Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie In-vitro-

Zusammenfassung

Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Subventrikularzone (SVZ) in der Seitenwand der lateralen Ventrikel befindet spielt eine fundamentale Rolle in der adulten Neurogenese. In diesem geschützten Bereich des Gehirns, der neuralen Stammzellen vermehren und ständig zu erzeugen Neuroblasten, die tangential in Ketten entlang der rostralen Migrationsstrom (RMS) zu migrieren, um den olfaktorischen Bulbus (OB) zu erreichen. Einmal in der OB, Neuroblasten zu wechseln, um die radiale Migration und dann in ausgereiften Nervenzellen in der Lage, in die bereits bestehende neuronale Netzwerk integrieren zu unterscheiden. Proper Neuroblast Migration ist ein grundlegender Schritt in der Neurogenese, der die korrekte funktionelle Reifung von neugeborenen Neuronen. Angesichts der Fähigkeit der SVZ-derived Neuroblasten, verletzte Bereiche im Gehirn Ziel, die Untersuchung der intrazellulären Mechanismen zugrunde liegen ihre Beweglichkeit verbessern nicht nur das Verständnis der Neurogenese, sondern kann auch die Entwicklung von neuroregenerativen Strategien zu fördern.

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertesProtokoll für die Transfektion von primären Nagetier RMS postnatalen Neuroblasten und der Analyse ihrer Motilität mit Hilfe eines 3D-Migrationsassay in vitro rekapituliert ihre Art der Migration in vivo beobachtet. Beide Ratte und Maus Neuroblasten können schnell und effizient transfiziert über Nukleofektion entweder mit Plasmid-DNA, kleine Haarnadel (sh) RNA oder short interfering (si) RNA-Oligos gezielt Gene von Interesse sein. Um die Migration zu analysieren, werden nucleofected Zellen in "hängenden Tropfen" neu zusammengefügt und anschließend in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet. Nucleofection per se nicht die Migration der Neuroblasten nicht wesentlich beeinträchtigen. Pharmakologische Behandlung von nucleofected und neu zusammengefügt Neuroblasten kann auch durchgeführt werden, um die Rolle von Signalwegen in Neuroblast Migration beteiligt studieren.

Einleitung

Im postnatalen Gehirn von Säugetieren, Neubildung von Nervenzellen (Neurogenese) über die gesamte Lebensdauer und ist mit zwei neurogenen Nischen beschränkt: die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus ^1. Mehrere neuere Studien haben die wichtige Rolle der adulten Neurogenese bei der Erleichterung der Lern-und Gedächtnisaufgaben ^2,3 gezeigt. Darüber hinaus Nachweis der Proliferation und Rekrutierung von neuralen Vorläuferzellen nach Hirnverletzung ^7.4 erhöht die Möglichkeit der pharmakologischen Aktivierung der Neurogenese im neuronalen Reparatur.

Postnatale Neurogenese ist streng in all seinen Phasen, die neuralen Vorläufer Proliferation, Migration, Differenzierung, Überleben und letzte synaptischen Integration neu geboren Neuronen ⁸ sind geregelt. Neuronale Vorläuferzellen (Neuroblasten) aus Stammzellen in der SVZ abgeleitet wandern über eine große Strecke durch den rostralen MigrationsStrom (RMS) in Richtung der Riechkolben (OB), wo sie in funktionelle Neuronen ⁹ reifen. Wandernden Neuroblasten sind überwiegend unipolar, mit einem länglichen Zellkörper, der sich eine einzige führende Prozess. Diese Zellen bewegen sich in Ketten auf kollektive Weise, übereinander zu gleiten ^10. Migration ist ein entscheidender Schritt für die anschließende Reifung SVZ abgeleiteten Vorläuferzellen zu funktionellen Neuronen ¹¹ und wird von mehreren Faktoren und Führung Moleküle einschließlich gesteuert: polysialyliert neurale Zelladhäsionsmolekül (PSA-NCAM) ^12. Ephrine ^13, Integrine ^14, Schlitze ^15, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter ^{16 17,} jedoch sind die molekularen Mechanismen, die diesem Verfahren unterliegen nicht vollständig verstanden. Untersuchung der intrazelluläre Signalwege regulieren Neuroblast Migration wird nicht nur ein besseres Verständnis der adulten Neurogenese, sondern auch für die Entwicklung von neuen therapeutischen beitragenAnsätze zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll, um die Rolle des Kandidaten Regulatoren der Neuroblast Migration in vitro Studie mit Nukleofektion und eine 3D-Migration-Assay. Nukleofektion eine Zelle Transfektion Technik, die auf ein verbessertes Verfahren zur Elektroporation. Zelltyp-spezifische elektrische Strom und Nukleofektion Lösung ermöglicht die Übertragung von polyanionischen Makromoleküle, wie DNA und shRNA Vektoren und siRNA Oligonukleotide direkt in den Zellkern und erlauben Transfektion langsam teil oder mitotisch inaktiven Zellen, wie embryonalen Säugetierneuronen und ^18. Diese Methode ist schnell, relativ einfach durchzuführen und die Ergebnisse in hohem Maße reproduzierbar Transfektion von einem breiten Spektrum von Zelltypen, einschließlich der primären Neuroblasten und Neuronen ^19-21.

Die Dissoziation von RMS Gewebe ermöglicht die Isolierung der wandernden Neuroblasten, die erfolgreich mit DNA / SHR nucleofected werden könnenNA Vektoren oder siRNA Oligos gezielt Gene von Interesse. Nach Nukleofektion, Neuroblasten werden in hängenden Tropfen neu zusammengefügt und anschließend in einem dreidimensionalen Matrigel-Matrix eingebettet sind. Diese Bedingungen ermöglichen Neuroblasten aus der Zellaggregate rekapituliert die in vivo beobachtete Migrationsmodus zu migrieren, wodurch ein ausgezeichnetes Modellsystem für die Signalwege in Neuroblastenmigration beteiligt zu untersuchen und um den Einfluss von pharmakologischen Behandlungen auf die Motilität der Zellen beurteilen.

Protokoll

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen.

1. Dissection und Dissoziation von Ratte RMS Neuroblasten

1. Bereiten Sie die für RMS-Dissektion und Dissoziation erforderlichen Lösungen:

Dissektion Medium (100 ml)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) - 98,5 ml
5 M HEPES pH-Wert von 7,4 bis 0,5 ml
Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten / ml bis 10.000 &mgr; g / ml) - 1 ml

Dissoziation Medium (2 ml)
HBSS - 1.760 ml
10x Trypsin (2,5%) - 200 ul
DNAse1 (1 mg / ml) - 40 &mgr; l

Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötales Kälberserum (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml

Komplett-Medium (12 ml)

Neurobasalmedium - 11.46 ml
B27 Supplement - 250 ul
L-Glutamin (200 mM) - 125 ul
Glucose (45%) - 165 ul

2. Filter-Sterilisieren der DMEM + 10% FCS und die Komplettmedium und preequilibrate sie in einem 37 ° C / 5% CO _2-Inkubator.

1. Präparation
   1. Opfere eine P6-P7 Ratte Wurf (etwa 12 Jungtiere) durch Genickbruch und enthaupten mit einer Schere.
   2. Machen Sie eine ap-Schnitt in der Haut entlang der Mittelpfeilnaht von der Nase des Kleinhirns mit einer Skalpellklinge. Ziehen Sie die Haut ab und wiederholen Sie den gleichen Schnitt entlang der Schädel.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die Schädelklappen mit Zange und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn mit einem Spatel, kümmert sich um die Riechkolben enthalten.
   4. Schneiden Sie die meisten Schwanz Drittel des Gehirns und entsorgen.
   5. Hacken Sie the Hirngewebe in 1,4 mm dicke Scheiben mit einem koronalen Gewebe Chopper.
   6. Zeigen Scheiben in Schalen mit kaltem Dissektion Medium und sorgfältig trennen sie mit einer Nadel.
   7. Die RMS wird als dreieckige, durchscheinenden Bereich in der Mitte der OB Abschnitten und als eine kleine, kreisförmige Fläche in mehr kaudalen Hirnschnitten. Schneiden Sie die RMS von jeder Scheibe mit einem mikrochirurgischen Messer, dabei darauf achten, einschließlich der umgebenden Gewebe. In P7 Rattenjungen, in der Regel die meisten rostral ~ 8 Scheiben (inklusive OB) enthalten die RMS.
   8. Sammeln Sie die RMS-Fragmente mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und legen Sie sie in eine kleine Schüssel mit kaltem Dissektion Medium auf Eis.
   9. Wenn die Präparation abgeschlossen ist, übertragen Sie die RMS-Fragmente in einen 15-ml-Tube mit einer Kunststoffpipette. Lassen Fragmente am Boden des Röhrchens zu begleichen.
2. Dissoziation
   1. Ersetzen Sie die Dissektion Medium mit 2 ml Medium Dissoziation.
   2. Verreiben Sie das RMS-Fragmente durch sanft pipetting das Fragment Suspension auf und ab zu 10x mit einem P1000 Pipette.
   3. Von dem Schlauch mit der Gewebefragmente in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten.
   4. Pipettieren Sie die Lösung erneut 10x und sicherzustellen, dass Fragmente gespalten (die Suspension ist trüb).
   5. Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von 5 ml des vorgewärmten DMEM + 10% FCS.
   6. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 433 × g für 5 min.
   7. In der Zwischenzeit Aliquot die erforderliche Menge an siRNA / DNA in Eppendorf-Röhrchen (gewöhnlich 3-5 ug DNA / shRNA oder 5-9 ug pro siRNA-Oligo Nukleofektion jedoch die Menge des DNA / siRNA Optimierung erfordern kann).
   8. Überschüssiges Medium und Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren in 5 ml vorgewärmten DMEM + 10% FCS.
   9. Führen Sie eine Zellzahl. Erwarten ~ 1 x 10 ⁶ Zellen pro Ratte Welpen Gehirn. Für jede Nukleofektion sind mindestens 2,5 x 10 ⁶ Zellen benötigt, währendoptimale Ergebnisse werden mit 3-4 x 10 ⁶ Zellen pro Nukleofektion erreicht.
   10. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 433 × g für 5 min. Stellen Sie sicher, dass Sie so viel wie möglich zu entfernen Medium.

2. Nucleofection

1. Unmittelbar Zellpellet in Ratte (oder Maus, wenn mit Maus-Zellen), die zuvor bei Raumtemperatur inkubiert Neuron Nukleofektion Lösung. Verwenden Sie 100 ul pro Nukleofektion. Hinweis: in der Regel eine Ratte Wurf von 12 Welpen ist ausreichend, um 4 nucleofections durchführen und eine Maus Wurf (12 Welpen) ist ausreichend, um 2 nucleofections durchzuführen.
2. Überweisung 100 ul der Zellsuspension in jede Eppendorf Röhrchen mit siRNA / DNA und vorsichtig mischen 2-3x durch Pipettieren mit einem P200 Pipette.
3. Hinzufügen der Probe (cell-DNA/siRNA Suspension) an der Unterseite des nucleofectioncuvette, kümmert sich um Blasen zu vermeiden.
4. Nucleofect mit dem Programm G-013 (für Ratten-Zellen) oder O-005 (fürMauszellen). Eine Nukleofektion dauert ca. 5 sek.
5. Schnelles Hinzufügen von 1 ml vorgewärmten DMEM + 10% FCS auf die nucleofected Probe.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für alle anderen Proben. Hinweis: Für optimale Ergebnisse sollte die gesamte Prozedur Nukleofektion nicht länger als 5 min.
7. Übertragen jeder Probe in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml vorgewärmtem DMEM + 10% FCS mit der Kunststoffpipette vom Nukleofektion Kit bereitgestellt. Vermeiden Sie jede Übertragung von Zelltrümmern in die Röhre.
8. Zentrifuge Proben bei 433 × g für 5 min.
9. Überschüssige Medium vorsichtig entfernen und das Pellet in 25-30 ul vorgewärmtes DMEM + 10% FCS mit einem P20 Pipette. Verwenden Sie nicht mehr als 30 ul Medium.
10. Pipettieren die Suspension als ein Tropfen auf die Innenseite eines p35 Schalendeckel.
11. Kehren Sie die Deckel über den p35 Schale mit 2 ml Vollmedium (siehe auch Abbildung 1).
12. Lassen im Inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ fürmindestens 5 Stunden und bis zu 7 Stunden. Längere Inkubationszeit erlaubt eine bessere Reaggregation von Zellclustern.
13. Übertragen Sie die hängenden Tropfen aus dem Deckel in das Komplettmedium in die Schüssel mit einem P1000 Pipettenspitze mit einem Schnitt.
14. Bei 37 ° C / 5% CO ₂ für 24 h für DNA nucleofections und 48 h für siRNA / shRNA nucleofections.

3. Verankerung

1. Vorbereitung Komplettmedium (25 ml) und preequilibrate es bei 37 ° C / 5% CO ₂ für ein paar Stunden.
2. Nehmen Sie die gefrorenen Aliquots von Basalmembranmatrix von -80 ° C Gefrierschrank und tauen auf Eis im Kühlraum.
3. Für jede Nukleofektion bereiten ein 6-cm-Schale, die bis zu acht 13 mm steril coverlips.
4. Die Schalen werden auf einem Eis-Box mit Klarsichtfolie abgedeckt. Es ist wichtig, die Deckgläser kühl zu halten, um Matrix Verfestigung während des Einbettungsverfahren zu verhindern.
5. Um Feuchtigkeit zu erhalten, legen Sie einen Streifen von feuchten Gewebe innerhalb einer 15 cm Schüssel, dass wkrank verwendet, um auf drei 6-cm-Schalen, die die eingebetteten Neuroblasten halten werden.
6. Hinzufügen Komplettmedium zu der aufgetauten Matrix in einem Verhältnis von 1:3. Zum Beispiel mischen 40 ul Vollmedium mit 120 ul der Matrix durch Pipettieren. Diese Menge ist ausreichend Matrix zur Einbettung Aggregate auf acht 12 mm Deckgläsern.
7. Übertragen Sie die neu zusammengefügt Zellhaufen zu einem 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 433 × g für 5 min.
8. Überschüssiges Medium und das Pellet in 10 ul Vollmedium.
9. Platz 2 ul Zellsuspension auf jedes Aggregat sterilen Deckglas und fügen Sie 18 ul der Matrix / Komplett-Medium-Mischung. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Matrix über den gesamten Deck verbreiten.
10. Sofort legen Sie die 6-cm-Schale, die die Deckgläser in der 15-cm-Schale und lassen in den Inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ für 15-20 min. Wenn die Matrix verfestigt hat, vorsichtig mit 5 ml Vollmedium zu jedem 6 cm Schale wobei darauf zu schiebenunten eine schwimmende Deckglas mit einer Pipettenspitze.
11. Inkubation für 24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO ₂ Neuroblasten Migration aus der Zellaggregate zu lassen.

4. 3D-Migration-Assay

1. Bereiten Sie die für die Immunfärbung erforderlichen Lösungen.
   1. Bereiten Sie die Block-Lösung:
      Ziege Blocklösung (50 ml)
      Phosphat-gepufferte Saline (PBS) - 5 ml
      Goat Serum - 7,5 ml
      10% Triton X-100 - 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H ₂ O - 36 ml
   2. Filter und bei 4 ° C
   3. Bereiten Sie die Befestigungslösung:
      Fixier-Lösung (100 ml)
      Paraformaldehyd (PFA) - 4 g ACHTUNG: immer PFA Griff unter einer Haube
      Saccharose - 20 g (optional)
      PBS auf 100 ml
   4. Auf einer Heizplatte unter konstantem Rühren auflösen PFA in 80 ml PBS bei 65 ° C gehalten wird
   5. Sobald das PFA gelöst, mit 20 g Saccharose.
   6. PH-Wert auf7,4 (gewöhnlich durch Zugabe ~ 60 &mgr; l 1M NaOH pro 100 ml Lösung).
   7. Bringen bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml mit PBS.
2. Immunfärbung
   1. Zeigen Deckgläser in einer 24-Well-Platte.
   2. Spülen Deckgläser mit PBS 2x.
   3. Befestigen Sie die RMS Neuroblast Aggregate mit Befestigungslösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
   4. Spülen Deckgläser mit PBS 3x (5 min / Waschgang - auf einem Schaukel Plattform).
   5. Blockieren Sie für 30-60 min mit Ziegenblocklösung.
   6. Verdünnen Primärantikörper in Ziegen Block-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C (Falls gewünscht, fluoreszierende Phalloidin (1:400) und Hoechst Farbstoff (1:10.000) kann auch auf die Primärantikörperlösung hinzugefügt und filamentöses Aktin Kerne sichtbar wird).
   7. Spülen Deckgläser mit PBS 3x (5 min / Waschgang).
   8. Verdünnen Sekundärantikörper Ziege in Block-Lösung und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
   9. Spülen coverslips 3x mit PBS (5 min / Waschgang)
   10. Berg Deckgläser mit fluoreszierenden Montagemedium und lassen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
3. Migration Analysis
   1. Machen Sie Bilder von Fest RMS Neuroblast Aggregate mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 10X-Objektiv. Fügen Sie eine Maßstabsleiste in einem Beispielbild.
   2. Um den Maßstab für die Quantifizierung, messen Sie den Maßstab in dem Bild, indem Sie die "Gerade"-Tool auf der ImageJ Werkzeugleiste.
   3. Wählen Sie die Option "Analysieren" und klicken Sie auf 'gesetzt der Skala ".
   4. In der Skala Fenster stellen Sie die "bekannte Strecke" und aktivieren Sie die "globale"-Box die gleichen Einstellungen für alle Messungen zu halten.
   5. Verwenden Sie die 'Segmentlinie "-Tool auf der ImageJ Werkzeugleiste, um den Abstand von der Kante des Aggregats an den weitesten migriert Neuroblast in 6 verschiedenen Bereichen rund um die gesamte Aggregat (3B) zu messen. Betrachten Sie nur isoliert agAggregate für die Analyse.
   6. Berechnen einer durchschnittlichen Laufstrecke von den 6-Werte für jedes Aggregat erhalten.
   7. Messen 10-20 Aggregate für jede Bedingung in jedem unabhängigen Versuch und Pool Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Immer auch eine Nukleofektion Kontrolle (zB. GFP oder ein Steuer sh / siRNA).

Ergebnisse

Neuroblasten erfolgreich aus Gewebe seziert RMS (Fig. 1A) isoliert und in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet werden. Zellen aus Ratte oder Maus entweder postnatale RMS isoliert sind für wandernde Neuroblast Marker, wie Double (DCX), βIII Tubulin-oder PSA-NCAM (1B-C) immun.

Dissoziierten Neuroblasten effizient mit DNA nucleofected (zB. Ein GFP-codierenden Plasmid, Fig. 2) oder shRNA Plasmide (Fig. 4), um Proteinabbau zu erreichen, was durch Western-Blot-Analyse bestimmt werden kann (Fig. 4B) oder Immunfluoreszenz (nicht gezeigt) .

Zellen, die mit GFP-kodierenden Plasmide nucleofected radial wandern aus neu zusammengefügt Neuroblast-Cluster (Abbildung 3A). Quantifizierung der relativen Abstand migrierten 24 Stunden nach der Einbettung (3B) zeigt keinen Unterschied in der Migration zwischen GFP-Setzung ive Zellen und GFP-negativen, nonnucleofected Zellen (3C), die anzeigt, dass Nukleofektion an sich nicht stören Migration. Es gibt auch keinen signifikanten Unterschied in dem Ausmaß der Migration zwischen nucleofected Neuroblasten und Neuroblasten direkt aus der RMS-Explantaten (Daten nicht gezeigt) migrieren.

Fig. 1 ist. Dissektion der RMS Neuroblasten. (A) Schematische Darstellung der RMS Neuroblast Dissektion. Eine detaillierte Beschreibung finden Sie im Text beziehen. (B) Isolierte Ratten RMS-Zellen sind immun für die wandernden Neuroblast Trägern DCX und βlll Tubulin. Bar, 20 um. (C) Zellen Migration von Maus RMS Explantate drücken die Migrationsneuroblast Marker DCX und PSA-NCAM. Bar, 20 um.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

2. Maus Neuroblast Nukleofektion. Dissoziierte Maus RMS Neuroblasten wurden mit pMAX-GFP nucleofected, neu zusammengefügt, in eine dreidimensionale Matrix eingebettet und für 6 Stunden wandern. Neuroblasten Migration aus einem neu zusammengefügt Zellcluster (oben, Phasenkontrast-Bilder) zeigen hohe Transfektionseffizienz (unten, GFP-Kanal-Bilder). Die rechte Spalte Tafeln zeigen höhere Vergrößerung Bilder entsprechend den Einsätzen in der linken Spalte Tafeln hervorgehoben. Bars, 20 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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3. 3D-Migration-Assay. (A) wurden mit Ratten-Neuroblasten pMAX-GFP (GFP) oder pCAG-IRES-EGFP ²² (EV), neu zusammengefügt, in der Matrix eingebettet und dann für 24 Stunden wandern nucleofected. Zellen wurden dann fixiert und für GFP (grün) und βIII-Tubulin (rot) immungefärbt. Bar, 50 um. (B) Messwanderungsstrecke mit ImageJ. Die neu zusammengefügt Zellcluster ist in 6 gleiche Sektoren unterteilt. Der Abstand zwischen der Kante des Clusters (gestrichelte Linie) und dem am weitesten migriert Zelle für jeden Sektor gemessen. (C) Quantifizierung der relativen Abstand von nucleofected Zellen migrierten (GFP-positiv) und Steuerung, nonnucleofected Zellen (GFP-negative) . Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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4. Überwachung Neuroblast Migration nach shRNA Nukleofektion. (A) Neuroblasten Ratte wurden mit einer Kontroll shRNA Vektor (PCA-b-EGFPm5 Schalldämpfer 3, die ebenfalls exprimiert EGFP ²³⁾ oder der gleiche Vektor eine shRNA Targeting fascin, eine Actin-Bündelung Protein ²⁴ enthält nucleofected. Zellen wurden über 48 h neu zusammengefügt, in der Matrix eingebettet und dann für 24 Stunden zu migrieren. Aggregate wurden dann fixiert und für GFP (grün) und βIII Tubulin (rot) immungefärbt. Bar, 50 um. (B) Effektive Fascin Erschöpfung kann 50 Stunden nach shRNA Nukleofektion durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Aktin ist hier als Ladekontrolle Quantitative Analyse der relativen Wanderungsstrecke zeigt, dass Fascin Erschöpfung Neuroblast Migration erheblich beeinträchtigt (C) gezeigt. (; ** P <0,01; Mittelwert ± SEM n = 3 unabhängigen Experimenten).

Diskussion

Die Migration der Neuroblasten entlang der RMS an den endgültigen Standort im OB ist ein grundlegender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die diesen komplexen Prozess bei weitem noch nicht vollständig verstanden.

Die hier beschriebene experimentelle Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Neuroblast Migration in vitro. Wir haben eine bisher veröffentlichten Protokoll zur Isolierung von RMS Neuroblasten aus der frühen postnatalen Maus oder Ratte ²⁵ angepasst. Um optimale Ergebnisse zu erreichen, ist es wichtig, die Dissektionsschritt meistern, da es entscheidend ist, um das Zeitintervall zwischen Dissektion und Nukleofektion auf einem Minimum zu halten. Nach Nukleofektion können Neuroblasten neu zusammengefügt werden, in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet und links über einen Zeitraum von 24 Std. zu migrieren. Alternativ kann für andere als die Migration (z. B. Immunfluoreszenz oder Western-Blot-Analyse) Zwecken Zellen kann unmittelbar nach Nukleofektion auf polyornithine/laminin- plattiert werdenbeschichtete Deckgläser, wo sie bis zu 4-5 Tage überleben. Maus und Ratte Neuroblasten wandern in Matrigel in einem ähnlichen Ausmaß, aber Maus-Zellen scheinen eine stärkere Tendenz, in Ketten als Rattenzellen migrieren.

Je nach Ziel der Studie, können Neuroblasten mit verschiedenen Plasmiden fluoreszierende Proteine ​​oder Wildtyp / Mutante Proteine ​​von Interesse kodiert nucleofected werden. Für eine optimale Protein-Expressionsplasmide mit einer CAG-Promotors (β-Actin-Promotor CMV-Enhancer und β-Globin-Poly-A-Schwanz) ²⁶ werden empfohlen. Darüber hinaus kann siRNA Oligos oder shRNA Plasmide nucleofected werden, um Ziele von Interesse Knockdown. Effektive Proteinabbau kann durch Immunfluoreszenz oder durch Western-Blot (in der Regel Lyse eingebettet Aggregate von 1 Jungtier mit 50 ul Standard Lyse-Puffer) visualisiert werden.

Nucleofection ist eine relativ einfache Methode zur primären Neuroblasten Transfektion bietet eine einfachere und schnellere Alternative zu viral-Vektor-vermittelte Transfektion und kann hoch (~ 70-80%) Transfektion Effizienz zu erreichen. Es ist wichtig, während der Nukleofektion Verfahren schnell zu arbeiten, seit er in der Neuroblasten Nukleofektion Lösung für eine längere Zeit die Lebensfähigkeit der Zellen drastisch reduziert.

Die durchschnittliche Zellausbeute von RMS Dissektion ist relativ gering für P7-Mäuse (~ 5 × 10 ⁵ Zellen / Gehirn) im Vergleich zu Ratten, P7 (~ 1 × 10 ⁶ Zellen / Gehirn) und mindestens 3 x 10 ⁶ Zellen pro Nukleofektion erforderlichen der Transfektion mit ~ 50% Wirkungsgrad zu erreichen. Darüber hinaus erscheinen Ratte Neuroblasten besser zu widerstehen, um Nukleofektion Vergleich zu Maus Neuroblasten. Daher könnte der frühen postnatalen (P6-P7) Rattenjungen eine bequeme Neuroblast Quelle darstellen, auch unter Berücksichtigung, dass die Organisation von Ratte und Maus RMS sind bemerkenswert ähnLAR ²⁷ und dass das Ausmaß der Ratte und der Maus Neuroblastenmigration in vitro ist ebenfalls vergleichbar. Es ist ratsam, nicht die neu zusammengefügt Cluster von nucleofected Neuroblasten in Suspension für länger als 48 Stunden zu halten, um abnormale Effekte auf die Zellmorphologie und Migration (unsere unveröffentlichte Beobachtungen) zu vermeiden.

Die hier beschriebene 3D-Assay kann verwendet werden, um Neuroblastenmigration zu einem festen Zeitpunkt zu quantifizieren nach Einbetten in der Matrix (zB. 24 h) werden. Aggregate unterschiedlicher Größe in der Analyse verwendet werden, da es keine signifikante Korrelation zwischen der Größe der Aggregate und Migrationsdistanz (unsere unveröffentlichte Beobachtungen). Um sichtbar zu machen und weiter zu untersuchen, die Dynamik der Neuroblast Migration können Zeitraffer-Bildgebung verwendet werden. Es wird empfohlen, für die Durchführung der Analyse der Migration innerhalb einer 24-Stunden-Intervall nach der Einbettung, da die Geschwindigkeit der Neuroblasten scheint in längeren Zeitpunkte drastisch verringern (unsere unveröffentlichte Beobachtungen).

Es gibt einige Einschränkungen auf diesem Protokoll. Erstens kann bislang für Nukleofektion frühen postnatalen Nagetier Neuroblasten verwendet werden, während eine Infektion mit viralen Vektoren bleibt die effizienteste Transfektionsverfahren für erwachsene Neuroblasten ^28. Zweitens ist die in vitro-Migrationstest nicht vollständig die komplexe Architektur der in vivo beobachteten RMS reproduzieren. Tatsächlich, obwohl Neuroblasten Aufrechterhaltung der Fähigkeit, in einer ähnlichen Art und Weise, um ihre in vivo-Gegenstücke zu migrieren, in dem hier beschriebenen sie keine Wechselwirkung mit anderen Komponenten wie z. B. RMS Astrozyten und Blutgefäße, die auch dazu beitragen, ihre Beweglichkeit ^9,29 regulieren ^{Versuchsaufbau 30.} Dieses Problem kann in Zukunft durch die Optimierung von dreidimensionalen Co-Kultur-Modell-Systeme angesprochen werden.

Abschließend Nukleofektion Kombination mit einem 3D-Migrationsassay stellt ein wertvolles Werkzeug, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen besser zu verstehen,Neuroblast Migration. Das experimentelle Verfahren gibt einen ersten, schnellen und relativ einfache Methode, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration, die durch andere Ansätze, wie in vivo Elektroporation und postnatale Zeitraffer-Bildgebung von Hirnschnittkulturen validiert werden können beurteilen ^28,31,32 .

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Life Technologies	15140-122
2,5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15090-046	speichern 200 & micro; l Aliquoten bei -20 °
C DNAse I Fläschchen (D2)	Worthington	LK003170	≥ 1.000 Einheiten pro Durchstechflasche; Store 50 & Mikro; l Aliquoten bei -20 ° C
Dulbecco Modifiziertes Adlermedium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fötales Kälberserum (FCS)	Hyclone	SH3007902
Neurobasales Medium	Gibco	21103-049
B27 Nahrungsergänzungsmittel	Invitrogen Life Technologies	17504044
L-Glutamin (200 mM)	Invitrogen Life Technologies	25030-081
D-(+)-Glukoselösung (45%)	Sigma-Aldrich	G8769
Matrigel Basalmembranmatrix, Wachstumsfaktor reduziert (GFR), phenolrotfrei, 10 ml, LDEV-frei	BD Biosciences	356231	Herstellung 120 & Mikro; l aliquote bei 4 ° C, dann bei -80 °C lagern; C
PFA	Sigma-Aldrich	441242
Saccharose	BDH	102745C
Ziegenserum	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
BSA	Fisher Chemical	BPE9701-100
Dako Fluoreszenz-Eindeckmedium	Dako	S3023
Ratten-Neuronen-Nukleofektions-Kit	Lonza	VPG-1003
Maus-Neuronen-Nukleofektions-Kit	Lonza	VPG-1001
Mikrochirurgisches Messer	Angiotech	7516
McIlwain Gewebe-Chopper	The Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector II	Lonza