Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Summary

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Abstract

Die Arbeit mit empfindlichem Gewebe kann ein erschwerender Faktor bei der Durchführung immunhistochemischer Untersuchungen sein. Hier stellen wir eine Methode vor, die eine ringgestützte hydrophilisierte PTFE-Membran verwendet, um sowohl lebendes als auch fixiertes Gewebe während der immunhistochemischen Verarbeitung strukturell zu unterstützen, was die Verwendung einer Vielzahl von Protokollen ermöglicht, die andernfalls das Gewebe schädigen würden. Zunächst wird dies mit der Bolusbeladung von fluoreszierenden Markern in lebendes Netzhautgewebe demonstriert. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Visualisierung der Zielstrukturen, während die Membranstütze die Gewebeintegrität während der Injektion aufrechterhält und eine einfache Übertragung des Präparats für die weitere Bildgebung oder Verarbeitung ermöglicht.

Zweitens wird ein Verfahren zur Antikörperfärbung in Gewebe beschrieben, das mit Carbodiimid fixiert ist. Obwohl die Paraformaldehyd-Fixierung häufiger vorkommt, bietet die Carbodiimid-Fixierung ein überlegenes Substrat für die Visualisierung synaptischer Proteine. Eine Einschränkung von Carbodiimid besteht darin, dass das resultierende fixierte Gewebe relativ zerbrechlich ist; Dies wird jedoch durch den Einsatz der Stützmembran überwunden. Zur Demonstration dieser Techniken wird Netzhautgewebe verwendet, aber sie können auch auf jedes empfindliche Gewebe angewendet werden.

Introduction

Die Durchführung von Immunhistochemie in empfindlichem, intaktem Gewebe birgt das Risiko einer Beschädigung während der Handhabung und des Transfers. Dies kann entweder in Hirnschnitten oder anderen dünnen Geweben, wie z. B. degenerierter Netzhaut, auftreten. Darüber hinaus gibt es bestimmte Methoden der Gewebefixierung, die für die Immunfärbung neuronaler Strukturen vorteilhaft sein können, aber zu einer beeinträchtigten strukturellen Stabilität führen, was ihre Verwendung ausschließt. Ein besonderes Beispiel hierfür ist die Carbodiimid-basierte Fixierung, die für die Färbung der Rezeptoren und Hormone^1-7 überlegen ist, aber aufgrund der Instabilität des fixierten Gewebes häufig vermieden wird.

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine hydrophilisierte PTFE-Membran verwendet, um empfindliches Gewebe, entweder fixiert oder unfixiert, für eine Vielzahl von Färbetechniken strukturell zu stützen. Die Stützmembran ermöglicht die Manipulation von empfindlichem Gewebe vor und nach der Fixierung, wodurch mehrere Verarbeitungsschritte möglich sind und gleichzeitig das Risiko einer Gewebeschädigung minimiert wird. Insgesamt bietet diese einfache Methode zur Erhaltung der Gewebeintegrität die Möglichkeit, Techniken anzuwenden, die sonst vermieden werden könnten. Daher könnte dieser Ansatz auch erfolgreich für die Präparation einer Vielzahl von Geweben eingesetzt werden, wie z. B. Gehirnschnitte, die nach dem Schneiden brüchig werden.

Protocol

Bei allen experimentellen Verfahren wurden die Tiere gemäß den Vorschriften in der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung und in Übereinstimmung mit den vom Weill Cornell Medical College genehmigten Protokollen behandelt. Die Tiere wurden durch Kohlendioxid und anschließende Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert.

1. Dissektion der Wholemount-Netzhaut

1. Nachdem die Maus eingeschläfert wurde, enukleieren Sie ihre Augen und legen Sie sie in sauerstoffhaltige, HEPES-gepufferte Ringer-Lösung (Tabelle 1).
2. Entfernen Sie die Hornhaut, indem Sie mit einer kleinen Schere in einem kreisförmigen Weg entlang der Ora serrata schneiden und das Auge mit einer Pinzette am Limbus halten. Ziehe die Linse mit einer Pinzette heraus.
3. Entfernen Sie so viel Glaskörper wie möglich mit einer Pinzette mit abgestumpftem Rand. Dieser Schritt ist wichtig für Bolusinjektionen und elektrophysiologische Aufzeichnungen; Es ist nicht notwendig, wenn nur Immunhistochemie durchgeführt wird.
4. Löse die Netzhaut von der Augenmuschel, indem du die Pinzette zwischen der Netzhaut und der Augenmuschel positionierst und die Pinzette langsam um den Umfang bewegst. Stabilisieren Sie die Augenmuschel, indem Sie die Sklera mit einer zweiten Pinzette festhalten. Schneiden Sie den Sehnerv an der Stelle zwischen Netzhaut und Augenmuschel durch, um die Trennung der Netzhaut von der Augenmuschel zu erleichtern.
5. Die Netzhaut kann in Stücke (z.B. Viertel) zerlegt oder als Ganzes verwendet werden. Um in Stücke zu schneiden, verwenden Sie eine Schere, um Schnitte von der Netzhautperipherie bis hinunter zum Sehnerv zu machen. Um die gesamte Netzhaut zu nutzen, können Sie alternativ Schnitte von der Peripherie auf halbem Weg zum Sehnerv vornehmen. Die Einschnitte helfen dabei, eine flache Vorbereitung zu machen.

2. Montage auf hydrophilisiertem PTFE-Membraneinsatz

1. Bereiten Sie die Membran wie unten beschrieben vor. Wenn physiologische Aufzeichnungen oder Farbstoffinjektionsexperimente durchgeführt werden, kürzen Sie den Halter entweder mit einer Drehmaschine oder einer Handsäge so, dass der verbleibende Ring eine Höhe von 1 mm hat
   Hinweis: Die Einsätze der Kulturplatte können entweder unverändert oder modifiziert sein (Abbildung 1A). Die Wahl der Konfiguration wird durch den Zweck des Experiments bestimmt. Für die Immunfärbung eignet sich ein unmodifizierter Einsatz.
2. Polieren Sie raue Oberflächen mit feinem Schleifpapier (Körnung 300 oder höher) ab.
3. (Optional) Entfernen Sie die Füße unter dem Ring mit einer Schere.
4. Um Schmutz zu entfernen, spülen oder beschallen Sie die Membran 2-3 Minuten lang in destilliertem Wasser.
5. Montieren Sie das Gewebe auf der Membran (Abbildung 1A). Legen Sie das Gewebe mit etwas Lösung und einer Kunststoff-Transferpipette auf die Membran. Schneiden Sie bei Bedarf die schmale Spitze der Pipette ab, um zu vermeiden, dass die Gewebeprobe während des Transfers an der Pipette kleben bleibt.
6. Befestigen Sie die Netzhaut mit den Ganglienzellen (GCs) nach oben: Entfernen Sie die Lösung auf der Membran nach und nach, während Sie die Netzhaut spreizen und die Falten mit einer Pinzette entfalten.
7. Positionieren Sie auf der gegenüberliegenden Seite der Membran eine leere Spritze (1 ml) direkt unter dem Gewebe. Üben Sie einen Sog aus, indem Sie den Kolben auf ein Volumen von 0,2-0,3 ml zurückziehen. Vergrößern Sie die Saugfläche, indem Sie die Haltespitze der Spritze vor der Verwendung abschneiden. Das Gewebe benötigt keine weitere Behandlung der Adhäsion, da es physisch in die Membran eingebunden ist.

3. Bolus-Injektion von Isolektin Alexa 488

1. Bereiten Sie Patch-Pipetten und Färbelösung vor. Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Borosilikat-Kapillarglas mit einem flammenden/braunen Abzieher mit einem Widerstand von ~1 MΩ. Brechen Sie vorsichtig die Spitze der Pipette.
2. Stellen Sie eine Färbelösung her, indem Sie 0,3 μl Isolektin Alexa 488 Stammlösung zu 10 μl der in Schritt 1.2 beschriebenen HEPES-gepufferten Ringer-Lösung hinzufügen.
3. Übertragen Sie die Probe zur Injektion in das Patch-Clamp-Setup (Abbildung 1C). Die Membran mit dem anhaftenden Gewebe wird in die Aufnahmekammer gegeben, die mit erwärmter (37 °C) und sauerstoffhaltiger HEPES-gepufferter Ringer-Lösung durchblutet ist.
4. Platzieren Sie die farbstoffhaltige Pipette gegen die innere Grenzmembran (ILM, Abbildung 2A). Schieben Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator weiter gegen das ILM, bis es in dieses eindringt. Injizieren Sie die Färbelösung mit einem Druck von 10-20 psi für 1 Sekunde mit einem Picospritzer. Eine oder mehrere Stellen können für die Injektion vorgesehen sein (Abbildung 2B). Wenn kein Picospritzer zur Verfügung steht, kann eine 10-ml-Spritze verwendet werden, um einen positiven Luftdruck für die Injektion abzugeben.
5. Inkubieren Sie das injizierte Gewebe für 10 Minuten. Während der Inkubation kann das injizierte Gewebe unter Epifluoreszenzbeleuchtung betrachtet werden.
6. Nach der Markierung kann das Präparat zur Bildgebung an ein Mikroskop gebracht werden. Übertragen Sie den Einsatz in eine Kulturschale mit Glasboden und legen Sie ihn mit der Netzhaut nach unten (Abbildung 1C).
7. Fügen Sie einen Tropfen HEPES-Lösung hinzu, um die Probe feucht zu halten.
8. Legen Sie 2-3 Flecken Vakuumfett um den Umfang des Kunststoffrings, um den Einsatz fest am Boden der Kulturschale zu befestigen.
9. Bringen Sie die Schüssel auf den Mikroskoptisch.

4. Paraformaldehyd- und Carbodiimid-Fixierung

1. Fixieren Sie die Probe, indem Sie den Einsatz für 15 Minuten in das Fixiermittel überführen. Je nach Anwendung können längere oder kürzere Fixierzeiten verwendet werden. Beide Fixiermittel können effektiv verwendet werden, um GFP, Isolektin oder fluoreszierende Alexa-Hydrazide zu fixieren (z. B. zum Befüllen der Zellen in Patch-Clamp-Aufnahmen).
   Hinweis: Zur Fixierung können entweder 4%ige Carbodiimid- oder 4%ige Paraformaldehydlösungen verwendet werden. Um die Adhärenz zu erhalten, sollte die Fixierung erfolgen, nachdem das Gewebe bereits an der Membran befestigt wurde. Das Gewebe kann sofort nach der Montage oder nach physiologischer Aufzeichnung und/oder Bolusinjektion fixiert werden.
2. Spülen Sie das Tuch 30 Minuten lang mit Phosphatpuffer (PB) aus. Danach kann das Gewebe entweder als Ganzbau (Schritt 5) bearbeitet oder in vertikale Schnitte geschnitten und anschließend verarbeitet werden (Schritte 6 und 7).

5. Immunfärbung von retinalen Wholemounts

1. In einer 24-Well-Schale (Abbildung 1D) werden Netzhautstücke auf der Membran 1 Stunde lang in einer Färbelösung blockiert.
2. Maus-Anti-PSD-95-Primärantikörper 1:300 in der Färbelösung verdünnen und 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln auftragen. ~100-150 μl Antikörperlösung in jede Vertiefung mit dem Gewebe geben. Um ein Austrocknen zu verhindern, füllen Sie ungenutzte Brunnen mit destilliertem Wasser.
3. 20 min in PB spülen, 3x.
4. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem Esels-Anti-Maus-Antikörper Alexa 568, der 1:500 in der Färbelösung gelöst ist.
5. 20 min in PB spülen, 3x.
6. Legen Sie den Einsatz mit dem gefärbten Gewebe in eine mit PB-Lösung gefüllte Standard-Petrischale von 3 cm. Schneide mit einer kleinen Schere den Teil der Membran, der die Netzhaut enthält, aus dem Ring heraus.
7. Übertragen Sie die Netzhaut auf der Membran auf einen Slide Retina nach oben. PB entfernen, Einhängemedium hinzufügen. Legen Sie kleine Stücke eines zerbrochenen Deckglases zwischen den Objektträger und die Deckglasbrille, um ein starkes Quetschen und eine Beschädigung der Netzhaut zu vermeiden. Deckglas aufsetzen.
8. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Bewahren Sie Dias im Dunkeln im Kühlschrank auf.

6. Vertikales Schneiden von membrangelagertem Gewebe

1. Nach der Fixierung tauchen Sie das Gewebe auf der Membran 30 min, 1 h bzw. über Nacht in die Saccharosegradientenlösungen von 10 %, 20 % und 30 % Saccharose ein. Der Übernachtschritt wird bei 4 °C im Kühlschrank durchgeführt, alle anderen Schritte bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie mit einer Schere die Membran mit dem Taschentuch vom Kunststoff-Einlegering.
3. Legen Sie die abgeschnittene Membran mit der Netzhaut nach oben auf Parafilm und entfernen Sie so viel Lösung wie möglich mit Kimwipes.
4. Geben Sie den Parafilm mit dem Gewebe in die Kryostatkammer und fügen Sie einen Tropfen OCT-Medium hinzu. Verwenden Sie das Schnellgefriergerät, um das Einfrieren zu beschleunigen.
5. Nehmen Sie die gefrorene Probe ab und drehen Sie sie um.
6. Überschüssiges gefrorenes OCT abschneiden. Lassen Sie an drei Seiten etwa 2 mm um die Probe herum und lassen Sie 5-6 mm von der Seite entfernt, die am Halter befestigt wird.
7. Die freiliegende Netzhautseite (Membranseite) mit einem Tropfen OCT abdecken. Lassen Sie den Befestigungsbereich frei.
8. Frieren Sie die Membran mit Netzhautgewebe ein. Nun ist die Probe bereit, um sie auf einen Schneidhalter zu legen.
9. Geben Sie einen Tropfen OCT auf einen kalten Haltering. Geben Sie die gefrorene Probe sofort in den Tropfen.
10. Schneiden Sie Abschnitte mit einer Dicke von 10-20 μm und stellen Sie die Kryostatentemperatur auf -19 °C ein. Verwenden Sie warme (Raumtemperatur) Polysin-Adhäsionsobjektträger. Lassen Sie die Objektträger mit den befestigten Abschnitten für ~2-3 min (41 °C) im Dunkeln auf einer Heizplattform, um eine feste Haftung der Abschnitte zu gewährleisten.
11. Legen Sie die Objektträger in eine Aufbewahrungsbox und bewahren Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C auf.

7. Immunfärbung von Netzhautschnitten

1. Nehmen Sie die Dias mit den Abschnitten aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie sie 1 Minute bei Raumtemperatur stehen, um das Kondensat zu entfernen.
2. Umschließen Sie die Abschnitte mit einem Flüssigkeitsblocker, um eine Barriere für die weitere Inkubation zu schaffen.
3. Legen Sie die Objektträger in die Inkubationsbox. Decken Sie den Boden der Schachtel mit Wasser ab, um eine Verdunstung der Antikörperlösung zu verhindern.
4. 5 Min. mit PB spülen.
5. Bereiten Sie die gleichen Färbelösungen vor und befolgen Sie die Schritte wie in Schritt 5. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgt über Nacht und mit dem sekundären 1 Stunde. Verwenden Sie keine Glasscherben zwischen Deckglas und Objektträger.

Results

Hier werden zwei repräsentative Experimente demonstriert, die von der Verwendung einer hydrophilisierten PTFE-Membran profitieren, um die gesamte Netzhaut während Färbeverfahren zu unterstützen. Das erste Experiment veranschaulicht die Methode zur schnellen und einfachen Charakterisierung des retinalen Gefäßsystems, eines ausgeklügelten Netzwerks von Blutgefäßen, das sich über mehrere Netzhautschichten erstreckt (Abbildung 2). Dieser Ansatz kombiniert die Bolusbeladung von Isolektin mit der Immersionsmar...

Discussion

Die hohe Biokompatibilität und Transparenz der hydrophilisierten PTFE-Membran in Lösungen ist bei der Arbeit mit lebendem Gewebe von Vorteil. Dieses Präparat wurde in früheren Arbeiten erfolgreich für Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Lichtantworten^8-10 eingesetzt. Hier zeigen wir, wie dieser Ansatz für die strukturelle Analyse der Wholemount-Netzhaut übernommen werden kann.

Die Bolusladetechnik kann effektiv zur Markierung von lebendem Gewebe eingesetzt werden. Diese Technik wird durc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Millicell Zellkultureinsatz, 12 mm, hydrophiles PTFE (Biopore), 0,4 μ m	Millipore	PICM01250
Insulinspritze, 1 ml	Beckton Dickinson	309659
Schere	Fine Science Tools	15003-08	Dissektion
Pinzette, Dumont #55, Inox	Fine Science Tools	11255-20	Dissektion
Kryostat	Leica	diverse
Konfokalmikroskop System	Nikon	diverse
Kapillarglas	World Precision Instruments	1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III	Parker Hannifin
Kulturschalen mit Glasboden	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Petrischale	Falcon	1008
Einweg-Transferpipetten mit Graduierung	VWR	16001-180
Multiwell-Platten, 24-Well-Beckton	Dickinson	351147
Deckglas, #1	Elektronenmikroskopie Sciences	72200-30
Polysin-Adhäsionsobjektträger	Elektronenmikroskopie Sciences	63412-01
Objektträger	Globe	1301
Liquid Blocker	Elektronenmikroskopie	Sciences 71312
VECTASHIELD Eindeckmedium	Vector Laboratories	H-1000
OCT mittel	Sakura	4583
Parafilm Laborfilm	Fisher	13-374-10
Dow Corning Hochvakuumfett	Sigma-Aldrich	Z273554
Maus Anti-PSD95	Millipore	MABN68	Antikörper
Esel Anti-Maus Alexa 568	Invitrogen	A10037	Antikörper
Isolectin Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforhodamin	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimid	Thermo Scientific	22980	EDC
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148