Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.
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Methodenartikel
Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Lipide und Proteine in eukaryotischen Zellen kontinuierlich zwischen Zellkompartimenten ausgetauscht, obwohl diese trotz der intensiven interorganelle Molekularverkehr behalten ihre unverwechselbare Zusammensetzung und Funktionen. Die in diesem Beitrag beschriebenen Techniken sind mächtige Mittel des Studiums Protein-und Lipid Mobilität und Menschenhandel in vivo und in ihrer physiologischen Umgebung. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzverlust in Photobleaching (FLIP) werden häufig für die Untersuchung intrazellulären Transport durch die exo-endocytischen, die Kontinuität zwischen den Organellen oder Unterkammern, die Bildung von Proteinkomplexen und Protein-Lokalisierung verwendet Live-Cell-Imaging-Techniken Lipidmikrodomänen, die alle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beachten. Die Grenzen dieser Ansätze sind hauptsächlich auf die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine und ihre möglichen Nachteile umfassen artifactual überexprimierenIonen in Zellen und die Möglichkeit, Unterschiede in der Faltung und Lokalisierung von markierten und nativen Proteinen. Schließlich, als die Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie (etwa 200 nm) keine Untersuchung der Feinstruktur des ER oder den spezifischen Unterkammern, die in Zellen unter Stress entstehen kann damit (dh Hypoxie, Medikamentengabe, die Überexpression von Transmembran basierend auf Transmissions-Elektronenmikroskopie ER ansässig Proteine) oder unter pathologischen Bedingungen, kombinieren wir Live-Cell-Imaging von kultivierten transfizierten Zellen mit ultrastrukturelle Analysen.
Einleitung
Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Spektralbereich und die parallele Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie wurden völlig neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Protein-Verhalten in den Zellen geöffnet. Techniken wie Fluoreszenz-Erholung nach Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzverlust Photobleaching (FLIP), die aufgrund der Eigenkapazität der Fluorophore ihrer Fluoreszenz unter intensiver Beleuchtung erlischt möglich sind, werden auf der konfokalen Abbildung lebender Zellen basiert und die Verwendung von transfizierten Fluoreszenz-Fusionsproteine 1-3. Sie sind weit verbreitet, nicht nur die Lokalisierung von Proteinen, sondern auch ihre Mobilität und vesikulären Transport, die wichtige Hinweise über ihre Funktion 4 offenbaren kann beurteilen.
Das einzigartige Merkmal von eukaryontischen Zellen ist die Anwesenheit von intrazellulären Kompartimenten, die spezifische Lipid-und Proteinzusammensetzungen. Obwohl Organellen sind körperlich Isolated, müssen sie miteinander kommunizieren und molekularen Komponenten, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Die sekretorischen Weg garantiert, dass die Proteine und Lipide im ER synthetisiert erreichen den richtigen Bestimmungsort in dem sie ihre Funktion ausüben. Intrazellulären Organellen kann auch durch dynamische Kontaktstellen, die Moleküle (Lipide), direkt zwischen den Abteilungen ausgetauscht werden können angeschlossen werden. Darüber hinaus haben viele Proteine in großen heteromeren Komplexen zusammengesetzt oder mit bestimmten Lipidspezies (Lipid Rafts / Mikrodomänen), um sich funktionell aktiv oder an ihren Bestimmungsort transportiert werden verbunden. Alle diese biologischen Aspekte stark beeinflussen die kinetischen Eigenschaften der Proteine, und kann daher in geeigneter Weise mittels der unten beschriebenen Methoden untersucht werden.
Unsere Gruppe hat sehr stark genutzt FRAP und FLIP mit Elektronenmikroskopie kombiniert, um die Architektur des ER und ihrer verschiedenen studierenDomänen. Das ER ist die erste Station des sekretorischen Weg und spielt eine Schlüsselrolle in der Protein-und Lipidsortierung 5. Es ist eine sehr dynamische Organellen, deren unterschiedliche Teilbereiche spiegeln die viele verschiedene Funktionen (zB Protein-und Lipid Biosynthese und Menschenhandel, Proteinfaltung, Ca 2 +-Speicher-und Freigabe und Fremdstoffmetabolismus). Obwohl sie morphologisch räumlich und funktionell verschieden sind diese Bereiche kontinuierlich zueinander und ihre relative Häufigkeit in Zellen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen modifiziert werden. Die bekannteste und meist räumlich getrennter Domänen des ER sind die Kernhülle und die glatten und rauen ER, allerdings haben wir und andere gezeigt, dass es ER Strukturen mit aufwendiger Architektur und dreidimensionale Organisation in verschiedenen Zelltypen und Geweben unter physiologischen Bedingungen, die auch durch Stressreize wie Hypoxie, Drogen induziert werden kannVerwaltung, oder die Überexpression von ER-residenten Transmembranproteine 2,6 (und darin).
Wir haben vor kurzem auch die Anwesenheit solcher Strukturen in Zellmodellen menschlicher Krankheiten 1,7 nachgewiesen. Hervorgegangen aus dem gestapelten Zisternen des glatten ER, sie den gemeinsamen Namen der organisierten glatten endoplasmatischen Retikulum (OSER) im Jahr 2003 6 angegeben wurden, obwohl sie auch als karmellae, Lamellen und kristalloiden ER auf der Grundlage ihrer Architektur bekannt, die, wie ihre Größe kann variieren. Nachdem die Zellen mit GFP zu cytosolischen Schwanz-Bereich verankert (TA) ER fremde Proteine (d EGFP-ER), die schwach Dimerisierung Tendenz von GFP in trans dramatisch verändert die Organisation und Struktur der ER fusioniert transfiziert. FRAP und FLIP-Experimente zeigten, dass d EGFP-ER ist kostenlos innerhalb Osers diffundieren, und die Tatsache, dass es von der retikulären ER bewegt sich nach OSER und umgekehrt </ Em> zeigt an, dass die Aggregate sind kontinuierlich mit der umgebenden retikulären ER. Ultrastrukturelle Analyse hat uns erlaubt, die Fluoreszenzdaten mit einer detaillierten Beschreibung der OSER Architektur und Organisation auf Nanoebene korrelieren: Osers werden immer von Stapeln von gepaarten Zisternen des glatten ER gemacht, sondern kann verschiedene Formen der räumlichen Organisation, wie regelmäßig angeordneten Sinus haben Arrays oder Quirlen oder sechseckigen "kristalloiden" Rohr Arrays. Diese Umlagerungen führen zu kubischen Morphologien 8, die, wie sie in Zellen unter physiologischen Bedingungen 9 und folgenden Belastungen wie Hypoxie 10. Arzneimittelbehandlung 11, 9 und Krebs gefunden worden, erhebliche Potential als ultra Marker aufweisen kann.
Nach dieser ersten Demonstration mit GFP-Fusionsproteine verwendeten wir Abbildungsexperimente, die Proliferation von ER-Domänen analysiert als Reaktion auf pharmakologische Behandlungen 12, assess der Neigung von fluoreszierenden Proteinen in Zellen 13 oligomerisieren, und die Rolle eines mutierten ALS-verknüpften TA Protein an der Bildung von intrazellulären Aggregaten von ER Herkunft, die relevant für seine Pathogenität 1,8 sein kann, zu untersuchen. Es wurde vorgeschlagen, daß die Bildung von intrazellulären Aggregaten (die in vielen neurodegenerativen Krankheiten 14 auftritt) kann eine Schutzmechanismus, der die Wechselwirkungen zwischen toxischen mutierten Proteinen und den umgebenden Zellkomponenten 15 zu verhindern.
Was folgt, ist eine Beschreibung einer Kombination optischer und Elektronenmikroskopie Verfahren zur Untersuchung Konstrukte, deren C-terminale hydrophobe Domäne in der Membran des ER eingeführt, und eine Analyse ihrer dynamischen Verhalten und die Wirkungen der Überexpression von ER-Domäne Architektur in kultivierten Zellen (siehe Abbildung 1 ein Ablaufdiagramm des experimentellen Protokolls).
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Protokoll
1. Plasmid, Zellkultur und Transfektion mit ER Fluoreszierende Proteine
- Das in dieser Studie verwendete Plasmid besteht aus einer verbesserten Version des GFP am C-Terminus mit dem Heckbereich des ER-Isoform von Ratten-Cytochrom b fusioniert (5) über eine Linkersequenz (als B (5), hier abgekürzt). Der Heckbereich die gesamte Sequenz (Pro94-Asp134), die Membran nach der Trypsin-Spaltung der nativen b (5), einschließlich der 17-Rückstand TMD (Transmembran-Domäne), von vor-und nachgelagerten Polar Sequenzen flankiert (USV und DPS) zugeordnet bleibt, enthält . Der Linker besteht aus dem myc-Epitop, gefolgt von [(Gly) 4 Ser] 3, und die gesamte cDNA wird in die Hind3-Xba1-Stellen des Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3. Die Einzelheiten der Konstruktion dieses Plasmids wurden in einer früheren Veröffentlichung, in der sie als GFP-ER 16 bezeichnet wird beschrieben.
- Wachsen COS-7-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% Feta ergänztl Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin in einem Inkubator bei 37 ° C und 10% CO 2.
- Transfektion. Platte 3 x 10 5 Zellen auf einer runden Deckglas in einer 6-Well-Platte, und am folgenden Tag, Transfektion mit dem jetPEI System, wie vom Hersteller beschrieben. Beachten Sie, dass die optimale jetPEI / DNA-Verhältnis hat, um die maximale Effizienz der Transfektion in Abhängigkeit von der Plasmid-und Zelllinie zu etablieren getestet: in unserem Fall ein jetPEI: DNA-Verhältnis von 2:1 führt zu einer 70-80% Transfektionseffizienz.
2. Live-Fluoreszenzmikroskop-Mikroskopie
- Live-Cell-Imaging. Das Deckglas gelegt, auf dem die transfizierten Zellen wurden in einer Zellkulturkammer Stahl 24 mm Deckgläsern mit DMEM gefüllt w / o Phenolrot, mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin, 25 mM HEPES ausgesät , 50 ug / ml Cycloheximid und 1:100 OxyFluor, um die Proben von Photobleichung zu verhindern. Ein SP5 konfokalen mikroskopische mit einem temperaturgesteuerten CO 2-Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) ausgestattet ist zum lebenden Zellen Experimente verwendet, mit d-GFP-ER unter Verwendung eines 488-nm-Laser und einen 525/50 Bandpass-Emissionsfilter visualisiert.
- Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Ziehung einer Region von Interesse (ROI), entsprechend einer OSER Struktur und entfärben mit 20 Iterationen und eine Kombination von 488 nm (100% eines 30 mW Argonlaser, entsprechend 5,5-6 &mgr; W in der Probe) und 405 nm (60% der 30 mW Laserdiode 405, das entspricht 11,6 uW bei der Probe)-Laser, die in unserer Erfahrung, führt zu einer effizienten und schnellen Photobleaching.
- Notieren Sie sich die Erholung der Fluoreszenz in den gebleichten ROIs, indem sie einen einzelnen Frame alle 10 s für 10 min (Pixelzeit = 1,61 Mikrosekunden / Pixel).
- Fluoreszenzverlust in Photobleaching (FLIP). Ziehung einer ROI entsprechend einem OSER Struktur und Bleichmittel, wie oben beschrieben. Das Bleichen wird alle 30 Sekunden wiederholt,und Post-Bleich Bilder werden alle 10 Sekunden für 30 min (Pixelzeit = 1,61 Mikrosekunden / Pixel) aufgezeichnet.
- FRAP und FLIP-Analyse. Alle Bilder sind mit ImageJ Software (analysiert http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). In den FRAP Experimenten wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz des gebleichten ROI über die Zeit und normiert auf die Gesamtfluoreszenz der gebleichten Zell, das immer aktiviert ist über die Zeit konstant ist, gemessen.
- Für die FLIP-Experimenten ziehen eine ROI außerhalb des gebleichten OSER und für die gesamte Zelle. Messung ihrer Fluoreszenzintensität über die Zeit zu normalisieren und die Fluoreszenzniveaus eines ROI auf einem ungebleichten Zell um für jede Abnahme der Fluoreszenz von der Abbildungs selbst zu korrigieren gezogen.
- In allen Experimenten, subtrahiert das Hintergrundsignal (in einem Bereich außerhalb der Zellen bestimmt) von den Fluoreszenzintensitäten der ROIs. Schließlich zeichnen die Ergebnisse mit GraphPad Prism Software.
3. Ultrastrukturelle Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie
Angesichts der Toxizität vieler der Reagenzien sollten alle den Verfahren trägt einen geeigneten Labor durchgeführt werden. Mantel und Handschuhe unter einer Abzugshaube.
- Nach dem Entfernen des Deckglases aus der Petrischale, fixieren die restlichen Zellen am Boden der Schale als eine Monoschicht mit gefilterter 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 10 Minuten bei Raumtemperatur gezüchtet.
- Kratzen Sie die Zellen mit einer Teflon Schaber und übertragen sie in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 9000 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie frisches Fixiermittel, und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C
- Waschen der Pellets mit Puffer, dann post-fix mit einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in Cacodylat-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie mit MilliQ Wasser und en bloc Fleck mit1% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 20-60 min.
- Entwässern der Proben in steigenden Ethanolreihe (70%, 80%, 90%, 100% und 100% für jeweils 10 Minuten) und kurz waschen zweimal in Propylenoxid (jeweils 15 min).
- Infiltrieren der Proben in einem Gemisch aus Propylenoxid + Epon (1:1) (2 h bis über Nacht).
- In Epon Epoxidharz bei 60 ° C für mindestens 24 Stunden gehärtet einzubetten.
- § die manuell getrimmt Harzblöcke mit Hilfe eines Ultramikrotoms LEICA UC6 mit einem 45 °-Diamantmesser ausgestattet, um Abschnitte mit einer Dicke von 60-70 nm zu erhalten. Sammeln Sie die Abschnitte über 300 mesh Kupfernetze.
- Färben Sie die Abschnitte in der Startaufstellung mit einer gesättigten Lösung von Uranylacetat (20 min) und Blei-Citrat (7 min) gründlich waschen, in die Netze von bi-destilliertem gefiltertes Wasser eingetaucht werden, und es ihnen ermöglichen, bei Raumtemperatur trocknen.
- Die gefärbten Gitter G2 TECNAI mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet, und die Bilder werden unter Verwendung eines erfassten Bottom-CCD-Kamera montiert in verschiedenen Vergrößerungen letzten (in der Regel zwischen 6,000-39,000 X).
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Ergebnisse
Figur 2 zeigt ein Beispiel FRAP Untersuchung von Protein-Mobilität. Die Mobilität von d EGFP-ER-Protein wird durch die schnelle Erholung nach Fluoreszenzphotobleaching in gebleicht Osers demonstriert. Für die quantitative Analyse wurden die Halbzeit-und Mobil Fraktion aus experimentell gemessenen Daten durch Einsetzen der folgenden monoexponentiellen Gleichung abgeleitet:
F (t) = F post + (F-F rec post) (1-e-t / τ)
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Diskussion
Die in diesem Dokument beschriebenen Protokolle und bildgebenden Verfahren sind verwendet worden, um die Verteilung und Mobilität von transfizierten TA fluoreszierende Proteine im ER lebender Zellen resident untersuchen. Wir haben auch untersucht die Wirkung der Überexpression dieser Proteine auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment durch ultrastrukturelle Analyse.
Die Kombination aus Live-Zell-konfokale Bildgebung und Elektronenmikroskopie stellt ein sehr leistungsfähiges M...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren sind dankbar, Fondazione Filarete für seine Hilfe und Unterstützung bei der Veröffentlichung dieses Artikels. Wir würden auch gerne Centro Europeo di Nanomedicina für die Nutzung der TECNAI G2 Transmissionselektronenmikroskop danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamin 200 mM Lösung | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfektion | PP10110 | |
| OxyFluoroxyrase | Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyd Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Natriumcacodylat-Trihydrat | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmiumtetroxid 4%ige Lösung | Elektronenmikroskopie | Science 19150 | |
| Uranylacetat-Dihydrat | Sigma Aldrich | 73943 | leicht radioaktives |
| Propylenoxid | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON Einbettmedium-Kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Bleicitrat | Elektronenmikroskopie Science | 17800 | |
| Tischzentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Konfokales Spektralmikroskop | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Mikroskop-Käfig-Inkubationssystem | OkoLab | ||
| Ultramikrotom | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamantmesser | Diatomee | Ultra 45 ° | |
| Transmissionselektronenmikroskop | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Stahlkulturzellkammer für 24 mm Deckglas | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Elektronenmikroskopiegitter | Elektronenmikroskopie Science | G300Cu |
Referenzen
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