In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Zusammenfassung

Ultrahochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Live-Imaging-Tool, um Herzrhythmusstörungen bei Kleintieren zu untersuchen. Seine Nichtinvasivität ermöglicht die Aufrechterhaltung der physiologischen Zustand der Embryonen. Hier zeigen wir die Verwendung von M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu messen.

Zusammenfassung

Angeborene Herzerkrankung (CHD) die häufigste Todesursache noninfectious bei der Geburt. Die Inzidenz der KHK-Bereich von 4 bis 50/1, 000 Geburten (Krankheit und Verletzungen regionalen Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation, 2004). Praxen, die oft Kompromisse, die Lebensqualität sind erforderlich, um Herzfehler zu korrigieren, erinnert uns an die Bedeutung der Suche nach den Ursachen der KHK. Mutant Mausmodellen und Live-Imaging-Technologie haben sich zu wichtigen Tools, um die Ätiologie dieser Erkrankung zu untersuchen. Obwohl fortgeschrittene Methoden ermöglichen die Live-Darstellung von abnormalen Herzen in Embryonen werden die physiologischen und hämodynamischen Staaten der letzteren oft auf chirurgische und / oder langwierige Verfahren beeinträchtigt. Nichtinvasiven Ultraschallbildgebung kann jedoch ohne chirurgische Freilegung der Embryonen, wodurch ihre Physiologie Aufrechterhaltung verwendet werden. Hierbei verwenden wir einfache M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu beurteilen. Der Nachweis von abnormalen Herzfrequenzen ist in der Tat ein guter Indikatortor der Dysfunktion des Herzens und bildet somit einen ersten Schritt bei der Identifizierung von Entwicklungsdefekten, die zu Herzversagen führen kann.

Einleitung

KHK ist die häufigste nicht-infektiöse Todesursache bei der Geburt ^ein. Mehrere Operationen werden oft benötigt, um die strukturellen Mängel in den Fächern, deren Lebensqualität beeinträchtigt ¹ bleiben zu korrigieren. Kinder mit CHD entwickeln häufig neurologische Erkrankungen, auch wenn sie nicht unterzogen Chirurgie, der angibt, in utero Folgen auf die Entwicklung ^2,3 wichtig. Sowohl genetische und Umweltfaktoren, wie beispielsweise die Gefährdung durch Viren oder Chemikalien (Alkohol) während der Schwangerschaft, weil CHD. Die Untersuchung der genetischen Mitwirkenden noch in seiner frühen Phase, aber schnell wächst. Um diese Beitragszahler zu identifizieren und zu verstehen, ihre Rolle in der Herzentwicklung, Phänotypisierung mutierten Mäusen mit einer einfachen und leistungsfähiges Werkzeug wird sehr nützlich sein.

Maus ist in der Tat ein Tiermodell der Wahl zur KHK zu studieren, und die meisten der menschlichen Fällen kann bei Mäusen ^4,5 reproduziert werden. Folglich hat fetalen Herz Maus Phänotypisierung werden inc.reasingly wichtig, die Ursache der menschlichen CHD untersuchen und erfordert geeignete Instrumente. Obwohl histologische Untersuchungen an festen Proben sind von unschätzbarem Wert, ist eine Echtzeit-Bildgebung von lebenden Tieren entscheidend, die Physiologie des Herzens zu verstehen. Video-Mikroskopie bietet Live-Bildgebung. Allerdings erfordert es Laparotomie Embryonen freizulegen und damit ihre physiologischen und hämodynamischen Zustand beeinträchtigen. Vor kurzem hat sich zum Standard-Echokardiographie bildgebendes Verfahren für die Herz Einschätzungen in der Klinik als auch in Mäusen.

Maus-Echokardiographie wird mit Standard-klinischen Ultraschallsysteme sowie Ultrahochfrequenz-Ultraschallsystemen durchgeführt. Letztere stellen ein 30-MHz-Frequenzwandler oder höher, die zweidimensionale Bilder zu erzeugen und damit die Bewertung der frühen embryonalen Stadien. Diese Wandler haben eine relativ schlechte Eindringtiefe (~ 13 mm), das ist jedoch ausreichend, um eine ausreichende Bildebenen zu erhalten und festzustellen, Grund Herz paParameter, wie z. B. Herzfrequenz, linke und rechte ventrikuläre Innendurchmesser an der Diastole und der Systole und der Scheidewand und der Wanddicke, ohne eine Laparotomie.

In unserer Studie haben wir eine Ultra-Hochfrequenz-Ultraschallsystem zu Herzraten von Maus-Embryonen an embryonalen Tag E18.5 beurteilen, verwendet. Wir haben uns für eine 30-MHz-Wandler, die ein Feld Ansicht von 20 mm x 20 mm, die ideal ist, angesichts der Größe der Föten, mit einer Brennweite von 12,7 mm bietet. Jedoch kann eine höhere Frequenzwandler gewählt werden, früher Entwicklungsstufen zu analysieren. Die ausgewählte M-Modus ermöglicht die Visualisierung von Gewebe in Bewegung dank einer hohen zeitlichen Auflösung von 1.000 Bilder / Sek. Das vollständige Verfahren ist einfach und so schnell wie möglich durchgeführt werden, um jede Störung der physiologischen und hämodynamischen Zustände des Fötus zu vermeiden. Die Analyse von etwa 8 Embryonen benötigt ca. 1 Stunde.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll gezeigt Verfahren von der IRCM Animal Care Committee genehmigt.

1. Ultraschallsystem und Station Vorbereitung

1. Starten Sie den Ultraschall-Bildgebungssystem und verbinden Sie den Schallkopf als auch die Physiologie Steuereinheit nach der Anleitung des Herstellers (Abbildung 1). Wählen Cardiac Messprogramm und der Schallkopf, der dem 30-MHz-Wandler entspricht.
2. Füllen Sie das Mundstück des Schallkopfes mit VE-Wasser. Vermeiden Sie Luftblasen, wie sie mit Bildauflösung stören. Platzieren Sie den Abtastkopf mit der Griffseite auf seinem Halter in der Nähe der Abbildungs ​​Plattform (1A).
3. Desinfizieren Sie die Imaging-Plattform-und Arbeitsbereich.
4. Füllen Sie die Flasche komplett von Ultraschall-Gel, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, und legen Sie sie auf den Kopf in seiner Vorwärmung Container-Set bis 37 ° C (Abbildung 1B).
5. Überprüfen Sie die Ebenen von Oxygen und Isofluran und das Rohrsystem für die Anästhesie. Ein Experiment mit ~ 8 Embryonen ca. 15-20 L Sauerstoff zu verwenden.
6. Legen Sie die Flaschen von Augenbalsam, Enthaarungscreme und Elektroden-Gel in der Nähe des Imaging-Plattform (Abbildung 1B).
7. Stellen Sie sicher, dass die Infrarot-Wärmelampe Funktionen. Während der Ausbildung, stellen Sie die Heizstufe, die Position der Lampe und den Abstand der Lampe, um Mäuse, um eine konstante Körpertemperatur und Herzfrequenz.
   Hinweis: Die richtige Vorbereitung des Systems und Material ist kritisch. Langwierige Verfahren können die physiologischen und hämodynamischen Eigenschaften des Föten beeinflussen, so lange drückt Narkose Herzfunktion durch eine Senkung der Herzfrequenz, Blutdruck und Blutsauerstoffsättigung Ebene. Die Bearbeitungszeit für ~ 8 Feten (durchschnittliche Wurfgröße in C57BL / 6) sollte ca. 1 Stunde sein. Andere Mausstämme kann eine höhere Anzahl von Föten bereitzustellen, möglicherweise mit einem größeren weiblichen Größe. Training ist unerlässlich, um die Processi optimierenng Zeit.

2. Maus-Vorbereitung

1. Anesthetize die schwangere Frau in eine Kammer mit kontinuierlichen Versorgung von 2% Isofluran in Sauerstoff (200 ml / min), bis sie nicht reagierende wird.
2. Platzieren Sie die Maus auf dem Imaging-Plattform in Rückenlage, passen Sie den Schlauch für die kontinuierliche Inhalation von 1,5% Isofluran in Sauerstoff (200 ml / min), und befestigen Sie das Inhalationsschlauch mit Klebeband (Abbildung 2A). Ausreichende Anästhesie sollte während des Verfahrens durch die entspannte Haltung der Maus und dem Fehlen jeglicher Reaktion auf Schwanz und Zehen drückt bestätigt werden.
3. Platz Elektroden-Gel nur auf der linken oberen und rechten unteren Elektrode Pads (rechte Vorderbein und das linke Hinterbein, auch Blei-II-Position genannt) für Elektrokardiographie. Ableitung II Position bietet eine bessere definiert aufrecht positive P-Welle und QRS-Komplex um die Herzfrequenz zu bestimmen. Sichern Sie sich die vier Pfoten den einzelnen Pads mit Klebeband (Abbildung 2A). Um Trockenheit der Augen zu vermeiden, 1 TropfenAugenbalsam in jedes Auge.
4. Rasieren Sie den Bauch von der Brust zur Blase mit einer Haarschneidemaschine. Dann bewerben Sie sich Enthaarungscreme für 2 Minuten und wischen Sie es mit Gaze und / oder Wattestäbchen vorsichtig entfernen Sie alle verbleibenden Haare. Achten Sie darauf, die Brustwarzen abgeschnitten.
5. Stecken Sie das Thermometer mit Elektroden-Gel in das Rektum des Weibchens, um die Körpertemperatur zu überwachen vorgeschmiert (sollte bei 37 ± 0,5 ° C durch Einstellen einer Infrarot-Wärmelampe über der Plattform platziert gehalten werden). Die Herzfrequenz sollte 450 ± 50 Schläge / min (bpm) sein. Sowohl die Temperatur und Herzfrequenz werden auf die Physiologie Steuereinheit (1B) dargestellt.
   Hinweis: Lang Betäubung, Haarausfall und Ultraschall-Gel (obwohl vorgewärmten) kann zu Unterkühlung führen, die Herzfrequenz der Frau beeinflussen können. Wenn die Körpertemperatur sinkt unter 36,5 ° C, stoppen Sie das Verfahren und die Position der Wärmelampe, die Temperatur-und die Herzfrequenz einstellen ändern. Warten Sie ein paar Minuten befErz wieder fortfahren.

3. Embryo Identification

1. Drücken Sie vorsichtig auf den nackten Bauch, um die Embryonen zu finden. Langsam und leicht verbreiten sie aus, um die meisten der Embryonen in einer einzigen Schicht unter der Bauchoberfläche haben. In jedem Uterushorn werden Säcke linear miteinander verbunden. Versuchen Sie, diese Ordnung zu wahren, wenn sie breitet sich aus.
2. Mark jeder Embryo auf dem nackten Bauch der Frau mit einem Permanent-Marker mit ihren vorderen / hinteren und dorsalen / ventralen Richtungen. Wissen die Orientierung erleichtert Auffinden der Herzen mit der Sonde. Anzahl der Embryonen in den rechten und linken Hörner ausgehend von der Zervix (1, 2, 3 ... und 1 ', 2', 3 '... jeweils, Fig. 2B).
   Hinweis: (i) Vermeiden Sie die Verbreitung der Embryonen mit übermäßiger Kraft. Skizzieren Sie ihre Standorte auf einem Stück Papier, um sie zu verfolgen (Abbildung 2C). (Ii) C57BL / 6 Weibchen ~ 8 Feten pro Wurf. , 0-2 Embryonen in jedem Wurf sind jedoch located unter die anderen, die ihre Bild unmöglich. Ausschließen diese Embryonen aus der Analyse und Bewertung von mehr Würfe, wenn nötig.

4. Herzfrequenzmessung

1. Legen Sie eine kleine Menge des vorgewärmten Ultraschall-Gel auf den nackten Bauch und gleichmäßig verteilen. Blasenbildung zu vermeiden. Hinzufügen einer größeren Menge an Gel (~ 5 ml) auf den spezifischen Bereich zu Bild.
2. Halten Sie die Sonde in Kontakt mit der dicken Gel-Schicht (10 mm) und nach und nach verschieben Sie die Sonde in Richtung der Haut, während der Suche nach dem schlagenden Herzen. Sobald das schlagende Herz wird auf dem Bildschirm sichtbar, stellen Sie den Winkel der Sonde an beide Ventrikel in ihrer größten Größe in der Bildebene (2D) zu haben.
3. Beginnen Erfassen von Bild. Mit der Unterarm auf der Station ruhen, legen Sie den Wandler auf dem Ultraschall-Gel, ein Live-Bild auf dem Bildschirm (2D) zu erhalten. Die Aufrechterhaltung der Grat des Wandlers auf der Oberseite und auf den Schallkopf Veranlagunn-Marker (in der linken oberen Ecke des Bildes) ermöglichen die Koordination der Handbewegung und die Fläche auf dem Bildschirm visualisiert.
4. Ausgehend von der Zervix, gehen Sie zum nächsten Embryo markiert (1 bzw. 1 'in der rechten oder linken Uterushorn, respectively), um den Herzschlag auf dem Bildschirm visualisieren. Weil Schärfentiefe festgelegt ist, sanft bewegen die Sonde nach oben / unten und zur Seite, ohne den Kontakt mit Gel, um den gewünschten Bildebene zu erhalten.
5. Positionieren Sie das schlagende Herz in der Mitte des Bildschirms in der Region durch den gelben gestrichelten Linie, die die Fokuszone für eine bessere Datenerfassung angegeben.
6. Erwerben Sie die Live-Aufnahme. Erhalten Sie die Bild-und Pfadfinder Fortsetzen der Aufnahme (Abbildung 3A). Sobald ein Minimum von 10 Sekunden von einer stabilen Aufzeichnung erhalten wird, stoppen Sie die Aufnahme und sparen.
7. Gehen Sie zum nächsten Embryo.
8. Sobald alle Embryonen werden analysiert, drücken Sie auf "Durchsuchen" auf der Tastatur, um die Liste der Aufnahmen anzuzeigen. Spiele jeden aufgezeichnet M-Modus tracing und vielfache Messungen (mindestens 5 pro Spur) der Abstand zwischen benachbarten Spitzen (Zeit / Strömungszyklus), um die durchschnittliche Herzfrequenz (Fig. 3B) zu erhalten.
   Hinweis: Einige Protokolle vorschlagen, mit einem feststehenden Ständer für den Schallkopf zu vermeiden schüttelnd. Allerdings hemmt es den Winkel der Analyse, so dass die Beobachtung der Seiten Embryonen schwierig. Es verlangsamt auch die Analyse, wie der Ständer für jede Embryo eingestellt werden. Halten Sie den Schallkopf während Beilegung der Unterarm auf der Station effizient minimiert schüttelnd. Training mit 5-10 schwangeren Frauen wird empfohlen, um das Ergebnis zu optimieren.

5. Genotypisierung

1. Mit sauberen chirurgischen Schere und Pinzette, längs einschneiden, die Haut-und Muskelschicht des Bauches. Suchen Sie die Säcke in jedem Uterus Horn und entsprechen die Zahlen. Schneiden Sie den Dottersack, den Embryo in der obigen Reihenfolge verwendet aussetzen. Wenn nicht in einer linearen Anordnung, die Skizze der Embryo Positionen auf einem StückPapier wird entscheidend sein, wenn die Flecken auf der Haut sind nicht mehr sichtbar.
2. Schneiden Sie nur ~ 4 mm des Schwanzes für die Genotypisierung als genomische DNA sehr effizient aus embryonalen Schwänze extrahiert.
   Anmerkung: (i) Das chirurgische Verfahren kann in einem separaten Ort von den Bildgebungsraum durchgeführt werden. Allerdings ist es wichtig, nicht die Maus bewegen und den chirurgischen Eingriff auf dem Imaging-Plattform, um den Überblick der nummerierten Embryonen zu halten. Wenden Sie das Tier Facility-Manager, um den chirurgischen Eingriff zu optimieren. (Ii) Die schwangere Frau schnell stirbt aufgrund von Blutverlust, wie die Föten für die Genotypisierung nach der Bebilderung entfernt. Nach Schwanz geschnitten, werden die Föten durch Hypothermie platziert 3 min auf Eis für Anästhesie und dann mit einer Schere enthauptet, wie unsere Tierpflege empfahl.

Ergebnisse

Das obige Verfahren wurde verwendet, um die Auswirkung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Serin-Protease Furin in Endothelzellen auf die Herzraten bei E18.5 Maus-Embryonen im Uterus zu beurteilen. Furin gehört zur Familie der Proproteinkonvertasen (PCs), dass spalten Proteinvorläufer nach der Grundreste. Furin und ihre Substrate sind sekretorische Proteine ​​und Spaltung kann in den Golgi-Apparat, Endosomen oder an der Zelloberfläche auf. Key Substrate von Furin gehören TGFb und TGFb artigen Faktoren, wie die...

Diskussion

M-Mode-Echokardiographie ist eine effektive und einfache Methode, um in utero Herzfrequenzen von Maus-Embryonen zu messen. Im Handel erhältliche Wandler liefern eine ausreichende Auflösung, um kleine schlagenden Herzen zu visualisieren. So ermöglichen sie eine hoch-genaue Herzfrequenz-Messung, im Vergleich zu anderen Methoden wie Pulsmessung, und kann hochauflösende Video-Mikroskopie ersetzen. Allerdings müssen die derzeitigen Instrumente nicht zulassen, dass die gleichzeitige Analyse aller Embryonen, was eine ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-Chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethylether
Ultraschallgel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Gel mit klarer
Elektrode	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
Ophthalmic Gel	Novartis	Tränengel
Enthaarungscreme	Church Dwight Co., Inc.	Nair
Haarschneider
Gaze/Watte-Swap	Wattestäbchen
Permanentmarker
Hochauflösende In vivo Ultraschall-Bildgebungssystem	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz Schallkopf	Visual Sonics	RMV707B
Imaging Plattform und Controller-Einheit für Physiologie	Visual Sonics
Anästhesiesystem	Cyprane North America Inc.
Infrarot-Heizlampe

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