Listeria monocytogenes ist ein Gram-positiven bakteriellen Erreger häufig als ein Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus verwendet. Imaging späten L. monocytogenes-Infektion Stufen im Rahmen der kleinen interferierenden RNA Bildschirme ermöglicht die globale Untersuchung von zellulären Wege für die bakterielle Infektion von Zielwirtszellen erforderlich.
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Methodenartikel
Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bakterienintrazelluläre Pathogene können als molekulare Werkzeuge zur zellulären Signalkaskaden auf Grund ihrer Fähigkeit, vorzüglich zu manipulieren und zu untergraben Zellfunktionen, die für die Infektion von Wirtszielgewebe erforderlich sezieren konzipiert werden. Unter diesen bakteriellen Erreger ist Listeria monocytogenes eine Gram-positiven Mikroorganismus, der als Paradigma für den intrazellulären Parasitismus in der Charakterisierung der zellulären Immunantworten verwendet wurde, und die instrumentelle Rolle in der Entdeckung der molekularen Signalwege steuern Zytoskelett-und Membrantransport Dynamik gespielt hat. In diesem Artikel beschreiben wir einen robusten mikroskopischen Assay zum Nachweis von zellulären Infektion späten Stadien von L. monocytogenes auf der Basis der Fluoreszenzmarkierung InlC, eine sekretierte bakterielle Protein, das im Cytoplasma von infizierten Zellen akkumuliert, dieser Assay für automatisierte Hochdurchsatz-small interfering RNA-Bildschirme, um char gekoppelt werdenacterize zelluläre Signalwege in der Auf-oder Abwärtsregulierung der Infektion beteiligt.
Einleitung
Die Gram-positiven Bakterium Listeria monocytogenes ist ein Lebensmittel übertragbaren Krankheitserreger, der Wirtszellen eindringt, stört seine Internalisierung Vakuole und repliziert im Zytoplasma der Wirtszellen ein. L. monocytogenes Leichtigkeit der Manipulation im Labor Kontext (schnelles Wachstum, geringe Toxizität für gesunde Personen) mit dem Fortbestehen der in Zell-und Tiermodellen beobachtet bakteriellen Virulenz assoziiert (hämolytische Aktivität, Leukozytose) erlaubt seinen ersten Einsatz in den 1960er Jahren als Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus und für die Errichtung der theoretischen Grundla....
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Protokoll
1. Herstellung von Zell-und Bakterienkulturen, Transfektion Werkzeuge und Primäre Antikörper
- Eine frische Agar-Platte, einzelne L. isolieren monocytogenes Kolonien aus einer bakteriellen Glycerin Lager (50% glycerol/50% gesättigte Flüssigkeit Bakterienübernachtkultur), der bei -80 ° C
- Mit einem Aluminiumgestell (bei -80 ° C gehalten), um eine gefrorene Bakterien Glycerin Lager, Streifen Bakterien auf einer Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte zu transportieren.
- Die Platte bei 37 ° C während 48 Stunden (oder bis einzelne Bakterienkolonien isoliert werden kann).
- Bewahren Sie diese Arbeitsplatte danach bei 4 ° C ....
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Ergebnisse
Fluoreszenzmarkierung von zytoplasmatischen InlC bietet eine robuste Anzeige für Zellinfektion durch L. monocytogenes, wie in Fig. 1 veranschaulicht: die zentrale Zelle in dem Mikrobild wird von dem Stamm P14.PrfA * 23 infiziert, wie es in dem Phasenkontrastbild (Pfeilspitzen, Fig. 1A) beobachtet werden, und es wird durch das DAPI-Signal bestätigt wird, wo einzelne Bakterien deutlich unterscheiden (Abbildung 1B). Die InlC Färbung (DAPI zum Färben in .......
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Diskussion
Mehrere Parameter sind kritisch für den Erfolg unserer InlC Erfassungsprotokoll, einschließlich der Verwendung von gesunden Zellinien Anzeigen einer ausreichend großen Zytoplasma eine eindeutige Erkennung der InlC Signals zu ermöglichen. Bei dem Test in diesem Artikel schlagen wir die Verwendung von HeLa CCL2-Zellen, die sich besonders gut für unseren Test geeignet aufgrund der Erweiterung ihrer zytosolischen Raum sind wir präsentieren, andere HeLa-Klone wie HeLa-Zellen Kyoto um einen kleineren Zytoplasma kann aber verw.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Research in P. Cossart Labor ist vom Pasteur-Institut, dem Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, dem Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), der Agence Nationale de la Recherche (MIE-Zuschuss unterstützt SignRupVac), den Louis-Jeantet-Stiftung und der Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK ist ein Empfänger eines Stipendiums von den Pasteur-Universität Paris Internationale Promotionsprogramm / Institut Carnot Mala infectieuses. Wir danken Jason Mercer für die Optimierung der Zell Transfektionsprotokolls.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | Für die flüssige BHI-Zubereitung |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Ergänzung zu flüssigem BHI für BHI-Agarplatten |
| Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyd (16%) | EMS | 15710 | Vor jedem Experiment frisch vorbereiten |
| Anti-Kaninchen Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Schwarze 384-Well-Mikroskopie-Zellkulturplatte | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 Mikroskop | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS-Kamera | Andor | Neo | |
| Metamorph Analysesoftware | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler-Analysesoftware | Broad Institute | Public Software verfügbar unter http://www.cellprofiler.org/ |
Referenzen
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
