoff-Transferpipette vorsichtig entfernen.
3. Vorsichtig resuspendieren pelletiert Spheroplasten mit eiskaltem 10 mM Tris-HCl, 600 mM Sorbitol und 200 uM EDTA. Beachten Sie, dass die Spheroplasten sind sehr zerbrechlich.
4. Pellet die Spheroplasten wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.1. Vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sphäroplasten mit einem Kunststofftransferpipette in 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA in einer Konzentration von 2 ml / g-Zellen.
5. Übertragen Sie die resuspendiert Spheroplasten zu einem Glas-Homogenisator homogenisieren und sanft auf dem Eis, 20-30 Schläge, mit der locker sitz Stößel der Glas-Homogenisator.
6. Übertragen Sie die lysiert Spheroplasten in Zentrifugenröhrchen überlagern und mit dem gleichen volumen von 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer. Wählen der Anzahl der Reaktionsgefäße auf, so daß jedes Rohr etwa zwei Drittel voll zu nutzen.
7. Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 × g für 1,5 Stunden in einem SW28 Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
8. Sie vorsichtig die oben schwimmenden weißen Schicht (2A), die die Tröpfchen enthält, Transfer in ein neues Zentrifugenröhrchen (n) entweder mit einem Pipette oder einer gebogenen Pasteur-Pipette. Add genug Volumen von 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer zu der Probe, so dass sie etwa ein Drittel des Zentrifugenrohrs ausfüllt.
9. Hinzufügen des äquivalenten Volumen von 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer, um der Oberseite der Probe (n) in der neuen Zentrifuge Röhre (n). Nach Zugabe dieses Puffers sollte die Rohre etwa zwei Drittel voll.
10. Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 g für 1 h in einem SW28-Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (rotor Verzögerung = 0).
11. Sanft übertragen Sie die oben schwimmenden weißen Schicht (2B), die die Tröpfchen enthalten wird, um ein neues Zentrifugenröhrchen (n) entweder mit einem Pipette oder einer gebogenen Pasteur-Pipette. Add 600 mM Sorbit, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer zu der Probe, so dass sie etwa ein Drittel des Zentrifugenrohrs ausfüllt.
12. Hinzufügen des äquivalenten Volumens von 250 mM Sorbit, 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer, um der Oberseite der Probe (n) in der neuen Zentrifuge Röhre (n). Nach Zugabe dieses Puffers sollte die Rohre etwa zwei Drittel voll.
13. Zentrifuge bei 4 º C bei 100.000 g für 1 h in einem SW28-Rotor oder gleichwertig. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
14. Übertragen oberen weißen Schicht (2C), die nur die Lipidtröpfchen und gebundene Proteine ​​enthalten sollte, in einen Dialyseschlauch und dialysiert O / N in 10 mM Tris-HCl und 200 &mgr; M EDTA-Puffer, um das Ficoll beseitigen.

2. Trenn Lipid Droplets von Menschenplazenta Villöse Cells

Plazenten wurden von gesunden Frauen mit Einlingsschwangerschaften elektiven Kaiserschnitt Lieferung vor dem Einsetzen der spontanen Arbeits am Termin gesammelt. Themen gab schriftliche informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer Plazenta. Die Sammlung und die anschließende Verwendung der Plazenta wurde mit Genehmigung von der University of Tennessee und der University of Tennessee Graduate School of Medicine in Knoxville Institutional Review Board (# 8757B und # 3338, respectively) durchgeführt.

1. Isolierung menschlicher Plazenta villous Zellen

Teil 1 des Protokolls ist eine Modifikation eines früher veröffentlichten Protokoll von Petroff et al. ²⁶

Bereiten Sie folgende Lösungen:

• NaCl (1 L): 9 g NaCl auflösen (M 58,4 g / mol) in dH ₂ O, um eine 1 L Lösung ergeben. Filter zu sterilisieren (0,2, Um Membran).
• 10x Hanks ausgewogener Salzlösung (10x HBSS) (1 l): 4 g KCl (M 74,5 g / mol), 0,6 g KH ₂ PO ₄ (M 136,086 g / mol), 80 g NaCl (M 58,44 g / mol); Na ₂ HPO ₄ (M 141,96 g / mol), 10 g D-Glucose (M 180,16 g / mol). Lösen Sie jedes der Bestandteile in dH ₂ O, um eine 1 L Lösung ergeben. Filter zu sterilisieren (0,2 um Membran).
• Enzym-Verdauungspuffer (0,6 ml): 70 ml kombinieren 10x HBSS mit 3,3 ml 7,5% Na Biscarbonats, 17,5 ml 1 M HEPES und 266,1 ml dH ₂ O; Filter zu sterilisieren (0,2 um Membran). Lagern bei 4 ° C
• DNase I: kurz vor Gebrauch 5 ml steriler 0,9% NaCl in ein Fläschchen von DNase. Halten bis zur Verwendung auf Eis oder bei -20 ° C

1. Vorbereiten Plazenta für die Präparation
   1. Besorgen Sie sich eine menschliche Plazenta und Verfahren möglichst nahe an dem Zeitpunkt der Lieferung wie möglich. Verwenden einen abgedichteten Behälter, wie einen Kühler, die Plazenta transportiert. Seien Sie immer vorsichtig, wenn die Handling menschlichen biologischen Materialien.
   2. In der biologischen Schutzhaube, übertragen Sie die Plazenta in einen sterilen Behälter autoklavierbar und vorsichtig waschen Blut aus der Plazenta und Membranen mit steriler 0,9% NaCl (Kochsalzlösung) Lösung. Entsorgen blutigen Kochsalzlösung in der 1-Liter-Becher als flüssige biologische Abfälle.
   3. Legen Sie die Plazenta auf einem sterilen Bereich, mit der glatten Seite mit der Nabelschnur nach oben ein. Mit scharfen, fein-Punkt-Schere und Pinzette entfernen Eihäute und Nabelschnur.
   4. Klappen Sie den Plazenta um, so dass der mütterliche Oberfläche (raue Oberfläche) nach oben zeigt. Entfernen Sie den darüber liegenden Grundplatte Gewebe, ca. 3 mm von der Oberfläche.
2. Lagen zur Plazenta
   1. Präparieren Sie ein Keimblatt in einer Zeit, die Vermeidung der Chorionplatte. Sammeln Zottengewebe in ein 250 ml Becherglas mit Kochsalzlösung.
   2. Gewebe mehrmals gründlich in einem getrennten Becherglas mit 0,9% NaCl durch Verwirbelung mit der Pinzette, mit Hilfe der 1 L-Becherglas für flüssige Abfälle.
   3. Ein Keimblatt übertragen zu einem Zeitpunkt auf eine 150 mm Petrischale. Halten Sie mit einer Pinzette und kratzen Gewebe mit Rasierklinge von Schiffen auf Petrischale. Zeigen abgekratzt Gewebe in separaten Becherglas mit 0,9% NaCl. Wiederholen Sie für alle Gewebestücke.
   4. Übertragen kleinen Teil des Gewebes in die Zelle Dissoziation Sieb und spülen mit 0,9% NaCl ausgiebig, bis das Eluat deutlich. Wiederholen aller Gewebe.
   5. Nach dem Spülen der abgekratzt Gewebe in der Zelle Dissoziation Sieb abtropfen lassen überschüssige Flüssigkeit und Gewicht.
      An diesem Punkt kann das Gewebe bei 4 º C in DMEM gespeichert O / N in einem sterilen Erlenmeyerkolben werden.
3. Enzymatische Verdauung der Plazentagewebe
   1. Bereiten Sie das Gewebe Verdauung Mischung: 100 ml vorgewärmten Enzymverdünnungspuffer, 1 ml DNase I und 20 ml 2,5% 10x Trypsin.
   2. Teilen Sie die Gewebe, die Übertragung von insgesamt 60 g gesammelten Gewebe (in der Regel etwa 250 bis 300 g) in einen 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben.
   3. In der Gewebeverdauungsmischung auf den Erlenmeyerkolben in das Gewebe enthält, und bei 37 ° C in einem Schüttler für 45 Minuten bei 150 Upm.
4. Das Sammeln der dissoziierten Zellen
   1. Nach der ersten 45 min Dissoziation, stellen Sie den Aufschlusskolben in einem Neigungs bis Gewebe absetzt.
   2. Die überstehende Flüssigkeit, dabei nicht zu undissoziierten Gewebe zu sammeln. In die gleiche Menge HBSS auf den Überstand gesammelt und übertragen in sterile 15 ml Zentrifugenröhrchen. Weitere Teile der undissoziierten Gewebe, wiederholen Vorgang ab Schritt 3.2 mit dem undissoziierten Gewebe.
   3. Zentrifugieren des Homogenats bei 4 ° C bei 1.000 × g für 15 min.
   4. Für jede Partie nach der Zentrifugation, saugen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Die Plazenta villous Zellen sind überwiegend im weißen Teil des Pellets, die über den roten Blutkörperchen.
   5. Übertragen Sie die Zotten-Zellen (weiße Teil des Pellets) zu einem sterile 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen und auf Eis zu halten.
   6. Nach dem Sammeln der Zellen, die aus allen drei Phasen der Verdauung, filtern die Suspension mit einer 100 &mgr; m Nylon-Zellfilter in der Spitze einer sterilen 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen eingeführt. Wenn die Filtration der Zellsuspension verlangsamt Heben nach oben auf den Filter, um ein Vakuum in der Röhre zu ziehen.
   7. Zentrifuge bei 4 ° C bei 1.000 × g für 10 min. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören.

2. Homogenisieren Plazentazellen villous

1. Bevor mit der Isolationsprozess vorzubereiten 50 ml hypotonische Lyse Medium (HLM), enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 1 mM EDTA. In Protease-Inhibitoren zu HLM kurz vor der Verwendung und halten das Medium auf Eis.
2. In der biologischen Schutzhaube, fügen Sie den 4-fachen Zellpellet Volumen eiskaltem HLM zu den Zellen. Sanft und gründlich resuspendieren Zellen durch Pipettieren der Zellen-up eind-down unter Verwendung einer 10 ml Pipette.
3. Inkubieren Sie die suspendierten Zellen auf Eis für 10 min.
4. Übertragen der Zellen an die Dounce-Homogenisator, der auf Eis sein sollte. Langsam homogenisieren die Zellen durch die Anwendung 20-25 sanfte Schläge mit der locker sitzenden Stößel des Homogenisators.
5. Zentrifuge das Zelllysat bei 4 ° C bei 3.000 × g für 10 min, um aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer und Zellkerne zu entfernen.
6. Sammeln Sie den Überstand und Transfer in ein SW28 Rohr (oder Alternative, die bei 25.000 g zentrifugiert werden kann). Zentrifuge bei 4 ° C bei 25.000 × g für 20 min, um die Mitochondrien zu entfernen.

3. Trennlipidtröpfchen durch Ultrazentrifugation

1. Vorbereitung 50 ml 100 mM Natriumcarbonat (M 106 g / mol)-Puffer (pH 11,5) und 50 ml 60% Sucrose (w / w) Lösung. In Protease-Inhibitoren auf die Natriumcarbonat-Puffer kurz vor Gebrauch und auf Eis zu halten.
2. Sammeln des Überstands aus Schritt 2.6 in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, justierenbis 20% Saccharose und Übertragung in den Boden ein Ultrazentrifugenröhrchen für einen SW28-Rotor, oder gleichwertig. Overlay Dichte angepasst Stand mit ~ 10 ml eiskaltem 100 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH-Wert 11,5) und 0,5 bis 1 ml eiskaltem HLM, um die Röhre zu füllen.
3. Zentrifuge bei 4 º C bei 130.000 · g für 45 min unter Verwendung SW28 Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
4. Sammeln der schwimmenden Schicht beträgt, auf 10% Saccharose und Übertragung in den Boden einer 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen für ein SW41Ti-Rotor, oder gleichwertig. Overlay Dichte angepasst Stand mit etwa 5 ml eiskaltem 100 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH-Wert 11,5) und 0,5 ml eiskaltem HLM.
5. Zentrifuge bei 4 º C bei 274.000 · g für 60 min unter Verwendung SW41Ti Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0) zu einer Störung der Lipidtropfenschicht zu minimieren.
6. Die obere Schwimmschicht (2D), die sorgfältig sammelnLipidtröpfchen mit einer 1 ml Pipette und wiederholen Sie Schritt 3.4.
7. Zentrifuge bei 4 º C bei 274.000 · g für 30 min unter Verwendung SW41Ti Ausschwingrotor. Lassen Rotor bis zum Stillstand (Rotor Verzögerung = 0).
8. Sorgfältig sammeln die obere weiß gefärbte Schicht, die schwimmende Lipidtröpfchen mit einem gebogenen Pasteur-Pipette in drei 1,5-ml-Röhrchen mit 100 ul HLM.

Charakterisierung von Lipidtröpfchen Fraktion (Protokolle 1 und 2)

Die Rückgewinnung und Reinheit der Lipidtröpfchen Fraktion kann durch Western-Blot in Kombination mit Licht-oder Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Darüber hinaus können nach verschiedenen Aliquots Zentrifugationsschritte gesammelt und zur Bestimmung Reinigungsleistung beibehalten werden. In Western Blot, ist es zweckmäßiger, ein Volumen der Lipidtröpfchen Fraktion, die ein Äquivalent des Ganzzelllysat stellt als Vergleich die Lipidtröpfchen zu anderen Membranfraktionen auf T vergleichener aufgrund der Gesamtproteingehalt ^24.

Results

Wenn die Dichte-Zentrifugation wie erwartet funktioniert, sollte das Schwimmschicht Lipidtröpfchen und anderer Organellen während der Verlauf der Hochgeschwindigkeits-Spins aufgebraucht werden.

Bei Protokoll 1 wurden Western Blots mit Marker-Antikörper gegen Lipidtröpfchen (Erg6p) und Organellen, die gefunden wurden, um mit Lipidtröpfchen in Hefe, ER (Dpm1p), Mitochondrien (Por1p) interagieren durchgeführt, Plasma-Membran (Pma1p) und Vakuolen (Vma1p).

Gleiche Vol...

Discussion

Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls

Sicherzustellen, dass während des Wachstums von kultivierten Zellen, die mit Medium und die Zelldichten werden. Cellular Lipidtröpfchen sind einzigartig, ihre assoziierten Proteine ​​sind stark abhängig von der Umgebung, in der die Zellen kultiviert werden, ^17. Daher sollten die Medien, in denen die Zellen gezüchtet und die Dichte der Zellen vor der Lyse eng überwacht werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protokoll 1
1. Züchtung von Hefezellen und Umwandlung in Sphäroplasten
Edinburgh Minimal Media (EMM)	Sunrise Science Products	2005
Hefeextrakt mit 5 Nahrungsergänzungsmitteln (YE5S)	Sunrise Science Products	2011	YE5S Medien mit 225 mg/ml jedes Nahrungsergänzungsmittels: Adeninie, Histidin, Leucin, Lysin, Uracil. Das Äquivalent für knospende Hefe wäre YPD.
YPD-Pulver	Sunrise Science Products	1875	Für S. cerevisiae
Sorbit	Fisher Scientific	BP439
Hefe Lytisches Enzym	MP Biomedicals	215352610
Lysing Enzyme aus Trichoderma harzianum	Sigma-Aldrich	L1412
Zymolayse-20T	Sunrise Science Products	N0766391	Für S. cerevisiae
BODIPY 493/503	Invitrogen	D-3922
Objektträger	Fisher Scientific	12-544-7
Mikroskopabdeckung	Glas Fisher Scientific	12-542-B
Transferpipette aus Kunststoff	Fisher Scientific	137115AM
1 L Glasflasche
250 ml Kolben
2,8 L Kolben
2. Isolierung von Hefelipidtröpfchen
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153
EDTA	Fisher Scientific	BP120
Ficoll 400	Fisher Scientific	BP525
12-14k Spectra/Por Dialysemembran	SpectrumLabs	132680
EDTA-freie Proteasehemmer Cocktail-Tabletten	Roche Diagnostics	11873580001	reizender
Dounce Homogenisator	Sigma-Aldrich	D9938
Ultrazentrifugenröhrchen 25 mm x 89 mm (für SW28)	Beckman-Coulter	355642
12-14k Spectra/Por Dialysemembran	SpectrumLabs	132680
Temperierter Schüttler	New Brunswick Scientific	C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR Zentrifuge	Thermo-Scientific	75004521
Schwingschaufel Zentrifuge Rotor	Thermo-Scientific	75003607
Fiberlite* F15-6x100y Festwinkelrotor	Thermo-Scientific	75003698
Ultrazentrifuge LB-M	Beckman-Coulter
SW28 Ultrazentrifuge	Rotor Beckman-Coulter	342204
Protokoll 2
1. Isolierung von Plazenta-Zottenzellen
Einweg-Unterlagen	Fisher Scientific	23666062
Autoklavierbare Pfanne (Behälter), 3 L	Fisher Scientific	1336110
Feine Schere, scharf-scharf, gerade	Fine Science Tools	1406011
London Forceps	Fine Science Tools	1108002
Dumont #7b Pinzette	Fine Science Werkzeuge	1127020
Rasierklingen	Fisher Scientific	S65921
Siebbecher für CD-1	Fisher Scientific	S1145
40 Maschensieb	Fisher Scientific	S0770
Fisherbrand Zellfärbegeräte 100 μ m	Fisher	Scientific 22363549
150 mm Petrischalen	Fisher Scientific	NC9054771
NaCl	Fisher	Scientific S642
KCl	Fisher Scientific	P333
KH2PO4	Fisher Scientific	P386
Na2HPO 4	Fisher	Scientific S374
D-Glucose	Fisher Scientific	D16
HEPES	Fisher Scientific	BP310
2,5 % Trypsin 10x	Invitrogen	15090046
DNase I Grad II, aus der Bauchspeicheldrüse von Rindern	Roche Applied Science	10104159001
Natriumbicarbonatlösung	Sigma-Aldrich	S8761
500 ml Erlenmeyerkolben
250 ml Becher
15 ml Zentrifugenröhrchen
10 ml Serologische Pipetten
50 ml Zentrifugenröhrchen
DMEM	Invitrogen	11965084
2. Isolierung von Lipidtröpfchen aus zottenartigen Plazentazellen
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153
EDTA	Fisher Scientific	BP120
D-Saccharose	Fisher Scientific	BP220
Natriumcarbonat	Fisher Scientific	BP357
EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtabletten	Roche Diagnostics	11873580001	reizend
Dounce Homogenisator	Sigma-Aldrich	D9938
Ultrazentrifugenröhrchen 25 mm x 89 mm (für SW28)	Beckman-Coulter	355642
Ultra-Clear Zentrifugenröhrchen 14 mm x 89 mm (für SW41)	Beckman-Coulter	344059
Einweg-Pasteurpipetten aus Borosilikatglas	Fisher Scientific	1367820C
Biologische Sicherheitshaube	Thermo-Scientific
Wasserbad	Fisher Scientific
Schüttler mit Temperaturregelung	New Brunswick Scientific	C25KC
Thermo Sorvall Legend XTR Zentrifuge	Thermo-Scientific	75004521
Schwingschaufel Zentrifuge Rotor	Thermo-Scientific	75003607
Ultrazentrifuge LB-M	Beckman-Coulter
SW28 Ultrazentrifuge Rotor	Beckman-Coulter	342204
SW41 Ti Ultrazentrifuge	Rotor Beckman-Coulter	331336
Western Blot
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG	LI-COR	926-68071	Verdünnung 1:15.000
IRDye 800CW Ziege Anti-Maus IgG	LI-COR	926-32210	Verdünnung 1:5.000
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gele	Invitrogen	NP0341
Primärantikörper für Protocol 1
Erg6p	Geschenk von Dr. G. Daum	Technische Universität Graz, Österreich	Verdünnung 1:5.000
Dpm1p	Abcam	ab113686	4 μ g/ml
Por1p	Geschenk von Dr. G. Daum	Technische Universität Graz, Österreich	Verdünnung 1:5.000
Pma1p	Geschenk von Dr. G. Daum	Technische Universität Graz, Österreich	Verdünnung 1:10.000
Vma1p (anti-ATP6V1A)	Abcam	ab113745	0,5 μ g/ml
Primäre Antikörper für Protocol 2
Perilipin 2 (anti-ADFP)	Abcam	ab52355	2 μ g/ml
Calnexin	Cell Signaling Technology	2679	Verdünnung 1:1.000
GM130	Biorbyt	orb40533	Verdünnung 1:25
COX IV	Cell Signaling Technology	4850	Verdünnung 1:1.000
MEK1	Biorbyt	orb38775	Verdünnung 1:50